由激光蚀刻大师定制的组织培养模具

摘要

在此, 我们提出了一个快速, 简便, 低成本的方法, 以制造定制的烷模具, 可用于生产水凝胶为基础的工程组织复杂的几何。我们还描述了机械和组织学评估的结果, 对使用这种技术生产的工程心脏组织进行了研究。

摘要

随着组织工程领域的不断成熟, 对各种组织参数 (包括组织形态) 的兴趣也越来越大。在千分尺上操作组织形状可以直接对细胞进行排列, 改变有效的机械性能, 并解决与养分扩散有关的限制。此外, 制备组织的容器可以对组织施加机械约束, 导致应力场, 从而进一步影响细胞和基质结构。具有高度可重现性的形状组织还具有用于体外检测的实用程序, 其中样本维度至关重要, 例如整个组织机械分析。

本手稿描述了利用激光蚀刻丙烯酸制备的负主模的替代制造方法: 这些模具与烷的性能良好, 允许设计厘米刻度和特征的尺寸尺寸小于25µm, 可快速设计和制造的低成本和最低的专业知识。最低的时间和成本要求, 使激光蚀刻模具被迅速地重复, 直到一个优化的设计是确定的, 并易于适应, 以适应任何兴趣的检测, 包括那些超出组织工程领域。

引言

在过去的两年中, 软光刻被广泛地用作一种制造技术来支持科学研究, 特别是在微流体、材料研究和组织工程领域, 1, 2, ³。复制成型, 其中一个对象具有一个理想的形状是由负主模创建, 提供了一个方便和低成本的方法, 生产积极的, 可用于铸造成型水凝胶。但是, 所需的负主模具通常是使用昂贵、耗时、尺寸有限的微细加工技术生产的, 需要干净的房间空间和精良的设备。虽然3D 打印提供了一种潜在的替代方案, 但由于低成本打印机的分辨率限制以及常见的3D 打印机聚合物和可抑制固化的聚硅烷之间的化学作用, 它的实用性受到了一定的限制。

激光切割和蚀刻材料, 如塑料, 木材, 玻璃和金属的切割系统最近变得大大降低成本, 因此更容易为制造研究工具。商用级激光切割机能够制造厘米刻度上的物体, 其最小特性小于25µm, 而且还需要最少的训练、专门知识和使用时间。在微流体设备的制造过程中, 对其进行了激光消融, 但据我们所知, 没有手稿描述了从激光切割负主模具中可以制造毫米和厘米级模的工艺 4.

我们使用这一技术主要是为了改善营养扩散, 细胞对齐, 和机械性能^5,6,7, 以控制工程组织的形状。然而, 这种技术的通用性允许在任何领域使用模压水凝胶感兴趣, 如药物输送和材料科学研究⁸。利用激光切割机, 可对几乎任何几何无悬垂 (这将抑制去除没有一个多部分的模具, 这是超出本手稿的范围), 并适合在激光床的尺寸。

研究方案

1. 创建矢量格式主模具设计

1. 使用矢量图形程序将所需的模具几何组合成矢量格式 (请参阅材料、设备和软件表)。选择文件 |新建并创建具有 RGB 颜色格式的适当维度画布。使用左侧面板中的形状工具创建所需的几何图形: 在窗口顶部输入所需尺寸 (单击顶部的变换按钮 (如果不是最初可见), 精确定义形状大小。
   注: 模具几何应允许至少6毫米的边界之间的最外层的特征和切割线, 以允许修剪后, 在模具铸造的半月板。这将使成品模具奠定冲洗与底部的文化菜肴。此外, 模具几何应考虑与将使用的激光切割机模型相关的限制, 包括切口宽度和最小特征尺寸。此处描述的工作所用的激光 (参见材料、设备和软件表) 具有0.2 毫米切缝宽度和最小蚀刻特征尺寸25µm (最大 DPI 为 1000)。模具尺寸可以选择, 以适应所需的养殖容器, 如10厘米菜, 或6或24井板。
2. 打开窗口左上角的拾色器, 并定义与激光切割软件兼容的新颜色色板。
   注: 我们使用红色 (rgb 255, 0, 0) 为切割和蓝色 (rgb 0, 0, 255) 蚀刻。可以根据设计要求定义其他色板 (例如, 如果需要多个蚀刻深度)。
   1. 通过选择路径, 然后为颜色选取器中的填充颜色选择路径颜色和[无]的剪切色板, 将这些色板颜色分配给裁剪路径。
3. 同样, 通过选择对象, 然后为颜色选取器中的路径颜色选择填充颜色和[无]的蚀刻路径, 将色板颜色分配给蚀刻路径。
4. 将设计保存为 either.ai 或. pdf 文件格式, 具体取决于矢量图形程序和激光切割器兼容性 (图 1A和辅助文件)。

2. 激光切割丙烯酸主模具

1. 选择负主模具材料。
   注: 季度英寸厚的丙烯酸是非常适合这个应用, 因为它的兼容性与激光切割, 相对较低的成本, 和厚度, 使功能高达5.5 毫米的高度。但是, 其他满足以下要求的材料也可以使用: (i) 非反应性与二甲基硅烷固化;(二) 不含多孔/强粘接剂;(iii) 用激光切割机清洁和蚀刻;(iv) 保持玻璃的状态高达60摄氏度;(v) 与所需的最大特征高度兼容的厚度。
2. 根据制造商的规格, 准备激光切割机。确保使用足够的通风, 并将床高正确地校准到所选的负主模材料的厚度。
3. 在连接到激光切割机的计算机上的矢量图形程序中打开设计文件, 然后单击文件 |打印。确保将激光切割器设置为打印机, 并在缩放下拉菜单中选中 "不缩放", 以防止在单击打印对话框底部的 "打印" 按钮之前对设计进行失真。
4. 在激光切割机打印实用程序中, 单击右下角的设置按钮。将每英寸 (PPI) 设置的功率、速度和脉冲分配给以前选择的所有颜色, 以便为所有设计功能设置剪切/蚀刻参数。
   注: 在这里, 激光切割机配备了 75 W 激光 (见材料, 设备和软件表), 使用以下设置: 100% 功率, 1% 速度, 1000 PPI 削减通过¼ "丙烯酸;100% 功率, 8% 速度和 500 PPI 蚀刻在丙烯酸的深度2.75 毫米;和100% 功率, 5% 速度, 500 PPI 蚀刻的深度3.50 毫米丙烯酸。如果激光切割器的配置或材料未知, 这些参数可以通过试用和错误的测试来确定。
5. 单击激光切割软件中的大绿色按钮, 对激光蚀刻和切割负主模具。
6. 通过去除小刷子和/或压缩空气中的残余切割碎片, 准备用于注塑的负主模具 (图 1B)。

3. 为细胞或组织培养制备注塑模

1. 根据生产厂家的规格, 准备一份公司的铸件组合。准备0.35 毫升/cm²的主模具;这将根据模具的特点和高度而异。
2. 在一个真空室连接到标准实验室真空线 (< 500 mmHg) 1 小时, 或者直到所有的气泡都被消除后, 将准备好的。
3. 用乙烯基或屏蔽胶带将模具的外边缘胶带 (彩色标签胶带工作良好), 使胶带延伸 > 3 毫米以上的负主模具蚀刻表面。将胶带牢固地压在模具侧面, 以防以后漏水。
   注: 如果丙烯酸主模具具有通孔功能, 则可能需要将胶带应用到模具的底部 (图 1C)。
4. 在负主模的蚀刻面上倒脱气。
   注: 靶材的厚度将取决于应用, 虽然厚的注塑模具底部可以使成像挑战。最小厚度为 ~ 1.5 毫米在成像考虑和容易去除模子之间的一个好平衡。
5. 将所涂覆的负主模放入真空室, 再加气为1小时, 或直至所有气泡被消除。
6. 将脱气的负主模放入60摄氏度烤箱中, 至少要6小时的固化. 确保烤箱的货架水平。另外, 允许在37°c 过夜, 或在室温下治疗72小时。
7. 如果在同一负主模具上铸造多个模具, 则使用剃刀将这些模具分开, 而它们仍在负主模具上。然后, 剥离每一个注塑模具的负主模具。确保在收集过程中, 对注塑模具进行缓慢而仔细的收集, 以防止模具功能撕裂。
8. 使用剃刀刀片, 修剪的区域与半月板从铸件, 这将防止霉菌从说谎平, 以及任何多余的材料或碎片 (图 1D)。
9. 如有必要, 准备热处理的细胞/组织铸造模具。

4. 铸造胶原蛋白和纤维蛋白凝胶组织

注: 使用适当的无菌程序来维持不孕。

1. 将模具粘附在所需容器的底部。将新模具粘附在非组织培养板的底部, 通过对未经处理的塑料进行牢固的压铸模 (由于其憎水性)。
   注: 但是, 如果要使用组织培养处理聚碳酸酯, 或在重新使用的模具, 这往往坚持不牢固, 天然或合成胶水 (如纤维蛋白或硅胶密封胶过夜) 可用于确保附件。
2. 准备纤维蛋白原, 凝血酶, 中和的胶原蛋白铸造溶液, 使每一个期望的浓度将达到在石膏组织。把胶原蛋白放在冰上直到铸造。
   注: 纤维蛋白原和凝血酶不应被允许混合, 直到紧接铸造之前。如有必要, 纤维蛋白原和凝血酶溶液也可以冷冻, 以增加聚合时间。我们使用了一个最终的纤维蛋白原浓度在0-8 毫克/毫升, 最终凝血酶浓度在 10-100 U/毫升, 和最终胶原浓度之间 0.8-2.0 毫克/毫升 (图 2)。对于工程的心脏组织, 我们经常使用心肌细胞在 12 x 10⁶单元/毫升与1.6 毫克/毫升, 4 毫克/毫升纤维蛋白原, 20 U/毫升凝血酶 (凝血酶是立即添加在铸造之前)。优选的集中 (甚而在这些建议的范围外面) 应该经验主义地被确定。
3. 按照标准协议和并用重悬在适当浓度下收获细胞, 以达到所需的初始细胞密度。
   注: 人类诱导的多潜能干细胞衍生心肌细胞的收获, 如联et 等。⁹将收获的细胞保存在冰上。细胞体积应在准备细胞悬浮时占去。我们使用的细胞浓度范围从 9-18 x 10⁶细胞/mL, 虽然最佳范围预计会随细胞数量而变化 (图 2)。
4. 结合纤维蛋白原, 中和胶原蛋白, 细胞悬浮 (见步骤4.2 的例子), 以创建一个铸件组合。把铸件拌在冰上。
   注: 纤维蛋白原和凝血酶的温度和浓度将决定聚合动力学;为了防止浇铸过程中的聚合, 可能需要根据将要铸造的结构的数量和体积来准备不同批次的铸件组合。
5. 对待将暴露在铸件混合的模具表面, 以减轻其疏水性 (聚硅烷憎水性将增加蛋白质吸附, 使铸造困难)。
   1. 通过氧等离子体处理, 如手持高频发生器 (例如, 从利顿工程 BD-20A), 实现亲水性表面改性。将接触细胞/凝胶混合物的模具表面暴露在 3-5 s 的等离子处理中, 铸造前约5分钟。
   2. 或者用表面活性剂处理, 如 Pluronic F-127 (1% 瓦特/v)¹⁰。尽可能接近铸件的表面处理, 因为极性的变化会随着时间的推移而恶化。
6. 在浇铸之前, 将凝血酶添加到铸件组合中, 并在不引入气泡的情况下吹打上下混合。
7. 快速工作, 将铸件混合到模具中, 用小心将混合料存入模具的所有角落和缝隙。避免在第一站以外的吸管喷射, 以防止结构内的气泡形成。
8. 重复步骤4.6 和 4.7, 必要的任何额外批次的铸件组合。
9. 将组织培养容器放置在37摄氏度孵化器中, 45 分钟。如果孵化器没有很好的加湿, 在孵化前先在霉菌周围沉积细胞介质, 以防止结构脱水。
   注: 细胞培养基的类型将取决于细胞类型, 但对于工程的心脏组织结构, 我们使用 RPMI 1640 + B27 补充。
10. 45分钟后, 将结构返回到罩盖, 并在返回孵化器之前用细胞介质盖住。
11. 根据单元格和构造类型的需要, 每 48-72 小时更改单元格介质。
    注意: 应根据供应商提供的建议说明进行媒体更改, 以确保最大的细胞健康。更改介质时要小心, 以免干扰构造。我们没有遇到构造浮动的问题, 但如果发生这种情况, 可以通过将高职位添加到超出媒体级别的模具设计中来防止。
12. 使用后, 用10% 漂白剂、70% 乙醇和蒸馏水依次冲洗模具。然后空气干燥, 和高压釜再使用高达10倍。

5. 分析技术: 组织压实

注: 由于基质重塑而造成的压实是组织生存能力和发展的指标, 可以通过光学显微镜和图像分析方便地测量。

1. 收集在模具中的结构的光学显微图像的时间增量范围从2小时到96小时后铸件。
   注: 由于所需的放大倍数较低, 用摄像机安装的解剖显微镜非常适合这个应用。
2. 在图像分析套件中跟踪可见构造区域, 如 ImageJ (开源、ImageJ、nih/ij/)。
3. 分析压缩的速率和最终程度 (图 2)。

6. 分析技术: 拉伸试验

注: 活动力学 (因细胞活动而产生的力或应变) 和被动力学 (在响应应用菌株或力时产生的力或应变) 是许多工程化的关键功能特性。组织, 这是特别适用于工程的心脏组织。用于分析的微机械分析仪在材料表中进行了说明。其他机械测试装置也可以类似地应用, 假设它们允许进行水合测试, 并且能够进行长度控制, 并能对范围和与组织有关的分辨率进行强制测量。对于有横截面积的组织, 按单平方毫米和刚度的顺序排列, 5 锰负荷电池是一个很好的配合。更大更硬的材料需要更大的负载单元。在测试之前, 确保对力传感器和长度控制器进行正确的校准。

1. 打开长度控制器、力传感器、脉冲发生器和温度控制器。
2. 用 Tyrode 溶液填充机械测试槽 (1.8 毫米氯化钙, 1.0 毫米氯化镁, 5.4 毫米氯化钾, 140 毫米氯化钠, 0.33 毫米磷酸钠, 10 毫米 HEPES, 5 毫米葡萄糖 ddH₂O, pH 值调整为 7.4)工程心脏组织。调整热电偶, 使浴缸温度达到37摄氏度。
3. 加载用于收集活动收缩数据的机械测试协议。
   注: 我们已经评估了有源收缩力学使用长度步长协议, 其中5% 应变增量的长度步骤为120s 举行, 以评估应变对收缩力的影响 (图 3A)。此外, 我们还通过一个拉-断协议来评估无源机械性能, 其恒定应变率为10% 应变/分钟 (图 3B)。这两种协议都可以作为主动和被动机械分析的良好起点。
4. 在解剖范围内, 小心地将工程组织结构从其上分离出来, 使其自由浮动。
   注: 经过组织压实的 Cellularized 结构很可能已经与内部模具表面分离, 在这种情况下, 需要进行最少的操作。
   1. 如果压实没有导致构造释放, 使用镊子轻轻地将结构从模具的两侧和底部分开, 以避免损坏组织。
5. 使用镊子, 轻轻地拾起结构和转移到机械测试浴。
6. 通过解剖显微镜查看构造, 将构造的任何一端安装到附加到力传感器和拉杆臂的挂钩上。
7. 使用机器人调整拉杆臂位置, 直到构造没有施加应变。零长度控制器和力控制器。
8. 通过解剖范围对构造进行图像处理, 使构造的尺寸可以通过图像分析来测量。
9. 启动活动强制协议, 并在协议完成后保存收集的数据 (图 3)。
10. 如果需要被动的机械数据, 再调整杠杆臂, 直到有零的应用应变。在加载和启动被动力学协议 (图 3) 之前, 先将长度和强制控制器和图像再进行一次。保存收集的数据。

7. 分析技术: 石蜡组织学和免疫组化

注意: 我们已经取得了最大的成功, 在成像工程组织切片使用石蜡块, 使组织形态学最好保存。该过程的所有步骤必须仔细考虑和量身定做的组织, 包括处理样品无真空或压力, 经验主义地确定适当的抗原检索方法, 并滴定的主要抗体浓度。其他技术 (如使用冻结块来准备幻灯片) 可能需要较少的时间和费用, 同时根据预期的应用程序产生足够的结果。

1. 在解剖范围内, 小心地将工程组织结构从该模型中分离出来, 使用钳夹在结构之间滑动, 并将其轻轻地分开, 使其自由浮动。将这些构造转移到离心管内进行固定。
   注: 在模具本身所提供的静应力条件下, 易碎构造或固定在模具中的, 可通过在培养井中改变溶液, 并在固定后将结构从模具中除去而固定在模子中。
2. 在室温下将4% 多聚甲醛 (PF) 浸没10分钟, 立即修复工程组织。估计不超过1小时每1毫米的组织厚度;不要过度修复。
3. 用磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 冲洗组织。
4. 保持组织湿润, 在其上放置一滴的红色, 以染成粉红色的10三十年代, 然后用70% 乙醇冲洗。
   注意: 粉红色的颜色有助于识别它在石蜡块中切片后, 将被洗走在 deparaffinization。
5. 将组织用透镜纸包裹在组织学盒中。在磁带上使用泡沫垫, 以保持组织扁平。
6. 将卡带浸入70% 乙醇, 储存在4摄氏度, 直到准备石蜡处理。
7. 在增加乙醇浓度 (2 x 30 分钟, 每 70, 95 和 100%) 的情况下, 对组织进行脱水处理。然后在三连续二甲苯浴中沐浴样品, 每30分钟。
8. 将样品浸泡在三连续的石蜡浴中, 每30分钟。
9. 预热盒式磁带, 仔细地展开并去除镜片纸上的红红染色组织, 并将石蜡渗入的组织嵌入石蜡块中。小心把样品平放在模具的底部, 以使切片更容易。
10. 根据所需的切片 (5-8 µm 厚) 和染色, 使用为工程组织优化的标准程序 (图 4) 切片组织。
    注: 石蜡切片的一种替代方法是使用冰冻块, 尽管样品的形貌可能受到损害。将固定结构放置在 PBS 中的30% 蔗糖中3小时, 或直到标本平衡 (例如, 隔夜)。用 50/50 v/v 30% 蔗糖和最佳切削温度 (OCT) 冷冻介质交换溶液 1 h. 用70% 乙醇, 用干冰泥浆在塑料托盘中快速冻结, 将建筑与 OCT 冻结介质放置在冻结块中。部分块与恒温器到 10-50 µm 厚的部分。

8. 分析技术: 细胞对齐

注意: 操纵组织形态和内部应力场可以调节细胞对齐, 这是许多本地组织的一个定义特征。

1. 在有兴趣的几何形状的注塑模中准备工程组织结构。
2. 在养殖期结束时, 在 PBS 中洗涤构造, 固定在 4% PF (见步骤 7.2) 和收获构造, 以准备切片和组织学成像 (见7节) 或整个安装染色。
   注: 整个安装染色遵循类似的步骤, 组织学/免疫组化, 但需要更长的潜伏期, 和渗透深度的染料, 抗体, 和任何成像技术 (如光穿透深度进入构造) 将需要在经验上确定的结构组成。
3. 在水平平面 (平行于模具底部的平面) 上放置组织部分, 并为感兴趣的单元格标记着色。使用 f 肌动蛋白标签, 如罗丹明, 以标记肌动蛋白应力纤维的大多数细胞类型。或者, 使用特定于单元格的标记。
   注: 在工程心脏组织的情况下, 定位是由肌节染色的α actinin。
4. 手动或使用分析工具 (例如、ImageJ、MATLAB) 评估感兴趣区域中所有单元格或原子核的主轴。
   注意: 对同一构造的不同区域进行分类可能很有用, 具体取决于几何图形 (如网格几何中的 "节点" 和 "捆绑" 区域), 或圆形几何图形中的 "核心" 和 "边缘"。

结果

激光切割机的光学将导致蚀刻区域有非常轻微减少的尺寸, 因为蚀刻深度增加, 并导致模具墙与一个非常微妙的斜角, 由于激光束的渐狭。这将有助于去除铸造的注塑模, 但应仔细考虑, 如果非常深刻蚀刻负主模具 (> 6 毫米) 是必需的 (图 1)。

随着时间的推移, cellularized 结构将会因基体重塑而紧凑, 尽管这种?...

讨论

定制的与组织培养相适应的注塑模几何图形在调整重要的工程组织性能方面有很大用处, 如细胞对准、扩散速率和有效刚度。此外, 这些模具对于为需要几何的分析应用程序准备组织非常有用, 如机械测试^16,17。从激光切割负主模具中制备这些器件提供了一种快速、简便、低成本的利用这些工具的方法, 特别是与传统微细加工的时间和成本相比较。激光切?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630-5G	Constructs
Bovine thrombin	Sigma	T6634-250UN	Constructs
Bovine aprotinin	Sigma	10820-25MG	Constructs
Rat tail collagen I, 4 mg/mL	Advanced Biomatrix	5153-100MG	Constructs
Sodim chloride	Fisher	BP358-10	Constructs
PBS	Life Technologies	14190-250	Constructs
Fine forceps	Fine Science Tools	11252-20	Constructs
Sylgard 184 silicone elastomer	Corning	4019862	PDMS Molds
Lab tape	Fisher	15-901-5R	PDMS Molds
Acrylic, 1/4" thick	McMaster-Carr	8560K356	PDMS Molds
HEPES Buffer, 1 M	Sigma	H3537-100ML	Constructs
RPMI 1640 medium, powder	Fisher	31800-089	Constructs
Calcium chloride dihydrate	Fisher	AC423520250	Constructs
Magnesium chloride hexahydrate	Fisher	M33 500	Constructs
Potassium chloride	Sigma	P9541-500G	Constructs
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9390-500G	Constructs
Glucose	Sigma	G5767-25G	Constructs
OCT	VWR	25608-930	Histology
Frozen block molds	VWR	25608-916	Histology
Hematoxylin	Fisher	3530 1	Histology
Eosin Y	Fisher	AC152880250	Histology
Fast green FCF	Fisher	AC410530250	Histology
Software
Illustrator	Adobe Systems		Vector Graphics
Inkscape	(Open Source)		Vector Graphics
UCP (Universal Control Panel)	Universal Laser Systems		Laser Cutter Interface
Equipment
PLS6.75 Laser Cutter	Universal Laser Systems		Laser Cutter
Micromechanical Analyzer	Aurora Scientific	1530A with 5 mN load cell	Mechanical Analysis