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摘要

我们在这里提出一个标准免疫技术 (CFSE 染色的应用), 旨在快速监测佐剂介导的细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 生成在体内.这种对 CTL 容量的快速估计有助于开发预防性疫苗, 防止细胞内病原体和治疗性癌症疫苗的发展。

摘要

对现代分单元疫苗的评估表明, 中中和抗体的产生是重要的, 但不足以辅助选择。因此, 迫切需要具有体液和细胞免疫刺激能力的佐剂, 能够促进细胞毒 T 淋巴细胞 (CTL) 反应。因此, 对诱导交叉启动并随后增强 CTL 生成的佐剂候选者的忠实监测是疫苗开发的关键步骤。在这里, 我们提出一个方法的应用, 使用 SIINFEKL 特定 (OT) T 细胞监测模型抗原卵清蛋白 (卵)在体内的交叉呈现, 在不同的佐剂候选者在场。该方法是一种快速试验, 用于选择具有最佳交叉启动能力的佐剂。CD8+ T 细胞的增殖是交叉引发的最有价值的标志, 同时也被认为是佐剂诱导的交叉表达的相关性。这一特点可以评估在不同的免疫器官, 如淋巴结和脾脏。CTL 生成的程度也可以监测, 从而对局部 (引流淋巴结主要) 的性质或系统性反应 (远端淋巴结和/或脾脏) 有深入的了解。这项技术进一步允许对检测药物进行多次修改, 以抑制特定的交叉表达通路, 并提供了可能用于不同品系的常规和转基因小鼠。总之, 我们在这里提出的应用将是有用的在工业或学术界的疫苗实验室开发或修改疫苗研究和发展的化学佐剂。

引言

细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 诱导疫苗是为抗击某些类型的癌症而开发的关键治疗措施1。CTL 对预防性疫苗对细胞内病原体2也很重要。此外, ctl 是少数的免疫防御机制之一的功能活跃的风险人群, 如新生儿3,4谁也依赖 CTL, 以抗击早期生命感染5。在这方面, 与不引起 CTL 反应的佐剂一起研制的呼吸道合胞病毒疫苗 (明矾) 导致6婴儿感染严重并发症导致的疫苗完全失败。免疫接种的这些负面影响可以通过 CD8 细胞反应 7逆转。我们以前已经证明, 一些干扰素基因 (蜇) 激动剂诱发的主要细胞因子 (I. 干扰素) 对这些佐剂8产生的 CTL 反应至关重要, 部分是通过测量在疫苗接种后的 T 细胞, 并将这些结果作为在延长接种计划9中观察到的 CTL 诱导能力的量度。用羧基琥珀酰亚胺酯 (CFSE)染料稀释法测定野生型 (CD8) C57BL/6 受体小鼠中的 OT I. T 细胞的增殖是一种对疫苗佐剂能力的稳健估计, 可产生SIINFEKL 的交叉启动 (卵清蛋白的免疫主导肽, 卵)。这种技术的变异被广泛用于评估 CD8 和 CD4 T 细胞的增殖. 例如, 它已被用于没有选定的细胞因子 (高鼠) 或测量疫苗的功效后, 抗原召回的动物。我们设计了一个简短的协议 (4 天的实验), 在 CFSE 染色的 CD8+ T 细胞被动转移后, 皮下 (南卡罗来纳州) 免疫由一剂量50µg 的无内毒素卵子辅以测试佐剂被管理(图 1)。疫苗接种后48小时随访结果提供了可靠的证据证明佐剂产生 CTL 反应的能力。通过这一策略, 可以评估免疫后引流淋巴结局部免疫反应的效力, 以及测量脾脏 (或远端淋巴结) CTL 活动的反应程度。

研究方案

所有在这项研究中使用的老鼠都是从 C57BL/6 的背景。所有的动物都被保存在无病原体条件下。所有实验都是根据德国动物保护法 (TierSchG BGBl) 的规范进行的。我是 1105;25.05.1998), 并获下萨克森动物实验伦理学委员会和国家办事处 (下萨克森国家消费者保护和食品安全办公室) 批准, 许可证号为 33.4-42502-04-13/1281 和162280。

1. CFSE 细胞染色及移植

注意: OT I 小鼠是 transgenically 生成的动物, 表达 T 细胞受体 (TCR) 与固定α和β链, 共同承认的免疫优势肽的卵子, SIINFEKL10,11。结果, 这些小鼠有相当大数量的 SIINFEKL 特异性 CD8+ T 细胞 (97%)12 , 当比较正常或卵免疫小鼠 (≤ 1%)13。

  1. Thy1a (Thy1.1 ) 等位基因表达 T 淋巴细胞特异性的 CD8 t 细胞的分离
    1. 弄死6-9 周大鼠, 由 CO2吸入, 其次为颈椎脱位14。解剖脾脏和主要淋巴结 (腹股沟, 腋窝和颈部对只) 通过切割皮肤与外科剪刀, 从身体分离的皮肤与外科钳和镊子的帮助下, 并将其放置在培养皿 (60 x 15 毫米) 每个包含一个100µm 孔网杯, 用于组织研磨和细胞释放。
    2. 在3-5 毫升完整的 RPMI 培养基 (RPMI 1640, 10% 伏/v FCS, 100 U/毫升青霉素, 50 µg/毫升链霉素) 保持在冰上的培养皿 (每一个网杯)。
    3. 在注射器柱塞或相似的不育仪器的帮助下捣碎器官 (不需要事先切开) 并且收集导致的单细胞悬浮在15毫升离心机管子。
    4. 离心机细胞悬浮在 300 x g 10 分钟在4°c。放弃上清。将10毫升的冷 PBS 中的细胞通过离心和溶解, 在氯化铵缓冲液1毫升/脾中重新悬浮颗粒 (ACK 缓冲器, 商用), 将红细胞从脾脏中冲洗出来。在冰上孵化细胞1.5 分钟, 然后用离心法 (如前所做) 用10毫升的冷 PBS 冲洗细胞。
    5. 在1毫升的 PBS (pH 7.2) 中, 用5% 胎牛血清进行磁隔离, 将颗粒重新悬浮在同一管中。
  2. 要进行磁隔离, 请根据制造商指令或已发布的协议15, 使用磁性隔离套件进行 CD8+ T 细胞的阴性选择。
  3. 要执行 CFSE 染色, 首先计算使用自动单元计数器 (粒子计数器) 从 OT I 小鼠获得的 CD8+ T 细胞数。着色 1-5 x 107细胞/毫升在1-5 毫升的容量与5µM CFSE 在 PBS 为7分钟在37°c, 保护免受光在15毫升猎鹰管。
  4. 将相同体积 (1:1) 的胎牛血清添加到细胞中, CFSE 染色, 并在37摄氏度的保护下, 将其孵化7分钟。用10毫升 PBS 清洗细胞两次。
  5. 使用自动单元格计数器计数单元格。将细胞数设置为 3-5 x 107细胞/毫升的 PBS, 以注射 3-5 x 106细胞/小鼠在100µL 静脉 (静脉注射) 通过尾静脉。
  6. 进行尾静脉注射, 将小鼠固定在适当的抑制剂。加热后区和尾部的小鼠被注射使用红光灯, 放置在20至25厘米以外的小鼠1-3 分钟, 以允许尾部静脉舒张。
    注意: 这有助于缓解静脉检测和细胞悬浮的管理。
  7. 确保 (与鼠标和灯之间的手), 它是不太热的老鼠, 当尾巴静脉清楚可见, 进行注射。用25口径针16的1mL 注射器将细胞注入侧或背尾静脉。

2. 免疫接种 (游离卵子 +/-佐剂)

  1. 将小鼠与 OT I 细胞 (步骤 1.7,图 1) 移植到麻醉室中, 用麻醉机14在氧气中管理异氟醚。
  2. 当老鼠在麻醉下完全睡着的时候, 把它从房间里拿出来, 在臀部 superficialis (侧下背部) 的地方剃掉小鼠的皮毛, 用电动理发机, 以执行干净的注射。对应用领域有很好的看法。
  3. 注射50µL 的疫苗, 在被剃光区域使用25口径针。

3. 流式细胞术分析中淋巴细胞和染色的分离

  1. 淋巴细胞与脾的分离
    1. 弄死联合2吸入免疫接种小鼠, 其次为颈椎脱位。
    2. 提取引流和远端淋巴结和脾脏, 并将其放置在单独的培养皿中, 含有100µm 孔网杯用于组织研磨和细胞释放。按照步骤1.1.2 通过1.1.3。
    3. 离心后醒酒上清液, 并在相同体积的残余 PBS 中重新悬浮细胞颗粒 (约100µL)。
  2. 流式细胞术分析染色
    1. 在一个15毫升离心管准备一个主混合含有染色抗体的浓度在表 1中, 从而产生2x 浓缩染色混合。准备足够数量的主混合, 每样有100µL。混合细胞和主混合1:1 和孵化它在 4°c 30 分钟。
      注: 每个样品的最终染色量应为200µL (100 µL 细胞颗粒 +100 µL 抗体主混合)。
    2. 1.1.3 中描述的离心两次清洗细胞, 增加10毫升的 PBS, 两次。
    3. 在 0.5-1 毫升的 PBS 中重新悬浮染色细胞, 用于采集和转移悬浮液, 用于流式细胞仪管。总是把样品放在冰上, 以免被光线所保护。

4. 流式细胞仪

  1. 始终使用70-100 µm 过滤器预先筛选单元格样本。
  2. 为表 1 (珠子或细胞) 中详细的显影准备单一染色补偿控制。
    注: 应在细胞仪或分析软件17、18、19中进行补偿, 并应用于所有样品。
  3. 按照图 2中描述的浇口策略进行。简要地, 门人口在正向散射高度与正向散射区域 (图 2A), 并且再侧散布宽对侧散布区域 (SSA,图 2B) 为了排除双峰。
  4. 通过绘制 BV 650 (自动荧光) 与 FITC (CFSE) 来区分来自高自动荧光细胞的真实 CFSE 染色细胞, 从图 2B中进行填充。包括用与 BV 650 共轭的抗体染色的珠子或细胞纳入补偿控制。这一剧情 (图 2C) 的 BV 650 vs FITC 是用来门 CFSE 染色细胞。
  5. 从图 2C中的 Pe-Cy7 (Thy1.1-CD90.1) 与 APC (CD8) 进行比较, 以区分来自捐赠者和受体小鼠的细胞。
    注: 从 OT I. 捐献小鼠获得的细胞为 Thy1.1+ (CD90.1), 而 C57BL/6、受体) 小鼠派生细胞为 Thy1.2+ (CD90.2) (图 2D)。一些实验室有 Thy1.2 背景下的小鼠和 C57BL/6 (Thy1.1)。在这种情况下, 你必须使用抗体对抗 Thy1.2 细胞门。
  6. 通过在 450 (CD4) vs APC (CD8) (图 2E) 的栅极上绘制 Thy1.1+填充的 CD8+细胞。
  7. 通过使用显示 CFSE (FITC, 530/15 通道-蓝色激光) 的 CD8+单元格的直方图显示, 在图 2E中显示填充门, 通过将强度从 102增至水平处, 将激增的人口包括在内不分割控制人口是 (强度 ~ 105, 取决于 CFSE 染色的功效和流量式细胞仪的电压设置) (图 2F)。
  8. 制作一个额外的门 (不显示在图2中) 绘制 FITC 与 L/D 标记 (450/20 通道, 紫外线激光), 以评估死细胞平行的扩散评估。
  9. 从流式细胞仪的样本中获取至少5000项补偿控制和10.000 事件 (门 E,图 2) 的事件。在低或中流运行细胞仪 (不超过20.000 事件/秒的流速)。

结果

为了测试使用不同佐剂 (ADJ1 和 ADJ2) 的治疗方法, 我们通过流式细胞仪测量过继转输转移的 CD8+ T 细胞的增殖来评估 CTL 的生成能力 (图 2)。为此, 我们以前从引流淋巴结和脾脏中分离出细胞 (表 1)。通过测量淋巴结和脾脏中 CD8+ T 细胞的增殖, 我们能够证实在引流淋巴结中 ADJ2 的 CTL 生成能力 (图 3) 与 A...

讨论

现代疫苗是理想的 composedof 纯化抗原和佐剂, 有可能添加一个交付系统, 如脂质体, 病毒样粒子, 纳米粒子或活载体。设计疫苗的一个关键方面是根据临床需要选择合适的佐剂。部分的范围可能涉及倾向于体液与细胞免疫应答 (或两者), 选举局部与系统性免疫应答 (或两者), 以及这种疫苗必须在目标人群中产生的记忆。辅助评价的一个关键方面是迅速确定其产生 CTL 的能力。本文提出了一种基于已知?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢我们的技术助理: U. Bröder 和 h. Shkarlet, 他在实验过程中帮助我们。这项工作部分是由欧盟赠款 (UniVax, 601738 号合同和 TRANSVAC2, 730964号合同) 和亥姆霍兹协会赠款 (海-IDR) 资助的。资金来源不影响研究设计, 生成手稿或决定提交出版。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
BD LSR Fortessa Cell AnalyzerBDSpecial OrderFlow Cytometer
CFSEMolecular ProbesC34554Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation KitBiolegend480007Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitationMolecular ProbesL23105Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7eBioscience25-0900-82antibody
APC anti-mouse CD8a AntibodyBioLegend100712antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4BD740007antibody
Z2 coulter Particle count and Size AnalyzerBeckman Coulter9914591DACell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg)Hyglos(Germany)321000Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylonCorning352360Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample VialsBeckman Coulter899366014Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2)Harlan (Rossdorf, Germany)Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)Harlan (Rossdorf, Germany)Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubesFischer (Corning)14-959-5Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubesFischer (Corning)05-527-90Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL)Fischer (Gibco)20-012-027Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp)Dirk Rossmann GmbH (Germany)405096Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane)Abbott Laboratories (USA)5260.04-05.Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 AbsorberParkland ScientificV3000PKIsoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 mediumGibco (distributed by ThermoFischer)11-875-093Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)Gibco (distributed by ThermoFischer)15-140-148Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco)Gibco (distributed by ThermoFischer)10082147Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml)Gibco (distributed by ThermoFischer)A1049201Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri DishesNunc (distributed by ThermoFischer)15034060 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump FilterCellTrics (Sysmex)04-004-2317CellTrics® 50 μm, sterile

参考文献

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