舌细胞外基质的制备与舌鳞癌体外重建

摘要

给出了一种有效去细胞的舌胞外基质 (TEM) 的制备方法。透射电镜可作为功能性支架, 用于在静态或搅拌培养条件下重建舌鳞癌 (TSCC) 模型。

摘要

为了构建一种有效的、逼真的舌鳞癌 (TSCC) 模型, 建立了瓣膜舌细胞外基质 (TEM), 为 TSCC 的构建提供了功能性支架。TEM 为细胞生长、分化和细胞迁移提供了体外小生境。本机细胞外基质 (ECM) 的显微结构和瓣膜基质中保留的生化成分为锚固细胞提供组织特异的龛位。经脱氧核糖核酸酶 (DNase) 消化, 同时具有严重的有机或无机预处理, 可实现透射电镜的制备。该协议易于操作, 并确保了去细胞的高效率。透射电镜显示, 在静态或搅拌培养条件下, TSCC 细胞具有良好的细胞相容性, 使 TSCC 模型得以构建。自制的生物反应器也用于细胞培养的持续搅拌条件。应用 TEM 重建 TSCC 显示了类似临床 TSCC 组织病理学的特点和性质, 提示 TSCC 研究的潜力。

引言

舌有多种重要功能, 如吞咽、发音和味觉。因此, 舌功能的损害对患者的生活质量有很大的影响¹。口腔内最常见的恶性肿瘤是舌鳞状细胞癌 (TSCC), 通常发生在饮酒或吸烟²的人身上。

近年来, TSCC 的基础研究取得了很小的进展。缺乏有效的体外研究模式仍然是最大的问题之一。因此, 细胞外基质 (ECM) 结果是一个潜在的解决方案。由于 ecm 是由高度组织的矩阵元件组成的复杂网络框架, 因此具有 ecm 类结构和成分的脚手架材料将胜任癌症研究。瓣膜 ecm 能够完美地为细胞从同一来源的体外提供利基, 这是 ecm 最显著的优势。

ECM 可以通过去细胞使用洗涤剂和酶将细胞成分从组织中去除。各种 ECM 组件, 包括胶原蛋白、纤连蛋白和瓣膜基质层粘连蛋白, 为培养细胞提供了一种类似于组织的微环境, 促进了细胞的存活、增殖和分化³。此外, 在 ECM 中缺乏细胞成分的情况下, 移植的免疫原性可降至最低水平。

到目前为止, 瓣膜 ECM 的制备方法已经尝试了不同的组织和器官, 如心脏^4,5,6,7, 肝^{8,9,10 ,11}, 肺^{12,13,14,15,16},¹⁷, 和肾脏^18,19,20. 然而, 在我们最了解的情况下, 没有就舌头上的类似工作找到相关的研究。

在本研究中, 瓣膜舌外基质 (TEM) 是通过一系列物理、化学和酶处理, 高效、廉价地制备出来的。然后用透射电镜对体外TSCC 进行了重述, 对 TSCC 的行为和发育进行了适当的模拟。tem 具有良好的生物相容性以及引导细胞到组织特异性的能力, 这表明 tem 在 TSCC 研究³中可能具有很大的潜力。此处显示的协议为研究 TSCC 的发病机制或临床治疗的研究者提供了选择。

研究方案

所有动物工作都是按照《动物福利法》、《机构指南》和中山大学动物保育和使用委员会批准的。

1. 制备 TEM

1. 用不育的手术剪刀和镊子来执行小鼠颈椎脱位并去除舌头。
2. 浸泡在75% 乙醇3分钟的舌头, 然后把每一个舌头到1.5 毫升离心 (EP) 管与1毫升的10毫米无菌磷酸盐缓冲溶液 (PBS)。
   注意: PBS 在以下所有步骤中的浓度与此步骤中的浓度相同。
3. 冷冻解冻细胞裂解: 将 EP 管中的舌头冻成-80 摄氏度, 1 小时, 然后在室温下将舌头解冻45分钟3圈。
4. 用手术针将每条舌头装入手术缝合线上, 用一小块不育的锡纸包裹缝合的末端。在不育条件下, 在含有75% 乙醇的3.5 厘米或6厘米培养皿中进行操作。
   注: 每个手术缝合的适当长度约为20厘米, 每块锡纸的适当尺寸约为0.3 厘米² (1 厘米 x 0.3 厘米)。舌头应该装在锡纸附近。
5. 三十年代用3.5 厘米或6厘米培养皿冲洗每舌3毫升的无菌 PBS. 在无菌条件下执行此操作。
6. 用超纯水冲洗舌头: 将 ampicilin 放入一个宽口瓶中, 250 毫升的无菌超纯水, 最终浓度为90µg/毫升。把舌头放进装有搅拌棒的瓶子里。拧紧瓶盖, 部分缝线留在瓶子外。在无菌条件下执行此操作。
   注: 可将多达5种舌头放入同一瓶中, 考虑缠绕缝线。锡纸在瓶子的缝合端, 以防止舌头滑脱。舌头应该被放置 2 cm 高从瓶子的底部, 调整长度的缝合留在瓶子内。此注释还用于步骤1.8、1.10、1.12 和1.16。
7. 把瓶子放在磁力搅拌器上12小时。
8. 用氯化钠冲洗舌头: 将 ampicilin 添加到一个宽口瓶中, 250 毫升无菌1米氯化钠, 最终浓度为90µg/毫升。把舌头和搅拌棒放进瓶子里。拧紧瓶盖, 部分缝线留在瓶子外。在无菌条件下执行此操作。
9. 把瓶子放在磁力搅拌器上24小时。
10. 细胞裂解的海卫 X-100: 添加 ampicilin 到最后浓度的90µg/毫升成一个宽口瓶与250毫升无菌2% 海卫 X-100 在 PBS。把舌头和搅拌棒放进瓶子里。拧紧瓶盖, 部分缝线留在瓶子外。在无菌条件下执行此操作。
11. 把瓶子放在磁力搅拌器上48小时。
12. 洗舌头与 CaCl₂/氯化镁₂: 添加 ampicilin 到一个宽口瓶与250毫升无菌5毫米 CaCl₂/氯化镁₂到最后浓度90µg/毫升。把舌头和搅拌棒放进瓶子里。拧紧瓶盖, 部分缝线留在瓶子外。在无菌条件下执行此操作。
13. 把瓶子放在磁力搅拌器上24小时。
14. DNase 消化: 添加1毫升的汉克平衡盐溶液 (HBSS) 到每个 EP 管。将 DNase 分别添加到 HBSS 中, 最终浓度为300µM. 将每一舌移入每个 EP 管, 并将部分缝合到管外。在无菌条件下执行此操作。
    注: 在本步骤中, 确保保留在瓶子内的缝合部分也留在 ep 管内, 并确保在前一步骤中保持在瓶外的缝合部分也保持在本步骤的 ep 管之外。
15. 在37摄氏度的 EP 管中孵育舌头24小时。
16. 用 pbs 冲洗舌头: 将 ampicilin 加入250毫升无菌 pbs 的宽口瓶中, 最终浓度为90µg/毫升。把舌头和搅拌棒放进瓶子里。拧紧瓶盖, 部分缝线留在瓶子外。在无菌条件下执行此操作。
17. 把瓶子放在磁力搅拌器上24小时。
18. 将所制备的 TEM 在无菌 PBS 中贮存4摄氏度, 直至使用。

2. 三维 (3D) TSCC 的重建

1. 静态 TSCC 模型构造
   1. 种子 1.0 x 10⁶单 TSCC 细胞 (Cal27) 成3.5 厘米培养皿。添加3毫升的 Dulbecco 的改良鹰的 medium/F12 (DF12), 含有10% 胎牛血清 (血清), 90 µg/毫升 ampicilin, 90 µg/毫升卡那霉素。
   2. 培养的 Cal27 细胞在37°c 2 至3天。确保细胞覆盖至少60% 区域的盘子底部。
   3. 将透射电镜加载到培养皿中的 Cal27 单层上。
   4. 在37摄氏度的28天内, 将盘子放入 CO₂孵化器中。
   5. 在细胞培养过程中每天刷新培养基。在孵化器中的 CO₂浓度是5%。
2. 搅拌 TSCC 模型施工
   1. 自制搅拌 minibioreactor 的研制
      1. 从10毫升注射器中取出柱塞。
      2. 在杆的下端附近挖一个孔 (直径1厘米), 并在孔中装入搅拌杆。
      3. 在塑料宽口瓶的瓶盖中央挖一个孔 (直径0.5 厘米), 并将活塞杆穿过瓶盖。
      4. 切割50毫升离心管的一半, 并将其焊接在瓶盖的外侧。
      5. 通过将拉杆与与鱼钩相连的钓线包裹起来, 将鱼钩连接到拉杆上。
         注: 最多可连接4鱼钩杆。
      6. 在使用前先将自制的复合釜压蒸。
         注: 请勿蒸压塑料宽口瓶。在培养细胞时使用新的无菌塑料宽口瓶。
3. 动态细胞培养
   1. 种子 1.0 x 10⁶单 Cal27 细胞在自制的 minibioreactor。添加150毫升的 DF12 培养基, 其中含有10% 的血清, 90 µg/毫升 ampicilin, 90 µg/毫升卡那霉素。
   2. 使用连接到杆上的鱼钩将 TEM 加载到 minibioreactor 上。
   3. 拧紧瓶盖, 将 minibioreactor 放在磁力搅拌器上。激活 minibioreactor 在 200 rpm 在 CO₂孵化器在37°c 7 到14天。
      注: co₂孵化器中 co₂的浓度为5%。

结果

本议定书的编写 TEM 证明是有效和适当的。与母语组织相比, 透射电镜显示出完美的去细胞。去细胞的疗效经苏木精-伊红染色 (图 1A B) 证实。he 染色结果显示透射电镜核染色完全消失 (图 1B)。此外, 从先前的工作中 dna 含量的量化表明, dna 几乎完全从 TEM³中去除。该协议在去除细胞成分?...

讨论

一个完善的瓣膜 ecm 制造协议应保留本机 ecm 成分, 同时去除组织中的细胞成分几乎完全²¹。尽管目前报告的去细胞协议需要通过血管灌流来去除蜂窝材料通过对流运输, 这里采用了机械搅拌, 称为传统的简单和廉价的方法^{22,23,24,25,26}. 此外, 由于舌头富含 lingual...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57-BL/6J mice	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-2.5L
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218
Potassium chloride	Sangon Biotech	A100395
Dibasic Sodium Phosphate	Guangzhou Chemical Reagent Factory	BE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic	Sangon Biotech	A501211
1.5 mL EP tube	Axygen	MCT-150-A
Ultra-low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	153066
6 cm cell culture dish	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	746495
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	449164
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Magnesium sulphate	Sangon Biotech	A601988
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393
Kanamycin	Sigma-Aldrich	PHR1487
Surgical suture	Shanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottle	SHUNIU	1407
Magnetic stirrer	AS ONE	1-4602-32
CO2 incubator	SHEL LAB	SCO5A
10 mL syringe	Hunan Pingan
50 mL centrifuge tube	Greiner	227270
Cal27 cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Tongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Human osteosarcoma cell line
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Hepes free acid	BBI	A600264
FBS	Hyclone	SH30084.03
4 °C fridge	Haier
Water purifier	ELGA
Hemocytometer	BLAU	717805