导电支架调节和传递干细胞

摘要

本协议描述了细胞培养系统的制作, 允许在导电高分子支架上播种干细胞, 用于体外电刺激和随后的体内植入干细胞种子支架, 使用微创技术。

摘要

干细胞治疗已成为一种令人兴奋的中风治疗, 但最佳分娩方法仍不清楚。虽然显微注射技术已用于数十年来交付干细胞的中风模型, 这项技术是有限的能力, 缺乏操作前的干细胞注射。本文详细介绍了一种利用导电高分子支架进行干细胞输送的方法。利用导电高分子支架对干细胞进行电刺激会改变干细胞的基因, 包括细胞存活、炎症反应和突触重塑。电预处理后, 支架上的干细胞移植 intracranially 在大脑中动脉闭塞大鼠模型中。该协议描述了一个强大的技术, 通过导电高分子支架操作干细胞, 并创造了新的工具, 以进一步发展干细胞为基础的治疗。

引言

中风是世界上第二大死因, 也是美国第五大死亡原因。尽管有这些高死亡率, 中风康复治疗目前仍然是一个挑战, 目前尚无可行的医疗选项¹。目前大约有300项临床试验涉及缺血性中风, 其中只有40的人利用干细胞。以前的研究表明, 干细胞疗法对中风修复有有益的影响^2,3。由移植的人神经祖细胞 (hNPCs) 释放的脑源性神经营养因子 (BDNF) 和 thrombospondin-1 (THBS-1) 等分泌因素表明, 通过与增加突触形成, 血管生成, 树突状分支和新的轴突投射, 以及调节免疫系统^4,5,6。然而, 干细胞的最佳分娩方法仍然是难以捉摸的。

成功的干细胞传递到大脑仍然是一个挑战。目前, 注射用水凝胶和高分子脚手架系统已被引入, 以提供干细胞。这些分娩方法保护干细胞移植期间, 并提供保护免受严酷的中风后环境, 包括宿主的炎症反应和缺氧条件^7,8,9,10. 然而, 最常用的材料是惰性的, 这限制了连续调制 (即, 电刺激) 的细胞¹¹的使用。电刺激是影响分化、离子通道密度和干细胞突起生长的一个提示¹²。与惰性聚合物相比, 导电聚合物可以携带电流, 允许电刺激和操纵干细胞²。然而, 电刺激调节神经营养因子释放 (即, BDNF 和 THBS-1) 的精确机制仍未得到充分探讨。

在本协议中, 我们描述了构建一个细胞培养系统的步骤, 该体系由导电高分子支架、聚吡咯 (聚吡咯) 组成,允许体外电刺激。由于细胞培养系统的制作方式, 随后将干细胞种子支架植入到周围梗死皮层是可能的。对于这个系统, 我们在植入前的短时间内, 在支架上电先决条件干细胞。继电刺激后, 携带细胞的导电高分子支架成功地植入 intracranially 使用微创方法。

研究方案

所有干细胞和动物程序均经斯坦福干细胞研究监督委员会和斯坦福大学实验室动物护理管理小组 (SCRO-616 和 APLAC-31909) 批准。

1. ITO 玻璃的蚀刻

1. 在玻璃的导电面上放置一个掩蔽剂, 制备铟锡氧化物 (ITO) 覆盖的玻璃滑块。
   注: 大多数商用透明胶带可用作掩蔽剂。
   1. 用刀片去掉多余的面具, 只留下玻璃上覆盖的最终 ITO 设计所需的形状。
2. 将 5% (v/v) 的硝酸和 45% (v/五) 的 HCl 在一个通风罩内的玻璃烧杯中组合, 准备蚀刻溶液。
   1. 使用热板和温度计, 以确保蚀刻溶液的温度保持在摄氏70摄氏度。
3. 一旦蚀刻溶液达到70摄氏度, 将屏蔽 ito 玻璃滑入溶液中2分钟, 以去除多余的 ITO 层。
   注: 胶带掩蔽保护 ITO 层从接触酸性溶液。
4. 从解决方案中取出幻灯片, 并用去离子 (DI) H₂O 冲洗它。
5. 小心地取下面罩, 用万用表测量电阻, 以确保其余的 ITO 完好无损。所需蚀刻区域的读数应约为0Ω。

2. 吡咯溶液的制备

1. 在1000毫升玻璃瓶中, 将70克 dodecylbenzenesulfonate 钠 (NaDBS) 溶于600毫升的 DI H₂O。
2. 一旦 NaDBS 溶解, 添加14毫升 0.2 M 吡咯和386毫升的 DI H₂O 的解决方案。
3. 用铝箔覆盖溶液, 贮存在4摄氏度。

3. 在 ITO 玻璃上电镀聚吡咯

1. 将吡咯溶液加热到室温, 直到 NaDBS 完全 redissolved。
   注意: 这需要大约15到20分钟。
2. 将25毫升的吡咯溶液倒入烧杯中。
3. 将蚀刻 ITO 玻璃与万用表连接, 将滑块浸入吡咯溶液中。
   1. 确保0Ω电阻的一侧朝向铂网参考电极。
4. 使用万用表 (电流控制在3毫安/cm² 4 小时) 上, 应用电流启动 ITO 表面上的聚吡咯电镀。
5. 将 ITO 玻璃从万用表中取出, 并在 DI H₂O 中洗涤电镀-聚吡咯, 以除去残留表面活性剂。
6. 用剃刀刀片轻轻地将电镀聚吡咯板从 ITO 玻璃中分离出来。
   1. 在室温下贮存聚吡咯板。

4. 烷的制备

1. 使用刮刀和重量盘, 混合18克的基础剂与2克固化剂, 并倒入两个10厘米 x 8 厘米玻璃模具的混合物。
2. 使用真空室从模具中取出气泡 15-20 分钟。
3. 将模具放置在70摄氏度烤箱中3小时。
4. 冷却后, 使用平铲, 从模具中取出。

5. 制作体外电刺激室

1. 高压釜的金属板 (WxL, 2.5 厘米 x 12.5 厘米) 和流量阀在120°c 1 小时。
2. 使用会议厅幻灯片作为模板, 剪切两个片。
   注: 在细胞室内有两个相邻正方形的切口, 其中一条为细胞室的周长。另一条是该会议厅外围的轮廓。
   1. 切出内部的细胞室, 使它是方形的形状和匹配的细胞室。确保两片的整体形状是长方形的, 并与会议厅的滑动相匹配。
3. 将材料从下至上分层: (1) 金属板、(2) (不带切口)、(3) 聚吡咯板 (垂直于的)、(4) (带切口) 和 (5) 单元格室.  
4. 在完全对齐后, 将设备夹紧。
5. 切割两个60厘米的金属线, 用银糊将一根电线连接到聚吡咯板的每一端, 从腔体外凸出。确保电线足够长, 可以从设备延伸到孵化器的外部。
6. 一旦银糊固化, 加强和密封的电线连接与环氧树脂。
   1. 使用万用表记录电阻, 以确保每个腔内的应用领域相同。
   2. 植入时, 取下导线;松开细胞室和硅烷, 然后将它们与导电支架分开。植入支架的尺寸约为1毫米 x 3 毫米 x 0.25 毫米。

6. 聚吡咯上的人神经祖细胞 (hNPCs) 的电镀

1. 在紫外线照射下将组装的房间消毒2小时。
   1. 1小时后, 旋转组装腔90°。
2. 灭菌后, 将聚吡咯的表面涂上800µL 的涂层衬底, 并使基体在 5%_CO 2 为 1 h 的孵化器中的聚吡咯板上凝固。
3. 1小时后, 从室中取出上清, 用1毫升的 DPBS + 钙和镁轻轻冲洗每井。
   注意: 避免用力清洗聚吡咯表面, 因为这会导致涂层衬底脱落。
4. 使用新鲜的细胞培养基, 机械分离培养细胞用于与室从组织培养板与温和的吹打。
   注: 细胞在离解时应为 90-100% 汇合。
5. 用离心 8000 x g 收集 hNPC 颗粒5分钟。
6. 使用 hemocytometer, 在10万个单元格/cm²的卷上计数和并用重悬单元格。
7. 将10万个单元格放入每个腔室 (10万个单元格/cm²在1毫升介质中)。
8. 返回室到孵化器在37°c 在 5% CO_2.

7. 电刺激 hNPCs

1. 在将细胞放进腔室后的某一天, 使用波形发生器将电刺激应用于细胞。
2. 在刺激之前, 从每个腔室中清除旧介质, 并补充800µL 的新鲜培养基。
3. 在媒体被改变后, 将分庭放回孵化器, 将导线从孵化器中延伸出来, 并将它们连接到波形发生器上。
4. 在±400 mV 中使用100赫兹1小时的方波信号对细胞进行刺激。
5. 在刺激以后, 去除导线和孵化室在37°c 设置的孵化器在 5% CO₂的另一天。
6. 根据制造商的协议, 进行后续的生物分析, 包括细胞活力和定量的实时聚合酶链反应 (qRT PCR)。

8.体内聚吡咯植入术

1. 对 T 细胞缺损的成年雄性裸鼠 (NIH-RNU 230, 30 克) 进行远端大脑中动脉 (dMCA) 闭塞中风模型, 如前所述²。一周后 dMCA 闭塞进行植入术。
2. 在手术前的某一天, 将氨苄西林 (1 毫克/毫升) 给笼水中的老鼠。
3. 麻醉在诱导腔内使用 0.5-3% 毫克/千克的异氟醚进行吸入。
4. 通过缺乏脚趾捏反射反应来证实大鼠麻醉。
   1. 当动物在麻醉下, 继续监测其膜的颜色, 呼吸模式, 直肠温度每15分钟。
5. 一旦麻醉被证实, 在老鼠的眼睛上涂抹人工泪以防止干燥。
6. 通过使用无菌手套和无菌手术悬垂¹³确保在本过程中保持无菌技术。在不育的领域内保持无菌手术器械。
7. 当老鼠被麻醉时, 在左皮层上方钻一个减压。打开硬脑膜。
   1. 用微薄的外科针从大脑中取出硬脑膜。
8. 将导电支架从体外系统移植到大鼠皮层。
   注: 对于我们的实验, 我们在 hNPC 电镀后3天内将支架植入体外。
   1. 把植入物主要放在半影皮质内侧的中风病灶。
9. 脚手架放置后, 放置 surgicel 在植入物上以防止皮肤闭合的运动。
10. 缝合伤口闭合, 皮下注射丁丙诺啡锶1毫克/千克剂量的大鼠, 以管理与立体定向手术和 dMCA 闭塞有关的疼痛。
11. 当它恢复知觉时, 把老鼠放在康复笼里。
    1. 不要让动物在无意识的时候无人看管。
    2. 不要把动物和别人放在一起, 直到它完全获得知觉。
12. 每天监测动物的疼痛症状, 包括体重下降, 减少食物/水摄入量, 减少梳理/蓬乱大衣, 减少/增加自发活动, 异常姿势, 脱水/皮肤 tenting, 凹陷的眼睛, 隐藏, 自我残害,快速呼吸, 张开嘴呼吸, 抽搐, 颤抖, 震颤和发声。
    1. 每天监视动物, 直到看起来他们正在进食、饮酒、梳洗、发胖;然后每周体重增加。
13. 早期 euthanization 通过 co₂吸入和二次确认 euthanization (以确保动物不会复活, 由于正常的氧气供应后 CO₂吸入) 将发生的任何动物似乎不吃, 饮酒和开始手术后体重增加;出现在痛苦中;或似乎无法完成的行为测试, 由于大于预期的运动皮质赤字。

结果

图 1中显示的示意图代表了 hNPCs 和潜在下游应用程序的电刺激的总体工作流。目前干细胞治疗的一个局限是干细胞暴露在一个严酷的后移植环境中, 包括炎症和缺血性疾病。这些困难的条件可能限制其治疗效果^14,15。使用导电支架保护 hNPCs 免受这种环境的侵害, 可以通过电预处理增加 hNPCs 治疗的益处。这种...

讨论

越来越多的证据表明干细胞作为一种新型中风疗法的前景。这一承诺导致了一项重大的努力, 以推进干细胞治疗到床边至少40正在进行或完成的临床试验。中风病病理学提供了一种独特的神经紊乱, 使自己的干细胞治疗, 因为在急性侮辱后, 没有神经退行性的过程, 以防止恢复。干细胞增强脑卒中恢复的确切机制尚不清楚。血管生成、synaptogenesis 和突触重塑都被证明是重要的。当移除 BDNF 和 THBS-1 等?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706