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摘要

高频超声成像的胎儿小鼠有改进的影像分辨率, 可以提供精确的非侵入性的心脏发育和结构缺陷的特点。此处概述的协议旨在执行实时的胎儿小鼠超声心动图在体内。

摘要

先天性心脏缺损 (CHDs) 是儿童发病率和早期死亡的最常见病因。产前检测 CHDs 的潜在分子机制对于发明新的预防和治疗策略至关重要。突变小鼠模型是发现新机制和环境应激修饰剂的有力工具, 推动心脏发育及其在 CHDs 的潜在改变。然而, 建立这些假定的贡献者因果关系的努力仅限于非生存动物实验的组织学和分子研究, 其中监测关键的生理和血流动力学参数往往是缺席的。实时影像技术已成为建立 CHDs 病因的重要工具。特别是, 超声成像可以使用产前没有手术暴露胎儿, 允许保持他们的基线生理学, 同时监测环境压力对心脏室的血流动力学和结构方面的影响发展。在此, 我们使用高频超声 (30/45) 系统来检查胎儿在 E18.5子宫内在基线和应对产前缺氧暴露的小鼠心血管系统。实验表明, 该系统能测量心脏室大小、形态学、心室功能、胎心率和脐动脉血流指数, 并对其在子宫内暴露于系统性慢性缺氧的胎儿小鼠中的变化进行了分析, 并在实际中进行了研究。时间。

引言

先天性畸形的心脏是在早期心脏发育期间发生的异质结构缺陷。目前, 操作程序的技术进展使 CHDs1、2的婴儿存活率显著提高。然而, 生活质量经常被损害次要到长期住院和需要为分期的外科修理规程1,2,3,4,5。产前检测 CHDs 的基本分子机制是至关重要的, 以便计划早期干预, 实施新的预防战略, 并改善终生结局6,7。

虽然多重遗传和环境因素已牵连 CHDs 发病机制, 建立因果关系仍然是未满足的需要, 以改善诊断, 治疗和预防策略1,8,9 ,10,11,12。此外, 检查在子宫内应激因子和表观遗传修饰符的作用, 为将来的调查打开新的场所11,12。过去的十年确实见证了下一代测序技术的飞速发展, 包括单核苷酸多态基因芯片、全 exome 测序和全基因组甲基化研究, 它们在基因研究中的应用复杂的人类疾病的原因, 包括 CHDs1,8,9,10,11铺平了道路, 以确定新的突变和遗传变种尚未被在合适的动物模型中测试其致病性。

在不同的疾病模型系统中, 鼠标是选择的动物模型, 不仅用于 CHDs 早期 cardiogenesis 的调查机制13,14,15,16, 还要阐明其对产前和围产期应激因素对心室成熟和晚期妊娠功能的影响。因此, 在发育的早期和后期, 对突变胎鼠心脏的体内表型特征进行分析, 对于了解这些遗传变异和环境因素对心脏发育的作用至关重要, 并未来对小鼠室特异性成熟过程的潜在影响。

在开发过程中早期发现和准确诊断心脏缺损是干预计划的关键17,18。胎儿超声是安全、简单、便携和可重复的, 实际上已经成为临床心脏评估的标准影像技术。多普勒超声对胎儿循环的评价在临床实践中得到了广泛应用, 不仅用于检测心脏缺损, 而且能检测血管畸形、胎盘功能不全和宫内生长受限, 并评估胎儿的福祉, 以回应在子宫内侮辱包括低氧血症, 产妇疾病和药物毒性17,18。在评估人类缺陷和疾病的价值的同时, 超声对胎儿小鼠的评估在实验设置中得到了越来越大的效用19,20,21,22, 23。特别是, 胎儿心脏超声 (超声心动图) 允许连续在体内可视化的发展心脏。许多实验研究都采用超声成像技术观察转基因胎鼠的胎儿心血管发育。多普勒超声对于阐明病理生理学参数, 如在生理挑战或疾病条件下的胎儿循环中的流动模式特别有用10,19。在人类和动物中, 异常的血流或胎儿的氧气供应可能会因各种情况而导致胎儿环境在子宫内和影响 fetoplacental 轴, 包括胎盘异常, 产妇缺氧,妊娠期糖尿病和药学诱导的血管收缩15,22。因此, 建立标准化的方法来执行多普勒超声波对胎儿小鼠将极大地增强未来的研究 CHDs 通过促进监测流型和关键血流动力学指标的心血管回路在基因小鼠模型心脏发育的不同阶段.

高频超声已成为测量小鼠模型和人类疾病中心血管系统发育和生理参数的有力工具18。这项技术近年来得到了进一步的改进。我们和其他研究人员已经证明了该系统在胎儿小鼠心脏进行超高频超声研究的可行性15,19,20,21,22 ,23。该系统配备多普勒彩色流映射和线性阵列传感器, 产生二维, 动态图像在高频 (30 至50兆赫) 帧率。这些优势, 相比于低频超声系统和前一代高频超声21,22, 提供必要的灵敏度和分辨率, 以深入评估胎儿循环系统, 包括心脏结构的综合表征, 室功能, 以及胎儿小鼠在实验环境中的流动指标。在此, 我们概述了使用高频系统在胚胎日 E18.5体内进行体外循环和胎儿胎盘循环快速评估的方法。我们选择了一个30/45 兆赫传感器, 提供了大约60µm 的轴向分辨率和150µm 的横向分辨率。然而, 可以选择一种更高频率的传感器 (40/50 兆赫) 来分析早期的发育阶段, 方法是采用类似的方法。所选的 M 模式允许在高时间分辨率水平 (1000 帧/秒) 的运动中组织的可视化。最后, 我们证明了高超声对胎儿心血管血流动力学状态和功能的详细的综合表型描述的可行性在小鼠基线和应对产前缺氧应激。

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研究方案

加州大学洛杉矶分校动物保育和使用委员会批准了本议定书所示的所有程序。这项实验是在美国加利福尼亚州洛杉矶加州大学机构动物护理和使用委员会批准的活动动物协议下进行的一项持续研究的一部分进行的。动物处理和关心跟随指南的标准为实验室动物的关心和用途。

1. 高频超声成像系统的研制

  1. 打开超声波成像系统和生理学监测单元。
  2. 连接 30/45 MHz 传感器。
  3. 将相应的扫描头放置在成像平台附近的固定架上。
  4. 选择心脏测量程序选项。
  5. 将超声波凝胶倒置在其预热容器设置为37摄氏度。
  6. 确认适当的麻醉管道系统, 并验证氧和异氟醚的水平。
  7. 对成像平台和工作区域进行消毒。
  8. 设置成像平台的热电平, 以保持大坝的恒定体温和心率。

2. 孕鼠制剂

  1. 将怀孕的老鼠 (C57/BL6) 大坝放置在麻醉诱导室中。
  2. 使用连续提供的吸入异氟醚 (异氟醚 2%-3%) 与100% 氧 (100% O2) 混合, 在感应腔内以200毫升/分钟的流速诱导麻醉。
  3. 将镇静的动物转到仰卧位的成像平台上。
  4. 使用连接到麻醉油管系统的面罩提供稳态镇静--将异氟醚 (1.0%-1.5%) 与 100% O2混合在200毫升/分钟。
    注意: 使用装有炭过滤器的通风系统控制麻醉气体的泄漏。
  5. 应用电极凝胶后, 将四肢轻轻地贴在嵌入式心电图电极上, 以实现对产妇心脏和呼吸速率的恒定监测。
  6. 调整异氟醚的水平以维持平均心率 (450 +/-50 节拍/分钟 (bpm))。
  7. 保持体温在37.0 摄氏度 +/-0.5 摄氏度范围内。监测生理控制单元中显示的体温和心率。
  8. 在整个成像过程中每15分钟记录镇静鼠的生命体征。
  9. 评估麻醉的水平, 评估鼠标的姿势, 心率, 和脚趾捏的反应。
  10. 应用眼科药膏 (1 滴入每只眼睛), 以防止眼部干燥和角膜损伤。
  11. 使用脱毛霜, 以减少超声衰减, 将皮毛从中胸部水平移到下肢。1-1. 5 分钟后, 通过交替湿和干纱布湿巾, 以防止损害皮肤。

3. 胚胎识别

  1. 触及腹壁轻轻地找到胎儿并将其传播出去。
  2. 使用标记对大坝腹部的每个胚进行注释, 并定义它们的前后和背侧方向。
  3. 使用子宫颈的镇静剂水坝作为一个地标。将左侧和右侧子宫角上的胎儿标记为 L1、L2,L 3、等(左侧) 和 R1、R2、R3、等(右侧), 分别 (图 1A)。
    注意: 避免强行传播胎儿。1-2 个胎儿在每个垃圾可能重叠与其他, 使他们的定位和成像不可靠。从分析中排除这些胎儿。

4. 胎儿心脏的可视化和注释

  1. 将预预热的超声凝胶敷在腹部, 并仔细涂抹以避免气泡形成。在扫描成像区域添加额外的凝胶量。
  2. 将超声波探头放在其机械支架上, 并在使用扫描 B 模式 (图 1) 的同时, 在寻找跳动的心脏时, 逐步向皮肤进行接触。
  3. 单击扫描B 模式按钮以获取2维图像。使用膀胱作为标志, 以确定第一个胎儿定位在右侧或左子宫角, 并标记为 R1 或 L1, 分别。
  4. 通过在水平平面上移动成像平台, 实时确认单个胎儿的左右方向。从头部到尾部进行扫描, 以注释鼻、四肢和脊柱为地标 (图 1B, 视频 1)。
  5. 可视化跳动的心脏和注释左心室 (LV) 和右心室 (RV)。使用彩色多普勒模式优化心脏可视化 (图 1 C G, 视频 1-2)。
  6. 单击扫描B 模式按钮以获得胸骨旁短轴视图, 使 LV 和 RV 显示在数据获取帧中心的最大直径。启动实时映像 (图 1B-c)。
  7. 更改鼠标相对于扫描平面的方向, 以获得纵向四室视图 (图 1D)。首先, 确定心脏的其余结构, 如心房, 室隔膜, 左, 右流出大片。其次, 将心室和心房腔显示在其最大直径。然后开始图像采集。
  8. 从最终分析中排除非最佳的斜图像。单击Cini按钮可获得连续录制的 "Cineloops", 最低为十年代, 然后保存录制的图像。

5. 评估胎儿心率和心室功能

  1. 单击扫描M 模式按钮可从四腔平面 (视频 3) 获取心脏图像。
  2. 在所有胚胎的图像完成后, 查看记录的列表以进行分析。
  3. 从最终分析中排除非最佳的斜图像。
  4. 单击分析按钮以测量舒张壁厚度和左/右心室内径 (LVID, d;RVID, d) 和收缩 (LVID, s;RVID), 如图 2所示。
  5. 通过播放每个记录的 M 模式跟踪并计算一个流循环到以周期 ( 相邻峰值之间的间距 ) 来确定平均胎心率。
  6. 执行多个测量 (每次跟踪至少5个) 以获得平均心率 (图 2)。
  7. 在整个心脏循环中测量左心室内舒张直径 (LVID、d) 和左心室内径在终收缩 (LVID) 之间的时间变化。然后计算分数缩短百分比 (FS%), 如下所示: FS% = [(LVID, d-LVID, s)/LVID, d] x100。
  8. 执行多个测量 (每次跟踪至少5个) 以获得平均 FS% 值。

6. 评价心肺流动参数

  1. 在小于 60o的购置角度调整扇区。单击多普勒按钮, 通过使用45兆赫传感器, 从2维四室成像平面执行脉冲波多普勒测量。
    1. 首先, 可视化肺动脉的分岔, 以确定右流出道。接下来, 单击脉冲波多普勒按钮以获得通过肺和主动脉瓣 (图 3A, 视频 4) 的流模式。
  2. 从脉冲波多普勒追踪获得肺流量测量, 包括峰值收缩速度 (PkV)、加速度时间 (AT) 和弹射时间 (ET)。
  3. 执行多个测量 (每次跟踪至少5个) 以获得平均值测量, 如图 3A (右) 所示。
  4. 计算每个流出阀的正/ET 比, 作为流出道通畅和血流的指示器。
  5. 采用脉冲波多普勒方法, 从2维顶端四腔的角度进行二尖瓣和主动脉血流模式的提取。首先, 确定左心房和左心室室。其次, 将脉冲波多普勒样本量用于记录二尖瓣流入多普勒模式, 测量早期舒张速度 (E) 和心房收缩速度 (A) (图 3B)24,25。
  6. 调整多普勒样本量, 获得主动脉多普勒射流模式。使用主动脉多普勒射流跟踪测量加速度时间 (AT) 和弹射时间 (ET), 如图 3B (右) (视频 5)

7. 评估胎儿-胎盘轴

  1. 使用 45 MHz 传感器 (图 4A), 利用彩色多普勒扫描可视化子宫动脉和胎儿胎盘血管树。
  2. 当脐带从胎儿腹中流出后, 在脐带的羊膜腔内发现脐血管 (两条动脉和一条静脉)。
  3. 将脉冲波多普勒样本量用于获得脐动脉流模式 (图 4A)。
  4. 利用脉冲波多普勒扫描记录 (图 4B) 测量血管峰值流量参数, 包括加速度时间 (AT)、弹射时间 (ET) 和末端收缩 (PkV) 的峰值流速。
  5. 在没有胎儿运动和产妇呼吸运动的情况下, 在每艘船上连续获得5个波形, 以测量每条血管的平均峰值速度。
  6. 进入下一个胚胎。

8. 成像后动物监测

  1. 在成像过程完成后关闭异氟醚容器。
  2. 在恢复阶段继续监测体温、呼吸率和心率。
  3. 一旦大坝开始自发运动, 面罩和连接的油管系统就会被拆除。
  4. 将大坝返回适当的住房, 并根据标准的机构后程序协议继续进行观察。
  5. 记录正常活动完全恢复的时间。

9. 性能要求和技术考虑事项

  1. 将8胎儿的处理时间限制在大约1小时左右, 以避免长期麻醉对生命体征和生理参数的不良影响。
  2. 对8-10 只怀孕小鼠进行完整训练, 优化图像采集和短时间内的流型跟踪技术。

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结果

对心脏和血流动力学指标的统计分析离线进行。计算了3种最佳图像中连续5次测量的方法。这些数据被表示为 "平均" 电子扫描电镜. 学生的t测试用于推断团体比较。≤0.05 的P值被认为具有统计学意义。

根据上述协议, 我们的特点是长期暴露于产前缺氧对胎鼠晚期胎儿心血管状况的影响, 通过获得 C57/BL6 定时怀孕小?...

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讨论

心血管畸形和疾病在很大程度上受遗传因素和环境因素的影响19。我们以前已经表明, 孕产妇的热量限制, 开始在第二个月, 对胎儿胎盘循环流和胎儿心脏功能9的重大影响。

产前缺氧是胎儿发育过程中的另一个常见的压力因子, 可能会极大地影响胎儿-胎盘生理和循环系统。在冠心病导致围产儿适应产后生活的情况下, 产前缺氧暴露的影响可能...

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披露声明

没有宣布利益冲突。

致谢

我们感谢动物生理学核心, 在加州大学洛杉矶分校分子医学分部提供技术支持和开放进入 Vevo 2100 超声生物显微镜观察 (显微镜) 系统。这项研究得到了 NIH/儿童健康研究中心 (5K12HD034610/K12)、加州大学洛杉矶分校-儿童发现研究所和今天和明天儿童基金会的支持, 以及大卫-医学院研究创新奖给 m. 董诚康。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Vevo 2100VisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaN/AHigh Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6)Charles River LaboratoriesN/AInbread wild type mouse strain

参考文献

  1. Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36(2017).
  2. Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
  3. Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
  4. Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
  5. Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection? Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (10), 664-672 (2013).
  6. Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140 (6), For the Pediatric Heart Network Investigators 1245-1250 (2010).
  7. Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57 (8), 402-413 (2014).
  8. Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
  9. Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
  10. LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9 (4), 320-329 (2016).
  11. Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498 (7453), 220-223 (2016).
  12. Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128 (5), 1116-1125 (2016).
  13. Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127 (6), 1101-1104 (2006).
  14. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
  15. Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157 (10), 4041-4054 (2016).
  16. Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
  17. Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72 (1), 54-61 (2017).
  18. He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71 (6), 699-708 (2016).
  19. Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116 (2 Pt 1), 316-322 (2016).
  20. Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
  21. Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416(2013).
  22. Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46 (16), 602-614 (2014).
  23. Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22 (12), 1649-1655 (2015).
  24. Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10 (2), 73-85 (2010).
  25. Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33 (11), 1167-1173 (2010).

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