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摘要

铜绿假单胞菌感染会导致易受害主机发病率显著。非冗余座子插入突变库的绿脓杆菌菌株 PA14, 指定为 PA14NR 集, 促进分析的基因功能在许多过程中。这里提出了一个协议, 以生成高质量的副本 PA14NR 集突变库。

摘要

在人类环境中, 铜绿假单胞菌是一种表型、genotypically 多样、适应性强的革兰阴性菌。铜绿假单胞菌能够形成生物膜, 发展耐药性, 产生致病因素, 并在慢性感染过程中迅速发展。因此, 铜绿假单胞菌可以引起急性和慢性, 难以治疗感染, 导致在某些病人的严重发病率。铜绿假单胞菌菌株 PA14 是一个具有保守基因组结构的人的临床隔离, 它感染了各种哺乳动物和 nonvertebrate 宿主, 使 PA14 成为研究这种病原体的一个诱人的菌株。在 2006年, 非冗余座子插入突变体库包含5459变种对应于4596预测 PA14 基因的产生。此后, PA14 图书馆的分布使研究界能够更好地了解个体基因的功能和铜绿假单胞菌的复杂通路。通过复制过程维护库完整性需要正确的处理和精确的技术。为此, 本手稿提出的协议, 详细描述了涉及的步骤, 图书馆复制, 图书馆质量控制和适当储存的个别变种人。

引言

铜绿假单胞菌是一种表型和 genotypically 不同和适应性的革兰阴性菌, 存在于土壤、水和大多数人类环境中, 以及皮肤微生物区系。与许多细菌种类相比, 铜绿假单胞菌有一个相对较大的基因组 5.5-7 的 Mbp 与高 G + C 含量 (65-67%)。此外, 它的相当一部分基因参与代谢适应性和管理网络的一部分, 允许极大的灵活性, 以应对环境压力1。铜绿假单胞菌表达了过多的毒力因素, 表现出形成生物膜的倾向, 具有通过多种仲裁传感通路协调反应的能力, 并显示出开发耐药性的显著能力。和公差2,3,4,5,6,7,8。这些属性对治疗由铜绿假单胞菌引起的感染带来了重大挑战。

慢性的铜绿假单胞菌感染可能发生在许多疾病状态。囊性纤维化 (CF), 一种遗传性疾病引起的突变的囊肿纤维化跨膜电导调节器 (CFTR)基因, 导致浓缩, 感染的分泌物在呼吸道, 渐进性支气管扩张, 最终, 死亡从呼吸衰竭9。成年后, CF 的大多数患者慢性感染铜绿假单胞菌, 这在发病率和死亡率与此疾病相关的10中起着关键作用。此外, 严重烧伤损伤的患者11、tracheostomies12、联合替换13或留置导管14有风险的P. 铜绿假单胞菌感染与细菌形成的能力有关生物膜和逃逸宿主炎症响应15。此外, 在通过广谱、连续抗菌治疗选择了多抗生素耐药性或耐受性的人群后, 在无竞争的情况下进行殖民化,12,16,17,18. 更好地了解铜绿假单胞病毒的发病机制将对许多疾病状态产生重大影响。

大量研究了几种铜绿假单胞菌临床分离株, 包括 PAO1、PA103、PA14 和白脓杆菌等, 探讨了铜绿假单胞病毒发病机制的不同特点。应变 PA14 是一种临床隔离, 属于世界上最常见的克隆组之一, 在全球范围内19,20 , 并没有在实验室广泛传代。PA14is 在脊椎动物感染模型中具有剧毒, 具有显著的内毒素特征21, 毛结构22, 致病性群岛23, III. 型分泌系统 (TTSS), 对哺乳动物细胞的细胞毒性24和抗生素耐药性和持久性的配置文件25。此外, PA14 在众多寄主病原体模型系统中也具有剧毒, 包括植物叶片浸润模型26,27,秀丽线虫感染模型28, 29, 昆虫模型30,31, 以及老鼠肺炎模型32,33和皮肤烧伤模型34。

基因组范围内的突变体库是不必要基因中的等基因系突变体的集合, 它构成了一种非常有力的工具, 可以通过基因组尺度分析来了解生物体的生物学。目前, 在铜绿假单胞菌中构建的两个近饱和座子插入突变库可供分发。已为两个库确定了随着转座子的插入位置。这些所谓的非冗余图书馆促进了对细菌株的全基因组研究, 大大减少了筛选 uncharacterized 随机座子突变体所涉及的时间和成本。由华盛顿大学随着转座子实验室策划的 PAO1 座子突变库, 在 PAO1 使用 phoA 的 MPAO1 隔离中构建, 是lacZ/哈,是Manoil/哈35。该图书馆由序列验证的收集9437座子突变体提供广泛的基因组覆盖, 包括两个突变体的大多数基因36。有关铜绿假单胞菌PAO1 座子突变库的信息, 可在 http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm 的公共、互联网访问的 Manoil 实验室网站上查阅。PA14 应变非冗余座子插入突变库 (PA14NR 集) 构造的应变 PA14 使用随着转座子MAR2xT7 和TnphoA 37 目前由儿科部分发在马萨诸塞州总医院。PA14NR 集包括5800多个变种人的集合, 在非必需基因37中单座子插入。有关 PA14NR 集建设的详细信息, 在公开、互联网访问的网站 http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi？section=NR_LIB 中介绍, 其中还包含各种在线搜索工具, 以便利使用 PA14NR设置。

原始的 PA14NR 集合包括5459个变种人, 从一个综合图书馆选择大约3.4万个随机座子插入突变体, 对应于4596预测 PA14 基因代表77% 的所有预测 PA14 基因37。自从2006年图书馆的建设新变种增加, 目前 PA14NR 集包括超过5800变种人38 , 代表大约 4600 PA14 基因。大多数 PA14 座子突变体都是在野生类型背景37中生成的。有关变种人库的每个成员的详细信息, 包括遗传背景, 可通过搜索联机数据库或下载非冗余库电子表格 (PA14 网站上提供的两种功能) 提供 (http://pa14. mgh 哈佛大学/cgi-bin/pa14/主页. cgi)。大多数变种人是使用 MAR2xT7 (MrT7) 座子创建的, 使用 TnPhoA (phoA) 座子37创建的小集。每个座子有一个抗生素耐药性盒, 它允许突变选择使用庆大霉素 (MrT7) 或卡那霉素 (phoA)。PA14NR 组的突变体存储在六十三96井板中, 包括两个额外的96井控制板, 由野生型 PA14 接种和适合井插在预设模式下组成。与在线搜索工具配对的96井板格式极大地促进了筛选测试的定制开发, 使用户能够轻松地识别与突变体表型相关的基因。在线搜索工具还有助于搜索和选择进一步研究所需的其他相关突变体。

PA14 和 PAO1 座子突变体库是科学界非常重要的全球资源, 它们相互补充, 验证了该病原菌的未知基因和通路的功能。巧合的是, 自从 PAO1 和 PA14 座子突变库的构建以来, 许多铜绿假单胞菌的全基因组 DNA 测序分析表明 PAO1 和 PA14 属于不同的主要 subclades 的铜绿假单胞菌系统系统7,39,40,41。由于临床上的铜绿假单胞菌分离物分布在整个系统发育过程中, PAO1 和 PA14 属于不同的铜绿假单胞子组的事实提高了两个座子变异库的价值, 以便比较研究。

关于细菌突变库的构建和筛选的出版物, 包括铜绿假单胞库35,37,42, 在文献中很容易获得。但是, 根据我们的知识, 没有发布的协议描述用于复制、维护和验证细菌突变库的详细程序和技术。

本出版物中概述的方法描述了一套三协议, 便于使用和维护 PA14NR 集。第一个协议描述了向 PA14NR 集的收件人推荐的库的复制。第二个协议包括用于裸奔、生长和存储使用 PA14NR 集识别的单个突变体的准则。第三个协议描述质量控制技术, 包括 PCR 扩增的片段从座子突变体和后续测序, 以确认变种人的身份。这组协议也可用于复制和维护其他细菌突变库或集合。强烈建议复制细菌突变库或集合, 以保持 "主副本" 的完整性 (收到的原始副本)。复制 PA14NR 集的几个副本用于常规实验室使用, 可以最大限度地减少主拷贝井间踪污染的可能性。

研究方案

注意: 使用标准 BSL-2 安全措施处理铜绿假单胞菌时,是人类的病原体。如果你是一个免疫力低下的个人或有任何的医疗条件, 增加你对细菌感染的易感性, 在使用 P 时应格外小心.铜绿。请咨询您所在机构的生物安全办公室, 并在与 PA14 NR 组或细菌病原体突变库合作之前获得医生的批准。

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图 1: 协议 I: PA14NR 集的复制概述.1天: 将冰冻突变体从 PA14NR 的 "主拷贝" 复制到 LB 琼脂培养基中, 并在37摄氏度一夜之间生长变种。2天: 将突变体从 lb 琼脂培养基转移到含有 lb 液汤的深井区块, 在37摄氏度一夜之间以950转每分钟的抖动生长。3天: 将一夜之间的 LB 文化与甘油混合, 然后转移到96井的目的板块进行长期贮存。放置96井板平在-80 °c 冰箱。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 2: 建议的安装程序.通过使用适当的预防措施, 保持不育和平滑的工作流程。请单击此处查看此图的较大版本.

1. 第一号议定书: PA14NR 集的复制

注意: 可以通过将 PA14NR 集划分为四个子集的十六个板, 每个连续四周处理, 从而实现对库的复制。1到6个副本的生成遵循表1中概述的每周工作流, 而超过6个副本的生成遵循表2中概述的每周工作流。要生成12个 PA14NR 集的副本, 请将相同的 PA14NR 子集接种到2天的液体 LB 介质中, 再在3天 (从同一组在1天复制的琼脂盘) 中, 并将隔夜突变体的文化转移到3和4天的复制板上。

0天1天2天3天
准备日PA14NR 组突变体在 LB 琼脂培养基上的生长液体 LB 介质中 PA14NR 突变体的生长PA14NR 集突变体文化向目标板块的转移

表 1: 复制 PA14NR 集的 1-6 个副本的计划。复制少量副本可能会坚持每周工作流。

0天1天2天3天4天
准备日PA14NR 组突变体在 LB 琼脂上的生长液体 LB 介质中 PA14NR 突变体的生长3天突变文化的转移生成第一套 PA14NR 集6份4天突变文化的转移生成第二套 PA14NR 集6份
液体 LB 介质中 PA14NR 突变体的生长

表 2: 复制 PA14NR 集的多达12个副本的计划。复制更多的副本需要在每周工作流中分层。

  1. 1天: PA14NR 的生长在 LB 琼脂板上设置主拷贝
    1. 戴上手套、实验室外套和面具来处理 PA14NR。
    2. 清除工作台面, 用70% 乙醇擦拭表面。
    3. 准备 LB 琼脂介质43并在蒸压釜内杀菌25分钟, 冷却介质到55摄氏度, 在水浴中添加15µg/毫升庆大霉素, 用于含有 Tn phoA 的突变体, 包括MAR2xT7座子插入或200µg/毫升卡那霉素.插入。
    4. 在矩形板中倒入熔融 LB 琼脂, 每板使用大约60毫升的介质。在使用前大约1小时, 在消毒罩内干燥板。确保琼脂表面没有水凝结。如有必要, 在4摄氏度处贮存板材。
    5. 创建一个无菌的领域与本生燃烧器在乙醇擦拭工作台顶部, 并设置容器与适当的解决方案, 复制器针灭菌 (见步骤 1.1.9)。使用开放塑料容器 (5.25 "L x 4.25" W x 1.75 "H 近似大小) 为复制器别针绝育。使用前用高压釜塑料容器。
      注: 本生燃烧器火焰的热量产生对流电流, 加热火焰上方的空间, 并将空气中的任何微粒向上和远离冷却空气, 保持工作区域无菌。
    6. 从-80 °c 冰箱中取出最多四 PA14NR 的主板 (以避免不必要的解冻), 并将它们放在4升冰锅的干冰中。
    7. 把96井的主板块从干冰中复制出来, 放在长凳上, 允许短暂解冻, 这只会花时间为复制器引脚 (大约3-4 分钟) 的灭菌 (见步骤 1.1.8)。在冲压前, 将 A1 坐标的位置标记在琼脂板上。将主板和琼脂板与左上角两个板块的 A1 坐标对齐。
    8. 按照下面描述的步骤, 对复制器 "针脚" 进行杀菌。每个步骤后轻轻地点击复制器以去除多余的液体。
      1. 浸泡在250毫升 0.3-0.5% 次氯酸钠 (10% 家用漂白剂) 的针脚30秒。尽量减少与次氯酸钠溶液的接触, 因为它会导致针脚损坏。浸入250毫升无菌 ddH2O 或无菌的超纯水10秒, 然后在250毫升70% 乙醇30秒, 然后在250毫升95% 的乙醇为2分钟。
      2. 火焰通过将复制体垂直地保存在本生燃烧器火焰上, 慢慢接近火焰, 直到乙醇点燃, 然后立即从火焰中取出。一旦乙醇燃烧, 火焰就会熄灭。如有必要, 将盖子或类似的容器关闭, 以窒息燃烧乙醇。
        注意: 在靠近火焰的乙醇工作时, 使用极端警告。不要直接在火焰上存放复制器。
      3. 冷针固定在一个未使用的无菌矩形板含有琼脂 LB 介质30秒。
    9. 简要的温暖铝密封从 PA14NR 设置主板与你的手剥掉它。在冷却复制器针脚时执行此项。小心拆卸铝封, 防止密封件对板材进行修整。使用镊子剥离任何残余的铝密封。
    10. 将复制器引脚插入主板, 在所有四个方向上轻轻地推和摆动复制器, 以确保针脚与96井中每一个冰冻细菌培养物接触。特别注意位于板块外缘的水井, 将复制器引脚推向位于板块边缘的水井中的冰冻文化。
    11. 轻轻地将复制器针脚放到琼脂盘的表面。移动复制器在一个轻微的圆形运动, 形成小草坪约4-5 毫米为每个变种人菌株。避免小草坪可能重叠的可能性, 以避免交叉污染。
    12. 密封 PA14NR 设置主板与新的无菌铝密封。请勿触摸铝密封件的粘接面, 以免污染。确保每个井和板的边缘是完全密封的使用板辊。返回96井板干燥冰。
    13. 对每个主板重复过程。
    14. 处理 PA14NR 后, 用70% 乙醇擦拭所有工作表面。
    15. 将复制的琼脂板转移到37°c 孵化室并在一夜之间孵化。
  2. 2天: PA14NR 的生长在 LB 液汤中的主拷贝
    1. 准备含有15µg/毫升庆大霉素的 LB 液汤, 用于包含 MAR2xT7座子插入的突变体, 或200µg/ml 卡那霉素, 用于含有 TnphoA插入的突变体。
    2. 清除不必要设备的层流罩, 并在开始工作前将罩风机打开至少10分钟。用70% 乙醇擦拭罩面和任何放置在引擎盖上的物品。
    3. 用50-1200 µL 12 通道电子吸管, 在层流罩内填充2毫升深井块, 525 µL 的 LB 液汤含有适当的抗生素。然后, 将填充介质的深井块转移到乙醇擦拭的工作台顶部。只要保持不育的条件, 重用提示。
    4. 戴上手套、实验室外套和面具来处理 PA14NR。
    5. 清除工作台面, 用70% 乙醇擦拭表面。
    6. 将琼脂盘与隔夜生长的变种菌株带到长凳上。
    7. 创建一个无菌的领域与本生燃烧器在乙醇擦拭工作台顶部, 并设置容器与适当的解决方案, 复制器针灭菌 (见下一步)。
    8. 按照下面描述的步骤对复制器 "针脚" 进行杀菌。每次浸泡后轻轻轻拍复制器以除去多余的液体。
      1. 浸泡在250毫升 0.3-0.5% 次氯酸钠的针脚30秒。尽量减少复制器针接触次氯酸钠溶液, 因为它可能导致损坏的针脚。然后, 浸泡在250毫升无菌 ddH2O 或超纯水10秒, 然后在250毫升70% 乙醇30秒, 然后在250毫升95% 的乙醇为2分钟。
      2. 火焰杀菌复制器别针, 然后冷却别针通过固定入未使用的长方形板包含琼脂 LB 媒介30秒。
        注意: 使用极端警告时, 在与火焰附近的乙醇工作 (见 1.1.8)。
    9. 轻轻地将复制器引脚放在含有突变体生长的琼脂板上, 检查针脚是否与琼脂板上的所有96变种人接触, 然后将引脚浸入含有 LB 液汤的深井中。避免接触井的两侧与别针。
    10. 用无菌透气密封膜封住深井块。使用板辊, 以确保每一个人井是正确的密封。
    11. 对每一个琼脂板重复的过程。
    12. 处理 PA14NR 后, 用70% 乙醇擦拭所有工作表面。
    13. 如果有的话, 在 950 rpm 的时候, 使用高速振动筛, 在37°c 培养 15-16 小时的接种液体培养液。
      注: 如果没有高速振动筛, 在 250-300 rpm 的振动筛中深井块的孵化是可行的。但是, 在低氧条件下出现的小菌落变体 (SCVs)25的几率更大。因此, 在深井区块以较低的振动筛速度生长培养时, 最好将孵化时间保持在 15-16 小时以下。突变体中 SCVs 的不必要增殖, 可以在使用图书馆进行基因筛时改变突变体表型。
      PA14NR 中的某些水井含有生长缓慢/不生长的突变体, 缺少克隆, 或者含有适合介质。这些水井的位置已记录在案, 并可在本出版物所附的补充 PA14NR 集水井信息文件中找到。
  3. 3天: PA14NR 设置隔夜文化到目的板材的转移
    1. 清除层流罩, 并在开始工作前至少打开10分钟的风罩鼓风机。用70% 乙醇擦拭罩面和任何放置在引擎盖上的物品。
    2. 打印粘附防水标签 (请参阅补充 PA14NR 为模板设置标签文件)。在层流罩内从塑料包裹中取出96井板。剥离板标签, 并将其沿板块边缘最接近 A1 到 H1 井的目的板块。当盘子盖上盖子时, 稍微提起目标板的盖子, 将标签放在下边缘以显示标签。
    3. 准备3.5 升60% 甘油 (v/v), 并在高压釜消毒20分钟。
    4. 戴上手套、实验室外套和面具来处理 PA14NR。从高速振动筛或普通振动筛中拆卸深井块。
    5. 将深井块转移到无菌层流罩中, 小心地去除透气密封膜。更换为铝密封件。在很低的速度下旋下深井块以收集冷凝 (30 秒在 50-150 x g, 然后减速 quicky 通过有离心机刹车)。
    6. 将深井块转移回无菌罩, 并使用50-1200 µL 12 通道电子吸管和无菌过滤小贴士添加525µL 甘油/磅液体汤混合 (等量的 lb 液汤和60% 甘油溶液) 的每个井。用电子吸管轻轻吹打300µL 上下3次。在弹出提示之前, 触摸提示, 以防止滴水。弹出提示, 并继续下一行, 直到完成了整个深井块。
    7. 使用12通道电子重复吸管和过滤小贴士, 以防止在 aliquoting 期间井间踪污染, 拉动900µL 突变体, 并分配150µL 到每个96井的目的板块, 生成6份的图书馆板块。在开始将文化转移到目的板块之前, 通过接触水井壁来防止滴水。如果没有重复吸管可用, 使用多通道吸管分配150µL 到每一个六96井板, 使用上述技术, 以防止滴水。
    8. 使用无菌铝密封盖板和使用板辊完全密封板边缘和所有水井。请确保不要用铝密封盖标签标识符。不要摇晃盘子, 因为文化可能飞溅在井的边或在铝封印。
    9. 将密封板从罩板上取下, 并将板材放在平坦的平面上, 均匀地放在-80 摄氏度冰柜中。
    10. 处理完库后, 用70% 乙醇擦拭所有工作表面。
    11. 在库复制之后和使用库执行遗传屏幕后执行质量控制检查 (参见第三号协议)。

2. 第二号议定书: 从 PA14NR 组处理和储存个别变种人

  1. 1天: 兴趣条纹突变体
    1. 通过 PA14NR 设置链接 http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi？searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS 或使用非冗余库从链接中下载的 xls 文件来标识感兴趣的变种人的位置 http://pa14. mgh. 哈佛大学/cgi-bin/pa14/下载. cgi)。记下选择每一个特定突变体 (庆大霉素或卡那霉素) 所需的抗生素。
    2. 准备 LB 琼脂培养基, 在高压釜内杀菌20-25 分钟, 在水浴中冷却至55摄氏度。为含有 TnphoA座子插入的突变体添加15µg/毫升庆大霉素, 用于包含MAR2xT7座子插入的突变体和200µg/毫升卡那霉素。将 LB 琼脂介质倒在盘子上 (圆形或矩形板足够)。干燥板在消毒罩大约30分钟到1小时前使用。
    3. 在使用前, 高压釜所有 plasticware 和无菌耗材。
    4. 戴上手套、实验室外套和面具来处理 PA14NR。在使用 PA14NR 之前, 要用70% 乙醇清除工作台面和擦拭表面。
    5. 用本生燃烧器创建一个无菌场。
    6. 删除 PA14NR 集 96-良好的板块与变种的兴趣从-80 °c 冰箱, 并把它放在干冰, 采取干冰容器的板凳, 并简要地放置96井板上的板凳上, 以允许轻微解冻 (约1-2 分钟)。
      注: 记录所有 PA14NR 设置的 96-井板进入条纹个体突变体, 因为更多的接触到图书馆板块与更大的风险井间踪污染相关。
    7. 热铝密封与手剥离前, 小心防止密封, 以修饰板。使用镊子剥离任何残余的铝密封。
    8. 在96井板上找到感兴趣的变种人。使用无菌的木棒或无菌吸管提示, 从含有兴趣突变体的个体中挑选少量的冰冻文化。
    9. 单突变体琼脂板的条纹冷冻培养如下所示: 轻轻地将细菌传播到板块的一段, 以创造条纹 1, 使用新鲜的, 不育的木棒或吸管尖端, 拖过条纹1和传播细菌在第二个部分板块, 创造连胜2。使用第三根不育的木棍或吸管尖, 通过条纹 2, 并传播细菌在板块的最后一部分, 创造条纹3。
    10. 密封源板与新的无菌铝密封。请勿触摸铝密封件的粘合面, 以免污染。确保板的每一个井和边都用板辊完全密封。返回96井板干燥冰, 然后-80 °c 冰箱。
    11. 在37摄氏度孵化室中孵化琼脂盘过夜。
    12. 处理完库后, 用70% 乙醇擦拭所有工作表面。
  2. 2天: LB 液汤中兴趣突变体的生长
    1. 准备含有15µg/毫升庆大霉素或200µg/毫升卡那霉素的液体 LB 汤, 座子插入。
    2. 佩戴手套、实验室外套和口罩处理铜绿假单胞菌。
    3. 清除工作台面, 用70% 乙醇擦拭表面。用本生燃烧器创建一个无菌场。
    4. 将 3-5 毫升的 LB 汤与适当的抗生素转移到无菌培养管中。
    5. 使用不育的涂抹器或不育的吸管尖, 选择一个单一的变种菌株菌落, 并接种到 LB 培养基。
    6. 在 225-250 rpm 一夜之间孵化37摄氏度的 LB 液体培养物。
    7. 处理铜绿假单胞菌后, 用70% 乙醇擦拭所有工作表面。
  3. 3天: 商店的兴趣突变体-80 °c 冰箱
    1. 标签 cryovial 与突变名, 抗生素添加到 LB 汤和储存日期。
    2. 准备500毫升50% 甘油 (v/v) 和灭菌在高压釜。
    3. 佩戴手套、实验室外套和口罩处理铜绿假单胞菌。
    4. 清除工作台和/或层流洪水罩和擦拭表面与70% 乙醇。
    5. 从振动筛中取出含有突变体的试管。
    6. 用干冰准备一个小容器。
    7. 使用一个层流罩或创建一个无菌的领域在乙醇擦拭工作台顶部与本生燃烧器。
    8. 使用无菌条件, 将相同数量的细菌培养和50% 甘油添加到标记的 cryovial 中, 并与吸管 (最终体积 1-2 毫升/瓶) 轻轻混合, 具体取决于所用 cryovials 的大小。把 cryovial 放在干冰上快速冷冻。
    9. 将 cryovial 放置在-80 °c 冰箱的标签盒中。
    10. 处理铜绿假单胞菌后, 用70% 乙醇擦拭所有工作表面。

3. 第三号议定书: PA14NR 集的质量控制

  1. 从新复制的板块中选择随机的突变体, 以检测可能的井间踪污染 (建议对30-40 变种人进行测试)。
    注: 如果有必要确认一个变种人的身份被用于鉴定特定基因, 建议使用基因特异的引物进行 PCR 放大, 该基因是为已知序列所设计的, 含有座子插入。虽然更具挑战性, 使用任意 pcr 引物的好处, 而不是基因特异的 pcr 底漆时, amplyfing DNA 片段从座子突变体包括易于大规模突变确认和能力检测的存在潜力污染物。为了质量控制的目的, 没有必要为所有随机 slected 突变体获得高质量的 PCR 测序数据, 只要筛选出足够数量的变种人来评估错误率。
  2. 遵循 "第二号议定书" 来条纹和生长变种菌株。
  3. 在使用前, 高压釜所有 plasticware 和无菌耗材。
  4. 用首选方法分离基因组 DNA。对于这项工作中描述的分析, 在制造商的协议下使用了一个基因组 DNA 隔离套件。可同时分析多种突变株。
  5. 用 microvolume 分光光度计测定基因组 DNA 浓度。将基因组 DNA 浓度调整到大约100µL。
  6. 使用基因组 DNA 作为模板运行 "PCR1 反应", 如表3的步骤1所述, 生成 Arb1 PCR 片段 (图 3)。表4列出了此步骤的底漆。
  7. 添加0.5 µL 10x 加载缓冲到5µL 的 PCR1 反应, 负载成 1.5-2% 琼脂糖凝胶, 并运行在 80-150 v 凝胶。
    注意: 不需要特定的片段长度或特定的片段范围, 并且可能存在多个带, 因为任意底漆可能绑定到多个位置。
  8. 使用 PCR1 反应的 DNA 作为模板运行 "PCR2 反应", 如表3的步骤2所述, 生成 Arb2 PCR 片段 (图 3)。表4列出了此步骤的底漆。
  9. 添加0.5 µL 10x 加载缓冲到5µL 的 PCR2 反应, 负载成 1.5-2% 琼脂糖凝胶, 并运行在 80-150 v 凝胶。
    注意: 不需要特定的片段长度或特定的片段范围, 并且可能存在多个带, 因为任意底漆可能绑定到多个位置。
  10. 发送 PCR2 反应连同适当的座子特定的底漆, 以排序。
  11. 分析测序结果 byBLASTing 他们对完整的 PA14 基因组使用 PA14NR 图书馆网站 (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) 提供的爆炸链接或直接爆破他们对特定的基因序列兴趣的变种人。
    注意: 通过搜索 PA14NR 集网站 (搜索 http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi？searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS 或下载非冗余库. xls 文件, 可以找到有关所选突变体的信息 http://pa14. mgh 哈佛大学/cgi-bin/pa14/下载. cgi)。

figure-protocol-10290
图 3: 座子插入突变体的 PCR 扩增和测序.在 PCR 扩增和测序中所涉及的步骤的示意图, 以验证变种人的身份。请单击此处查看此图的较大版本.

PCR 反应设置
步骤1步骤2
PCR1反应: PCR2反应:
23.25 µL 水 (分子生物学等级)19.15 µL 水 (分子生物学等级)
3µL 10x Taq 聚合酶缓冲器5µL 10x Taq 聚合酶缓冲器
0.5µL Taq 聚合酶0.6 µL Taq 聚合酶
0.625 µL 20 µM 底漆 Arb1D (表 4)0.625 µL 20 µM 底漆 Arb2A (表 4)
0.625 µL 20 µM 座子专用底漆 (PMFLGM。GB 3a 或 Tn5Ext) (表 4)0.625 毫升20µM 座子专用底漆 (PMFLGM。GB 2a 或 Tn5Int2) (表 4)
1µL 10 毫米 dNTPs1µL 10 毫米 dNTPs
1µL 基因组 DNA, 100 ng5µL PCR1反应
30µL 最后反应容量30µL 最后反应容量
PCR 反应设置
PCR1Thermocycler 条件: PCR2Thermocycler 条件:
95°c –2分钟95°c –2分钟
重复5个周期:重复30个周期:
95°c-三十年代95°c-三十年代
30°c –1分钟54°c-三十年代
72°c –1分钟72°c –1.5 分钟
重复30个周期:72°c –10分钟
95°c-三十年代4°c-举行
45°c-三十年代
72°c –1分钟
72°c –10分钟
4°c-保持

表 3: 用于任意 pcr 的 pcr 反应设置和 thermocycler 条件。任意 PCR 反应依次执行, PCR1 反应过程中产生的片段被用作 PCR2 反应的模板。特定的 thermocycler 设置用于每组反应。

底漆名称底漆序列
MAR2xT7 座子专用底漆
PMFLGM。GB-3aTACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM。GB-2aTGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 座子测序底漆
PMFLGM。GB-4aGACCGAGATAGGGTTGAGTG
TnphoA座子特定底漆
Tn5ExtGAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
TnphoA座子测序底漆
Tn5IntCGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
任意引物
ARB1DGGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2AGGCCAGGCCTGCAGATGATG

表 4: 质量控制中使用的底漆列表实验.引物用于 PCR 扩增和序列的座子插入突变体, 以确认变种人的身份。

结果

十二 PA14NR 集的新副本是使用协议 I 复制的, 并使用第三号议定书对生成的新副本进行了质量控制评估。

PA14NR 设置突变板连同控制板, 包括野生型 PA14 接种和适合井插在预设模式 (图 4A), 复制后方法在协议 i. 控制板包括在 PA14NR 设置, 以评估可能的井间踪污染时执行板块复制。此外, 控制板可以用来练习复?...

讨论

P。铜绿假单胞PA14NR 集是科学界的宝贵资源。根据2017年3月数据集从 Clarivate 分析的基本科学指标数据库, Liberati et 等。(2006)37描述了 PA14NR 集的构造, 排名在微生物学刊物的前1% 位。谷歌学者报告了超过 600 Liberati 的引文et 。(2006) 2017年8月原稿。图书馆在阐明铜绿假单胞菌发病机制方面发挥了重要作用。重要的是, PA14NR 集的96井板格式方便了用于研?...

披露声明

作者报告没有任何金融利益冲突。埃利安娜 Drenkard 和弗雷德里克奥苏贝尔参与创建 PA14 非冗余座子突变库。布赖恩赫尔利和 Lael Yonker 目前的房子和分发的变种人图书馆作为一部分的儿科在马萨诸塞州总医院。

致谢

我们要感谢 MGH 崔德威尔虚拟图书馆的丽莎 Philpotts 她在数据库搜索中的指导。这项工作得到了囊性纤维化基金会 (YONKER16G0 和 HURLEY16G0) 和 NIH NIAID (BPH 和艾德: R01 A1095338) 的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50Corning Life Sciences353072via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25Corning Life Sciences3960via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60Thermo Scientific Rochester242811via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L)Corning Life Sciences432104via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300Cardinal HealthAT7509via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100Diversified BiotechALUM-100via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100Diversified BiotechBEM-1via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100SorensonS50100via Westnet Incorporated
Plate rollerVWR60941-118via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheetsGA InternationalRCL-11T1-WHvia Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicatorV & P Scientific, Inc.Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm longvia V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubatorInfors HTl10003Pvia Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic PipetteSartorius735491PRvia Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960Biohit14-559-512via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry IceUser-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mLFisher Scientific05-408-130via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2)GilsonF167370via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mLFisher Scientific05-408-130via Fisher Scientific
NanoDropThermo ScientificND-2000via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lidsThermo ScientificAB0404via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL)Molecular BioProducts, Inc.Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL)via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2)GilsonF167370via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mLFisher Scientific05-408-130via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification KitEpicentreMCD85201via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-useThermo ScientificSM1333via ThermoFisher
RediLoad Loading BufferInvitrogen750026via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1LSigma AldrichG5516via Sigma-Aldrich
LB BrothPer 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
TryptoneSigma AldrichT7293via Sigma-Aldrich
Yeast ExtractSigma AldrichY1625via Sigma-Aldrich
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653via Sigma-Aldrich
Sodium HydroxideSigma AldrichS8045via Sigma-Aldrich
LB  agarSee preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto AgarSigma AldrichA5306via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10gBioReagent1405-41-0via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfateGibco11815024via ThermoFisher
Ethanol, 190 proofDecon04-355-221via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
PrimersUser-preferred vendorSee primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade WaterCorning46000CVvia Fisher Scientific
Taq Polymerase BufferInvitrogen10342020via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinantInvitrogen10342020via ThermoFisher
dNTPsInvitrogen10297018via ThermoFisher
AgaroseSigmaA9539via Sigma-Aldrich

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