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摘要

该方案的重点是定量分析嗜德维拉中的神经元树突状树突状树突状树突状的复杂性 (ndac), 可用于树突状形态发生的研究。

摘要

树突是神经元的分枝投射, 树突形态反映了神经系统发育过程中的突触组织。嗜酸菌幼虫神经元树突树化 (da) 是研究神经系统发育过程中神经树突形态发生和基因功能的理想模型。有四类大神经元。第四类是最复杂的, 有分支图案, 几乎覆盖幼虫体壁的整个区域。我们以前用四个参数描述了sox5的嗜酸性粒正无量表对 iv 类神经元树突树树状树突状树突状树突状复杂性 (ndac) 的影响: 树突长度、树突覆盖的表面积、分支的总数, 和分支结构。该协议介绍了 ndac 定量分析的工作流程, 包括幼虫解剖、共聚焦显微镜和利用 imagej 软件进行图像分析的过程。进一步洞察 da 神经元的发育及其潜在机制将提高对神经元功能的理解, 并提供有关神经和神经发育障碍的根本原因的线索。

引言

树突是神经元的分枝突起, 它覆盖的领域包括神经元从其他神经元1,2的感觉和突触输入。树突是突触形成的重要组成部分, 在整合突触输入以及在神经元中传播电化学刺激方面发挥着至关重要的作用。树突状树状树状树状化 (da) 是一个过程, 神经元通过这个过程形成新的树突树和分支, 形成新的突触。da 的发育和形态, 如分支密度和分组模式, 是多步骤生物过程的结果, 与神经元功能高度相关。该方案的目的是为五味子中神经元树突菌的复杂性的定量分析提供一种方法。

树突的复杂性决定了伙伴神经元的突触类型、连通性和输入。分枝模式和树突密度参与处理收敛到树突场 3,4的信号。树突在发展中具有调整的灵活性。例如, 突触信号对发育阶段和成熟神经系统的体感神经元的树突组织有影响.神经元连接的建立依赖于树突的形态发生和成熟。树突畸形与神经元功能受损有关。研究表明, da 神经元形态发生的异常可能会导致多种神经退行性疾病的病因, 包括阿尔茨海默氏症 (ad)、帕金森病 (pd)、亨廷顿病 (hd) 和卢格里格病/肌萎缩侧索硬化症 (als)6,7,8。突触改变出现在 ad 的早期阶段, 与神经元功能7,8的下降和损伤。然而, 枝晶病理学如何促进这些神经退行性疾病的发病机制的具体细节仍然是难以捉摸的。

树突的发育受编码复杂的调节剂网络的基因的调控, 例如 wnt系列的蛋白质 9、10、转录因子和细胞表面受体上的配体11,12.五丁子由四类组成 (i 类、ii 类、iv 类), 其中 iv 类神经元具有最复杂的分支模式, 并已被用作一个强大的实验系统, 以更好地理解形态发生 13, 14岁在早期形态发生过程中, iv 型神经元中基因的过度表达和 rnai 沉默导致分枝模式的改变和13节枝的修剪.开发一种实用的神经元树突状树状树状树状树状树状树状树状树状化定量分析方法具有重要意义。

我们以前已经证明, 沉默的 sox5, sox102f的嗜酸性粒细胞正畸, 导致短树突的 da 神经元和降低复杂性的 iv-da 15 类神经元。在这里, 我们提出了定量分析的程序, 神经树突树树突状树突状的复杂性 (ndac) 在五味子。该协议, 根据前面描述的方法, 提供了一个简短的方法来分析发展的大感觉神经元。它说明了在第三幼虫体壁 16、17、18、19 中的鲁棒图像标记和 da 神经元。这是一个有价值的协议, 研究 ndac 和发展差异的研究人员希望在体内。

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研究方案

1. 实验准备

  1. 制备以下试剂: dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (pbs);triton x-100;0.2% pbst (pbs + 0.2% triton x-100);32% 的甲醛 (pfa), 稀释成 4%, 使用前;有机硅弹性体基座及固化剂;防褪色安装介质 (例如, prolong gold);和指甲油。
  2. 准备以下设备: 解剖显微镜、两个锋利的钳子和一把用于显微解剖的剪刀、一些用于显微解剖的针脚、制作解剖盘的培养皿、显微镜幻灯片和覆盖物、共聚焦仪和计算机与斐济 imagej 软件安装。

2. 幼虫采集

  1. 配合 uas-sox102f-rnai 分别与 uas-gfp、ppk-gal4 或 w1118野生苍蝇飞行。养殖在25°c 的标准条件下飞行。
  2. 在 ~ 5-6天内, 收集 uas-sox102f-rnai/ppk-gal4、uas-gfp 或 uas-gfp 的第三幼虫, 并小心地使用钳子进行解剖。

3. 幼虫的解剖

注: 本节中的所有程序均在显微解剖显微镜下操作。放大倍率由调查人员决定。尝试调整到最佳的视觉视图。~ 4-6x 放大倍率的建议。

  1. 将幼虫放在由有机硅弹性体基座和组织培养培养皿制成的解剖盘上。
  2. 将幼虫口钩固定在一起, 让背侧朝上, 然后将幼虫的尾巴钉住。将背侧尽可能地放在中间, 以暴露中线, 这将是打开的标记。
  3. 在幼虫中加入200μl 的 pbs, 以保持身体水分。
  4. 用剪刀剪断两个气管之间的背线, 从尾端到左旋。在幼虫身体的四个角落中的每一个角落做一个小的切割。
  5. 在身体的四个角落都放一个别针, 这样身体就平了。
  6. 在室温下, 将幼虫体壁固定在 4% pfa 中25分钟。
  7. 在 pbst 中清洗 5分钟, 再重复两次。
  8. 从组织中取出针脚。然后将组织转移到玻璃滑块上, 用防褪色安装介质覆盖, 然后用盖板安装。空气干燥 1小时, 用指甲油密封边缘。

4. 图像处理

注: 图像是使用倒置共聚焦显微镜系统拍摄的。用户可以使用20x 目标 (推荐) 对样品进行拍照。

  1. 捕获 z 系列图像。打开共聚焦显微镜软件中的 "捕获 z 系列" 对话框。确定捕获 z 系列图像的范围。
    1. 点击 "顶部和底部" 按钮。确定顶部和底部位置, 并将值输入到 "底部:" 和 "顶部:" 框。将 "捕获 z 系列" 对话框中的 "步骤" 设置为0.5μm。然后点击 "立即运行" 按钮获取 z 系列图像。
  2. 将获得的图像另存为 *. tiff 或 *. nd2 文件。
  3. 成像后, 将幻灯片存放在4°c 的深色支架中。

5. 枝晶评价

注: gfp 蛋白在 uas-gfp 和 ppk-gal4 苍蝇中共同过度表达, 用于 gfp 荧光成像分析。对第三龄幼虫的大神经元的长度、分枝和结构进行了量化。分析参数包括树突长度 (μm)、表面积 (μm 2)、分支总数和分枝结构 (%)。图 1详细显示了分析参数。

  1. 树突的长度
    注: 树突的长度是在示踪剂插件中标记的所有树突的总和。
    1. 安装并运行斐济 imagej (https://fiji.sc/)20软件。然后将图像拆分为不同的通道, 如果有多个图像通道。
      注: 此协议中的图像只有一个 gfp 通道。
    2. 运行 "图像"堆栈z 项目 "以获得 z 投影;将出现一个名为 "z 投影" 的新窗口。单击投影类型的 "最大强度", 并根据个人喜好在起始切片和停止切片之间组织数字。点击 "确定"。z 投影图像将清晰地呈现枝晶投影。
    3. 追踪神经元
      1. 选择 "插件"分段简单的神经追踪 "在窗口中跟踪树突。找到神经元 soma, 然后单击从细胞体开始的树突上的一个点, 在这个树突顶端的另一个点。
        注: 程序将用蓝线连接这两个点。
      2. 如果路径清晰, 请在插件窗口中按 "y"; 如果路径清晰, 请按插件窗口中的 "y"。对枝晶路径进行跟踪, 直到可见图像中选定路径的终结点。点击同一插件窗口上的 "完整路径";段完成 (图 2)。
        注: 一些树突结束更远的起点, 其中路径被划分为较小的段。将这些段组合在一起, 为跟踪器提供完整的路径。
    4. 路径完成后, 返回到分支所在的新点。新的道路可以建立在上面;"所有路径" 窗口框将显示所有路径的长度值 (图 3)。保存跟踪文件, 并继续未完成的跟踪, 如图 2所示。
    5. 通过单击 "文件" 导出枝晶长度数据在 "插件" 窗口中导出为 *. cvs "。然后总结所有路径长度, 并将数据导出到数据分析电子表格软件。(图 3)。
  2. 达努隆的表面积
    1. 在 "斐济影像" 窗口中选择 "手绘绘图" 工具。跟踪路径, 然后连接终结点。从 "分析" 菜单中选择 "设置测量值"面积。点击 "分析" 菜单中的 "测量"。结果将显示在一个新框中, 其中选择了该区域的值 (图 4)。将其复制到数据分析软件。
  3. da 神经元的分支和分支结构的总数
    1. 通过打开 "分析", 然后 "渲染" 来计算分支的总数在跟踪的插件窗口中分析骨架化路径 "(图 5)。
      注: 乔木的结构是分支级别的总和。路径是在细胞体和树突尖端之间定义的, 一个路径可以包括多个分支, 例如主要的乔木是神经元细胞体的树突。次生乔木是来自初级的分支, 等等, 与三级, 第四纪, 和二元乔木。树突分枝的结构根据枝条的水平而分离。例如, 主要% 是分支的数量除以分支的总数, 依此类推。

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结果

在 gfp 荧光成像分析中, 用共过度表达的 gfp (uas-gfp; ppk-gal4) 标记了 da 神经元的树突, 用于 gfp 荧光成像分析。用倒置共聚焦显微镜对达神经元树突的形态进行了成像 (图 2)。

利用斐济 imagej 软件追踪了 da 神经元的树突。该文件用于估计枝晶长度 (图 3)。sox102f在 da 神经元 (nuct21) ...

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讨论

支配表皮的树突是神经元的输入区域, 它们的形态决定了单个神经元如何接收和处理信息。枝晶形态的发展反映了枝晶组织的基因调控。外周神经系统的山龙幼虫是研究树突发育的重要模型, 因为: 1) 与哺乳动物功能相似 11,12;2) 基于枝晶结构11、12 的四个类区别;3) 调节形态发生的遗传因素。在该协议中, ...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们要感谢威廉·艾默尔的成像技术援助。这项工作得到了治疗阿尔茨海默氏症基金 [r. e. t]、国家卫生研究所 [r01ag014713 和 r01mh60009 至 r. e. t。r03ar063271 和 r15eb019704 至 a. l.] 和国家科学基金会 [nsf1455613 至 a. l.]。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agentDow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Fingernail polish CVS72180
Stereo microscopeNikonSMZ800
Confocal microscopeNikonEclipse Ti-E
Petri dishFalcon353001
ForcepsDumont11255-20
Scissors Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
Insect Pins Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Microscope slides and cover slipsFisher Scientific15-188-52

参考文献

  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
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