评估溶酶体碱化在活的秀丽线虫中的肠道

摘要

用 pH 敏感的生命染料 5 (6)-羧基-2 ', 7 '-dichlorofluorescein 双乙酸 (cDCFDA) 研究了在线虫的肠道中溶酶体酸度损失的分步指南

摘要

线虫秀丽线虫(C. 线虫) 是一种广泛用于研究长寿和发育途径的模型系统。这种研究通过动物的透明性、向前和反向基因检测的能力、产生荧光标记蛋白的相对容易性以及荧光染料的使用来促进, 它们可以杏仁到早期胚胎或纳入其食物 (大肠杆菌菌株 OP50) 标签细胞器 (例如9-二乙基-5 H 苯并 (a) phenoxazine-5-一和 (3-{2-[(1 H, 1 ' H-22 '-bipyrrol 5-基 kappaN (1)) methylidene]-2 H-咯-5-基 kappaN}-N-[2-(二甲基氨基) 乙基] propanamidato) (difluoro) 硼)。在这里, 我们提出使用荧光 pH 敏感染料, 染色肠道溶酶体, 提供了动态, 生理变化的溶酶体酸度在活蠕虫的视觉读数。该协议不测量溶酶体 pH 值, 而是旨在建立一个可靠的方法来评估溶酶酸度的生理相关变化。cDCFDA 是一种细胞 permeant 化合物, 转化为荧光荧光 5-(和-6) 羧基-2 ', 7 '-dichlorofluorescein (cDCF) 水解后, 细胞内酯。质子内溶酶体陷阱 cDCF 在这些细胞器中, 在那里积聚。该染料由于其4.8 的低碱性, 已被用作酵母中的 pH 传感器。在这里, 我们描述了使用 cDCFDA 作为食物补充, 以评估肠道溶酶体的酸度在线虫.这种技术允许检测活动物中的碱化溶酶体,并具有广泛的实验应用, 包括对衰老、自噬和溶酶合成的研究。

引言

蛋白质团聚体的出现被广泛认为是真核细胞老化的标志^1,2,3, 和其形成是细胞衰老的原则驱动因素^4,5,6,7. 越来越多的证据表明, 随着细胞老化, 蛋白质分解代谢被削弱, 导致蛋白质聚集的增加。衰老细胞蛋白质水解的崩溃涉及自噬⁸的损伤以及蛋白酶介导的蛋白质降解⁹。最后, 在旧细胞中增加了不可逆转的蛋白质氧化, 进一步损害了蛋白质的分解代谢¹⁰。

自噬最初被认为是一个非选择性的过程, 以大量降解受损的蛋白质, 但最近的研究表明, 自噬是高度选择性的分解代谢的蛋白质聚集和功能失调的细胞器, 不可通过其他蛋白质清除机制¹¹进行降解。在自噬过程中, 受损和聚集的蛋白质被隔离成一个叫做 autophagosome 的双膜囊泡。这个 autophagosome 然后与称为溶酶体的酸性细胞器融合, 导致 autophagosome 货物的降解¹²。溶酶体代表自噬性通路的终点, 参与不同的细胞过程, 如膜修复、转录控制和养分传感;突出它们在细胞稳态中的集中作用 (在 ref 13 中复习)。一些研究表明, 年龄依赖性的溶酶体功能下降与各种神经退行性疾病的相关性为¹³。一贯地, 在旧的细胞中恢复溶酶函数可以延缓衰老相关表型的出现,^14,15。对 intralumen 环境组成的研究表明, 早期细胞溶酶酶功能的崩溃不是由于溶酶酶蛋白酶¹⁶的产生而减少的。另外, 有人建议, intralysosomal 酸度的损失, 它的酶活性的一个关键要求, 可能是在溶酶介导的蛋白质降解¹⁷的下降。为了能够探索这一假说, 必须开发试剂和协议, 以一种可复制和一致的方式来探测活细胞中溶酶体 pH 值的动态变化。

线虫的肠道是蠕虫的主要代谢组织, 是系统性稳态和寿命的重要调节因子。我们已经开发了测定蠕虫肠道溶酶体的酸性变化的检测方法, 以确定溶酶介导的蛋白质水解如何导致衰老。虽然以前在线虫中使用了 pH 敏感的显影标记肠道溶酶体, 但还没有努力建立一个成功的协议, 可以检测溶酶体 pH体内的小增加¹⁸.在这里, 我们提供了一种协议, 可用于检测C. 线虫肠道细胞中溶酶体酸度的损失, 使用一种简单而方便的喂养协议, 将 pH 敏感的荧光 (cDCFDA) 纳入 OP50 食品中。

研究方案

1. 染色和图像肠道溶酶体

1. OP50 种子线虫生长培养基 (NGM) 板
   1. 根据建议的协议¹⁹准备 NGM 板, 并允许在室温下将密封板干燥2天。
   2. 将 OP50 细菌接种到无菌 Luria 汤 (磅) 汤中, 在37摄氏度或36小时的水浴中生长, 或直到外径介于0.2 和0.4 之间。避免使用细菌培养 > 1 或 od < 0.2。
   3. 一旦 NGM 板干燥, 将一滴 (~ 30 µL) 的 OP50 接种到板的中心, 然后把下降到一个补丁大致是2厘米 x 2 厘米的大小。
      注: 任何剩余的 OP50 接种可以储存在4摄氏度, 长达一个月。
   4. 在接种干燥后反转 OP50 板 (大约10或15分钟), 然后将37摄氏度的板材孵化为36小时。
   5. 36小时后, 从孵化箱中取出盘子, 储存在4摄氏度, 直到以后使用。
      注: 板材应在4摄氏度的1月内良好。
2. 补充 cDCFDA 到 OP50
   1. 在 OP50 板上补充 cDCFDA, 在二甲基亚砜 (亚砜) 上制备10毫米 cDCFDA 的工作库存。保持 cDCFDA 解决方案免受光照和存储在-20 摄氏度后使用。
   2. 轻轻地将100µL 10 毫米 cDCFDA 溶液放到2厘米 x 2 厘米 OP50 贴片的表面, 这样整个贴片都被 cDCFDA 均匀覆盖。
      注意: 这是非常重要的, 整个补丁的 OP50 覆盖 cDCFDA。如果需要, 使用多达150µL 的 cDCFDA 为每个板块。cDCFDA 解决方案也必须不超出 OP50 补丁的边界范围, 因为从 OP50 修补程序流出的任何 cDCFDA 不会被纳入食物中, 而且会导致染色强度降低。
   3. 将 OP50 板放在工作台顶部的一个黑盒子里, 直到所有的 cDCFDA 溶液都被吸收到细菌斑块 (通常约25到30分钟)。
3. 使用 cDCFDA 染色蠕虫
   1. 一旦 cDCFDA 完全渗透到 OP50 补丁, 每板放置不超过20蠕虫和孵化的板块反转在20°c 至少14小时。
      注意: 建议将 cDCFDA 板放在不透明的盒子中, 以尽量减少光的照射。
   2. 为了控制实验之间的摄入差异和规范 cDCFDA 信号, (推荐) 与 3-{2-[(1 H) 的 co 染色, 1 ' H-22 '-bipyrrol 5-基 kappaN (1)) methylidene]-2 H-咯-5-基 kappaN} N [2-(二甲基氨基) 乙] propanamidato) (difluoro) 硼 (2.5 µL 的新鲜制成的1毫米溶液), acidotropic 弱胺染料, 其荧光主要是非变异的酸性 pH 谱 (参见材料表的常用试剂名称)。
      注意: 不要将蠕虫染色少于14小时, 因为这可能会提供不充分的 cDCFDA 染色强度, 并对溶酶体 pH 值作假解释。
4. 准备用于显微镜的幻灯片
   1. 将两条带标签的磁带贴在平滑的平坦表面上, 如镜像 (图 1), 其间隔约为3英寸。
   2. 将镜面表面涂上防水喷雾剂, 并擦拭多余液体。
   3. 熔融2% 琼脂糖 (溶解在蒸馏 H₂O), 直到完全液化, 然后在两条胶带之间放置一个50µL 滴琼脂糖, 用显微镜滑动迅速覆盖下降, 这样, 幻灯片垂直于带磁带。在琼脂糖凝固后, 在滑块下形成一个圆形垫, 翻转滑块, 将10到15µL 的5mM 钠叠氮化物 (NaN₃) 添加到琼脂糖垫上。
      注意: NaN₃是一种细胞色素 C 抑制剂, 当用于低浓度时, 可逆 anesthetizes 蠕虫, 以便它们在成像过程中不会移动。
   4. 从 OP50 板中提取蠕虫补充 cDCFDA, 并将其转移到一个干净的 NGM 板没有任何 OP50。允许蠕虫移动大约几秒钟, 允许大部分 OP50 从蠕虫表面移除, 然后将蠕虫转移到含有5毫米叠氮化钠的琼脂糖垫上。
   5. 立即用盖子滑盖琼脂糖垫。一定要轻轻地放置在不施加太多的压力, 因为这可能导致蠕虫爆裂的封面滑动。
      注: OP50 细菌辅以 cDCFDA 荧光显微镜下可视化, 因此, 重要的是要尽可能最好地清洁蠕虫之前, 把它们放在含有叠氮化钠的琼脂糖垫。如果准备6多株线虫(包括 N2、野生型控制), 最好在6批次中制备样品, 以确保蠕虫不会在琼脂糖垫上干燥。在某些菌株中, 由于来自盖板的压力, 外阴在延长的时间内开始破裂, 因此有必要进行相应的计划。
5. 共焦显微术
   注: 某些显微镜具有内置功能, 可自动增加荧光强度, 以补偿可变水平的荧光。这种显微镜对 cDCFDA 染色的蠕虫可能无法正常工作, 因为它们本身就会增加样品的荧光强度。
   1. 在标准共焦显微镜上进行成像, 使用激发/发射波长设置为 cDCFDA 488/530 nm。采用单平面图像 (不是 Z 栈) 的肠道溶酶体, 只使用集中 (最大信号强度) 的溶酶体进行强度量化。
      注: 也许是由于染料的可用性不同, 肠细胞溶酶体直接后咽后保持 cDCFDA 染色强度, 无论基因型或年龄, 因此应注意避免这些细胞的成像溶酶体。
   2. 图像的幻灯片包含2天老野生类型 N2 蠕虫首先。在这样做的同时, 调整共焦成像参数, 如激光功率, 针孔, 光圈, 以确保 cDCFDA 染色强度不饱和。
      注意: 设置了这些设置后, 不要在当天的整个映像期间更改它们。
   3. 使用60X 放大透镜捕获单个小肠平面的 1024 x 1024 像素图像 (每个蠕虫的3到4个图像)。
      注: 蠕虫的 cDCFDA 发射光谱将产生一个单一的突出峰值在520毫微米与它报告的荧光光谱²⁰, 提供一个特定的信号读数, 有别于肠道自发荧光 (图 3)。
   4. 将原始共焦图像 (. lsm 文件) 导出为每个通道的. tiff 文件。
   5. 接下来, 打开 ImageJ, 然后单击文件 |打开以打开要量化的图像文件。图像加载后, 使用 ImageJ 中的 "椭圆形状选择" 工具选择感兴趣的区域 (ROI)。
   6. 此后, 单击分析 |测量以量化该 ROI 的荧光强度。选择第4-5 不同的聚焦溶酶每个图像和计算平均相对荧光强度每个区域的利益 (ROI)。
   7. 对于每个图像, 测量溶酶体之间肠道区域的背景荧光强度。从溶酶体荧光强度值中减去背景荧光强度值。
   8. 总计, 收集大约30到50个单独规范化的价值为 cDCFDA 强度 (6 到10动物) 为每株被测试。使用这些值绘制一个框和晶须图, 使用任何适当的统计软件。
      注: 染色可能因温度、潜伏期和动物整体健康/年龄等因素的不同而有很大差异, 因此荧光强度比较仅在样品过程中与同一染色试验有关。因此, 在每个染色实验中处理控制是很重要的。使用任何适当的统计软件计算统计差异 (t测试)。
   9. 图像的所有菌株从同一实验 (当天染色) 顺序, 注意不要改变任何成像参数。

结果

cDCFDA 渍溶酶在 ph 依赖性的方式, 它的低 pKa 和准备吸收入溶酶使它成为理想的 pH 传感器²¹。cDCFDA 染色强度与溶酶体 ph 值成反比 (即染色强度随 pH 值的降低而增加)^18,22。cDCFDA 信号在动物溶酶体中一直很弱, 在20毫米的氯喹, 一个溶酶体酸化抑制剂, 和在蠕虫耗尽的 v-atp 酶, 蛋白质复合体的膜上的溶酶, 质子?...

讨论

各种细胞和分子事件导致衰老, 受生命史特征和遗传因素的影响。我们最近的研究²²表明, 生殖周期通过调节溶酶体 pH 动态, 在控制躯体健康方面起着重要作用。我们表明, 溶酶介导的蛋白质水解是促进, 而动物积极繁殖的 v-atp 酶转录上调, 这反过来确保酸性溶酶。繁殖结束后, v-atp 酶表达下降, 溶酶体 alkalinize, 蛋白质聚集积累在这些细胞。

损害溶酶体酸化的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
OP50 (E. coli)	Caenorhabditis Genetics Center		Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate	ThermoFisher	C369	Commonly known as cDCFDA
9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron	ThermoFisher	L7528	Commonly known as Lysotracker Red
Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)
ImageJ			Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB Broth powder	ThermoFisher	22700041
Bacto Agar	Sigma	A5306-1KG
NaCl	Sigma	S9888
Bacto Peptone	Fisher Scientific	S71604
Cholesterol powder	Sigma	C3045
CaCl2	Sigma	449709
MgSO4	Sigma	M7506
K3PO4	Sigma	P5629
Sodium Azide	Sigma	S2002
DMSO	Sigma	D8418
Microscope Slides	VWR	48311-703
Cover Slips	ThermoFisher	3406
Agarose	Sigma	A6013
Incubator
Mirror or other smooth flat surface