银纳米粒子改性多壁碳纳米管的合成及其抗菌活性和细胞毒性的评价

摘要

本研究通过多壁纳米碳纳米管的酸性氧化和银纳米粒子随后的还原沉积合成了抗菌纳米材料。用制备的纳米材料进行抗菌活性和细胞毒性试验。

摘要

本研究采用水硫酸溶液处理多壁碳纳米管 (MWCNTs), 形成氧基功能基团。银 MWCNTs 是由还原沉积银从 AgNO₃的水溶液中氧化 MWCNTs。鉴于碳纳米管的独特颜色, 不可能将其应用于最小抑制浓度或线粒体毒性检测, 以评估毒性和抗菌性能, 因为它们会干扰化验。测定了银 MWCNTs 的抑菌区和最低杀菌浓度, 并利用台盼蓝法测定了其毒性和抗菌性能, 不影响碳纳米管的颜色。

引言

这项研究的最终目的是制造环境友好的抗菌纳米材料, 从而抑制形成生物膜的细菌的生长。这些抗菌纳米材料有可能克服常用化学药品或抗生素化合物的毒性和耐药性问题。生物膜是由多糖、蛋白质、核酸和血脂组成的水合胞外高分子物质 (EPS),^1,2。生物膜防止外来物质的侵入, 帮助细菌大力生长^3,4。生物膜引起气味和慢性传染性疾病^5,6。例如, Methylobacterium通过附着在水始终存在的地方或难以确保连续进行细菌根除 (如空调热交换器、淋浴室和医疗设备) 而生长。这些类型的生物膜引起气味和慢性传染性疾病^5,6。

通常, 化学物质或抗生素化合物用于抑制形成生物膜的细菌的生长。抗生素耐药性细菌的出现和对化学品的体内安全性的担忧促使人们需要开发新材料, 以防止生物膜的形成和抑制细菌的生长。

在本研究中, 合成了抗菌纳米材料, 无抗生素耐药性和毒性。银是一种众所周知的抗菌物质, 最近的纳米和纳米技术的发展导致了对金属纳米粒子的抗菌作用的积极研究^7,8。最近的研究报告说, 纳米粒子的体积小, 体积比大, 导致抗菌活性增加^9,10,11。

本文介绍的纳米材料将银纳米粒子与增强的抗菌性能和碳纳米管结合在一起, 从而增加了单位体积的表面积。制备的银纳米粒子-碳纳米管复合材料具有很大的抗菌性能和对人体和动物细胞的最小毒性。以前研究中的合成过程使用了诸如 NaBH₄、甲酰胺、甲基酰胺和肼等有害还原剂。这个过程很复杂, 很危险, 而且耗时。这里报告的合成过程使用乙醇作为一种显著减少危险的还原剂。

测定了银 MWCNTs 的抑菌区和最低杀菌浓度;用活/死和台盼蓝法测定毒性和抗菌性能。最低抑制浓度 (MIC) 和线粒体毒性 (MTT) 检测没有执行, 因为不寻常的颜色的碳纳米管, 这将干扰的化验。最后, 确定了在不影响哺乳动物细胞的情况下, 防止Methylobacterium生长的最小浓度。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. MWCNT 氧化

1. 测量 30-50 毫克的 MWCNT 成一个50毫升的瓶子。缓慢地添加8毫升的 H₂, 所以₄: HNO₃解决方案 (90% 初始浓度, 3:1 卷/卷) 的吸管与1毫升吸管提示。
   注意: 此制剂必须在化学油烟机中进行。
   1. 允许30分钟的放热反应完成。
2. 油脂实验溶液在 60-80 °c 和 160 W 为1小时, 直到 MWCNT 安定在瓶的底部。
   注意: sonicator 的水位应该低于瓶子的顶端, 这样水就不会被引入瓶子里。
3. 把溶液转移到离心管上。
   1. 用微, 加入30毫升蒸馏水滴到 MWCNT-COOH 溶液中。
      注意: 在加蒸馏水的过程中会发生强烈的放热反应。慢慢加入蒸馏水, 让时间冷却。
4. 离心机的 MWCNT-COOH 溶液在 1.2万 x g 和室温15分钟。
   注意: 在操作离心机时, 要确保离心机保持平衡, 在取样管对面放置一个与重量相同的管。
5. 用吸管和1毫升吸管端取出上清液。添加5毫升乙醇与吸管和1毫升吸管提示。用额外的 pipetted 乙醇冲洗瓶子的壁。离心溶液在 1.2万 x g 和室温15分钟。
   1. 用 ph 纸测定上清液的 ph 值。重复洗涤和离心, 直到上清液 pH 值为中性。
6. 移除所有上清。加入1毫升蒸馏水, 在溶液中均匀沉淀和分散 MWCNT-COOH。冷冻干燥溶液在-60 摄氏度真空下直到干燥。

2. 纳米银在 MWCNTs 上的沉积

1. 将10毫克的 MWCNT-COOH 在50毫升圆锥管中, 稀释30毫升蒸馏水。油脂实验溶液在60°c 和 160 W 为 1 h。
2. 在50毫升圆锥管中放置6毫升的 0.1 N AgNO₃ , 然后用18毫升蒸馏水稀释。油脂实验溶液在60°c 和 160 W 为 1 h。
   警告: 添加 AgNO₃与 MWCNTs 总质量的比例, 使 Ag 的总质量不超过20%。
3. 在添加 AgNO₁后, 将 AgNO₃解决方案添加到带吸管和1毫升吸管尖端的 MWCNTs 溶液中, sonicating 60 摄氏度和 160 w 的混合物继续 sonicating 3 h。
4. 离心溶液在 1.2万 x g 和室温15分钟, 并清除上清。离心溶液, 并去除上清液两次。
5. 将1毫升蒸馏水添加到银 MWCNTs 混合物中, 在溶液中均匀地分散沉淀。添加5毫升乙醇, 并允许反应在室温下进行1小时。
6. 离心溶液在 1.2万 x g 和室温15分钟, 并清除上清。
7. 用 ph 纸测定上清液的 ph 值。重复洗涤和离心, 直到清液 pH 值为中性。
8. 将1毫升蒸馏水加入银 MWCNTs, 均匀分散在溶液中。冷冻干燥溶液在-70 摄氏度真空下24小时。

3. 抑制试验区

1. 将18.12 克的 R2A 琼脂和1升的蒸馏水混合在烧瓶中。在121摄氏度的蒸压釜中消毒混合物15分钟。
2. 允许凝胶在室温下冷却。在硬化前, 在培养皿中放置10毫升凝胶以制备固体培养基。
3. 在固体培养基上放置100µL 细菌。使用吊具将细菌传播到固体介质中。
   注意: 此程序必须在用酒精灯点燃的化学油烟罩中进行。
4. 在30摄氏度的盘子里孵化48小时。
5. 将3.12 克的 R2A 汤与1升的蒸馏水混合在一个烧瓶中。在121摄氏度的蒸压釜中消毒混合物15分钟。
6. 使用循环和针将生长的菌落转移到液体培养基中, 在 180 rpm 和30摄氏度的孵化器中孵化。
7. 以每小时 600 nm 的紫外分光光度法记录 OD (光学密度) 值以测量细菌生长。
   注: R2A 琼脂是用于本试验, 而不是标准的米勒-韩丁琼脂, 因为 R2A 是首选琼脂生长的Methylobacterium.
8. 在培养皿中放置10毫升准备好的 R2A 琼脂, 准备下琼脂。
   1. 将3.12 克 R2A 汤和8克琼脂和1升蒸馏水混合在一起。在121摄氏度的高压釜中消毒混合物15分钟. 在底部琼脂上放置10毫升的凝胶。
9. 用微在无菌纸盘上加载50µL 银 MWCNTs 溶液。
   1. 在紫外光照射下, 在真空室中干燥和消毒银 MWCNTs 样品30分钟。
10. 在琼脂上放置银 MWCNTs 样品。
11. 在30摄氏度孵育琼脂盘48小时。
12. 抑制¹²的度量区域。
    注意: 引用中包含用于软件的说明。

4. 抗菌试验

1. 重复步骤3.1 至 3.7, 准备细菌培养。
2. 在最大 OD, 接种100µL 细菌成3毫升新鲜液体培养基与吸管和100µL 微吸管提示。
3. 在15毫升圆锥管中准备五50µL 的控制溶液样品。将以下各管加入: 1) 甲醇;2) 1000 µg/毫升 MWCNT COOH;3) 50 µg/毫升银 MWCNTs;4) 40 µg/毫升银 MWMWCNTs;5) 30 µg/毫升银 MWCNTs。
4. 孵育在180转每分钟和30°c, 直到控制是最大地活跃的由紫外分光光度的决定如上文所述。
5. 测量每个样品的 OD 值并计算麦克风浓度。OD 值与样品汤中的细菌细胞数量直接相关。
6. 将培养出来的细菌传播到固体培养基上。
7. 在30摄氏度孵化出48小时的菜肴。
8. 计数细菌菌落数和测量 CFU 值以确定抗菌活性¹²。
   注意: 引用中包含用于软件的说明。

5. 生存能力测定

1. 从孵化器中取出培养细胞后, 吸入培养基, 用5毫升 PBS 的滴状洗涤清洗三次。
2. 在 PBS 中加入1毫升的胰蛋白酶-EDTA, 对洗涤后的细胞进行1分钟的吸入。
   1. 点击盘子移除卡住的细胞。
3. 添加5毫升的 DMEM (Dulbecco 的改良鹰的培养基), 然后取出细胞。将样品离心 200 x 克3分钟, 取出上清液。
   1. 加入1毫升的 DPBS 和混合。
   2. 用自动计数机对解决方案的10µL 中的单元格进行计数。
      注意: 使用的单元计数机的说明包含在引用¹³中。
4. 在含有 DMEM 溶液的六井板中, 每井放置 1 x 10⁵的 AML12 细胞。培养基中含有 10% (v/v) 胎牛血清和1% 无菌抗生素。
5. 在 5% CO₂/95% 空气环境中, 在37摄氏度孵育 8-12 小时的孵化板。
6. 用吸尘口从水井中吸取上清。
   1. 添加每个样本包括控制, NMS-二甲基亚砜) 和30-40 µg/毫升银 MWCNT 到1毫升的 DMEM。
   2. 37°c 在 5% CO₂/95% 空气环境中孵化 8 h。
7. 清除上清液, 用5毫升的 PBS 冲洗样品。
8. 添加1毫升准备活/死套件 (20 µL 2 毫米 EthD-1 与5µL 4 毫米 calcein 是在亚砜在10毫升 PBS) 滴向细胞。
9. 在室温下孵育 30-45 分钟或37摄氏度, 用标准荧光显微镜在100X 或300X 测量荧光。

6. 台盼蓝检测

1. 根据步骤5.1 通过以上5.6.2 准备样品。
2. 移除上清。
3. 1毫升 1x DPBS 和醒酒的洗涤板。
4. 添加1毫升的胰蛋白酶到板块和孵化3分钟, 以分离细胞从文化。用细胞培养基冲洗板材, 收集细胞。将收集到的细胞放置在15毫升的试管中。
5. 离心管在 200 x g 和4°c 为3分钟。
6. 放弃上清。将1毫升新鲜培养基添加到细胞颗粒中, 重新分散细胞。
7. 添加10µL 的台盼蓝与10µL 分散细胞和计数的细胞与自动计数机。
   注: 所使用的细胞计数机的说明包括在参考资料中。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

透射电镜 (TEM) 图像确认银 MWCNTs 的形成 (图 1A 和 1B)。表面电荷的变化证实了它们的成功合成。计算了 MWCNTs 上沉积的 Ag 粒子的大小 (图 1C)。平均微粒大小是大约3.83 毫微米。该合成银 MWCNTs 的 XRD 模式显示在图 1D中。峰值在 20-30°对应于 MWCNT;其余的峰值对应于 Ag。抗菌活动数据显示在

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

在这里, 我们报告了一个简单的方法来制备 MWCNTs 与沉积银纳米粒子。这种含银的纳米材料显示了大量的抗菌活性和极少的潜力, 不受控制地吸收银纳米粒子在体内。我们证明, 30 µg/毫升的合成银-MWCNTs 是一个有效的水平的抗菌活性的Methylobacterium. , 对哺乳动物肝细胞的毒性微乎其微。虽然在商业部门扩大之前需要对银 MWCNTs 进行额外的改进和生物安全评估, 但使用乙醇作为减少剂可以帮助生?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 N silver nitrate	SIGMA-ALDRICH	1090811000
Carbon nanotube, multi-walled	Tokyo Chemical Industry Co., LTD	308068-56-6
R2A agar	MBcell	MB-R1129
R2A broth	MBcell	MB-R2230
Methylobacterium spp.	KCTC	12618	from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit	ThermoFisher SCIENTIFIC	R37601
AML12			from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC	ATCC	PCS-800-011
TEM	JEOL	JEM-2100F
XRD	Rigaku	D/MAX 2500	Cu K photon source (40kV, 100mA)
JuLI Br	NanoEnTek	JULI-BRSC