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摘要

本文讨论了三种用于全细胞膜片钳记录的脑准备, 研究了爪蟾蝌蚪的 retinotectal 电路。每个准备, 以它自己的具体优势, 贡献的实验驯良的爪蟾蝌蚪作为模型, 研究神经回路功能。

摘要

爪蟾蝌蚪 retinotectal 电路, 由眼睛中的视网膜神经节细胞 (RGCs) 组成, 直接在视神经顶盖神经元上形成突触, 是研究神经回路自组装的流行模型。能够从 tectal 神经元进行完整的细胞修补钳录音, 并记录研资局诱发的反应, 无论是在体内还是使用全脑准备, 都产生了大量高分辨率的数据, 关于正常的机制、异常、电路的形成和功能。在这里, 我们描述如何执行在体内准备, 原来的整个大脑准备, 和最近开发的水平脑切片准备, 以获得整个细胞补丁钳录音从 tectal 神经元。每个制剂都具有独特的实验优势。通过体内准备, 可以记录 tectal 神经元对投射到眼睛上的视觉刺激的直接反应。整个大脑的准备, 使研资局的轴突被激活的高度控制的方式, 和水平脑切片准备允许记录从所有层面的顶盖。

引言

retinotectal 电路是两栖视觉系统的主要组成部分。它由眼睛中的 RGCs 组成, 它将它们的轴突投射到视神经顶盖, 与突触后 tectal 神经元形成突触连接。爪蟾蝌蚪 retinotectal 电路是研究神经回路形成和功能的一种流行的发展模式。这个蝌蚪的 retinotectal 电路有许多属性, 使它成为一个强大的实验模型1,2,3。这篇文章的主要特点之一, 是能够从 tectal 神经元、体内或使用整个大脑准备进行完整的细胞贴片钳录音。有一个电生理学钻机配备了一个放大器, 支持电压和电流钳记录模式, 整个细胞补丁钳录音允许神经元的电生理学的特点是高分辨率。因此, 整个细胞补丁钳录音从 tectal 神经元跨越关键阶段的 retinotectal 电路形成提供了详细和全面的理解的发展和可塑性的内在4,5,6,7和突触8,9,10,11属性。结合全细胞贴片钳 tectal 神经元记录, 表达基因或 morpholinos 在这些神经元中感兴趣的能力12, 以及通过已建立的视觉避免测试 (13 ) 来评估视觉引导行为的方法, 可促进识别分子、电路功能和行为之间的链接。

重要的是要注意的是, 从整个细胞膜片钳录音获得的高分辨率数据的类型是不可能使用新的成像方法, 如基因钙指示器 GCaMP6, 因为虽然使用钙指标允许成像在大量神经元的钙动力学同时, 没有直接或明显的方法可以通过测量胞体中的三角洲荧光来获得特定的电学参数, 也没有办法对神经元进行电压钳位测量。电流-电压关系。显然, 这两种截然不同的方法, 电生理记录和钙成像, 具有不重叠的优势和产生不同类型的数据。因此, 最好的方法取决于正在处理的具体实验问题。

在这里, 我们描述了我们的方法, 从蝌蚪光学顶盖神经元, 使用体内准备, 全脑准备, 和一个新的修改全脑准备, 在我们的实验室中开发的全细胞补丁钳录音 14 .在 "代表性结果" 部分中, 我们演示了每个准备的实验优势和可以获得的不同类型的数据。讨论部分包括了不同准备工作的极限和强度, 以及排除故障的提示。

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研究方案

这里描述的所有方法都已被怀俄明州大学的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。所有的程序, 包括电生理记录, 都是在室温下进行的, 大约23摄氏度。这里描述的所有方法都是针对在发育阶段42和 49 (根据 Neiuwkoop 和费伯15) 的蝌蚪记录 tectal 神经元进行优化的。

1.体内准备

  1. 麻醉蝌蚪。
    1. 将蝌蚪放在含有斯坦伯格溶液的小培养皿中, 0.01% MS-222 约5分钟。
      注: MS-222 名为 "Tricaine" 是一种常见的鱼类和两栖类麻醉剂。在斯坦伯格的溶液中, 蝌蚪在毫米: 0.067 氯化钾, 0.034 Ca (无3)2· 4H2o, 0.083 MgSO4· 7H2o, 5.8 氯化钠, 4.9 HEPES。
    2. 确保蝌蚪深麻醉 (不反应, 不再游泳), 然后再继续步骤2。
  2. 在解剖/记录盘的地板上, 将麻醉蝌蚪固定在一个浸没的硅胶块上。
    1. 使用一次性转移吸管将麻醉蝌蚪移到含有外部记录溶液的解剖/记录盘 (氯化钠115毫米, 2 毫米氯化钾, 3 毫米 CaCl2, 3 毫米氯化镁2, 5 毫米 HEPES, 1 毫米葡萄糖; 将 pH 值调整为7.25 使用10 N 的氢氧化钠, 渗透 255 mOsm)。
      1. 为减少自发性肌肉抽搐, 将乙酰胆碱受体阻滞剂, 筒箭毒 (100 µM) 添加到外部溶液中。(通常, 这是通过使用200µL 吸管添加100µL 10 毫米筒箭毒库存到10毫升的外部溶液)。
    2. 使用昆虫引脚, 确保蝌蚪, 背侧向上, 到一个浸没的硅胶弹性体 (如 Sylgard 184, 见材料表的细节), 已粘附在解剖盘地板。
      注: 放置针脚是至关重要的: 把他们放在大脑的两边, 足够的尾鳍, 以避免刺穿传入的研资局轴突的项目从眼睛和进入大脑刚刚前的视神经顶盖 (图1 A).
  3. 沿中线将大脑圆角。
    1. 对于大脑的清晰视图, 通过使用不育的25克针在中线上进行浅切口, 去除大脑上方的皮肤。
    2. 将针头插入神经管并轻轻向上拉 ( 背 ) , 使脑部沿同一中线轴向上切下 , 这样 , 管子的背部就会净地切割 ( 断开 ) , 同时保持底板完好无损 (图 1B) 。
      注: 重要的是, 神经管的底板保持完好, 因为传入感觉输入进入顶盖通过地板板。
  4. 去除覆盖 tectal 神经元的透明心室膜。
    1. 将记录盘移动到电生理平台上, 用碎玻璃吸管尖去除 tectal 神经元细胞体上的心室膜。通过轻轻拖动它穿过一个微妙的任务雨刷打破小费。
    2. 将吸管拧入吸管支架, 并通过机器人将其降低到光学顶盖。
    3. 用破吸管将心室膜从顶盖中剥离出来。
      注: 不需要从整个顶盖中取出膜;一个小窗口就足够了, 可以提供大量的神经元。
  5. 获得整个细胞补丁钳录音。
    注意: 从这一点向前的方法类似于执行塞格夫中所述的小鼠脑切片的全细胞贴钳录音, et 。16(图 1C)。
  6. 将 tectal 神经元的反应记录到整个磁场投射到视网膜上的光的闪光。
    1. 在视网膜上投射一整场光, 将一根光纤与蝌蚪的眼睛相邻。在光纤的另一端是一个 LED 线与可变电阻器, 允许光亮度被控制。由放大器的数字输出触发 LED。这样, 就可以记录不同亮度的整个场闪烁 (图 4A)。

2. 全脑准备

  1. 执行步骤1.1 到1.3。
    注意: 没有必要在外部解决方案中筒箭毒此准备。
  2. 隔离大脑。
    1. 使用 25 G 针切断后脑 (图 2a)。
    2. 要将整个大脑从蝌蚪中分离出来, 轻轻地将针头放在脑下, 在尾部向延髓的方向上切断所有的侧向和腹壁结缔组织和神经纤维。
  3. 把大脑固定在一大块硅胶弹性体上。
    1. 一旦完全释放, 通过在后脑 (图 2B) 中的一个嗅球和另一个 pin 放置一个 pin, 将大脑固定在硅弹性体块上。这是从 tectal 神经元进行记录的最佳配置。
  4. 将含有固定全脑准备的盘子移动到电生理钻机。采用步骤1.4 所述的碎玻璃吸管去除心室膜。
  5. 将双极刺激电极放在光学交叉上 (从每只眼睛的轴突穿过中脑的地方) 直接激活研资局轴突。
    1. 放置双极刺激电极延髓, 几乎相邻的大中脑室。光学交叉位于延髓的大中脑室 (图 2B) 中。
      1. 轻轻地将刺激电极降低到光学交叉, 这样在组织中形成一个小凹痕。双极电极由脉冲刺激器驱动, 使刺激的强度得到精确控制。
  6. 按照塞格夫、等. 的描述, 执行整个单元格膜片钳录制 (图 2C)。16

3. 水平脑切片制备

  1. 执行步骤2.1 到2.3。
  2. 使用剃刀刀片将最侧向第四 (在体内对应于一个光学顶盖一侧的最背第四)。此切口与延髓尾平面平行, 如图 3A所示。
  3. 将大脑重新钉在硅弹性体的侧面, 切片侧朝上 (这样胞体和 neuropil 可以直接进入录音), 而大脑的心室表面离硅胶弹性体块 (图3B) (使双极电极可以放在光学交叉上)。
  4. 执行整个单元格补丁钳或本地归档的潜在记录 (图 3C), 如塞格夫、等. 所述。16

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结果

为了记录光诱发的反应, 整个领域的闪光投射到视网膜上, 而由此产生的响应是从单个的 tectal 神经元 (图 4a) 记录下来的。这个特殊的协议旨在测量神经元对光的响应 ("on" 响应), 然后在十五年代关闭以测量 "关闭响应"。Tectal 神经元通常表现出强健的和关闭的响应 (这里显示的电压钳模式, 与神经元钳位 60mV, 以测量突触电流 (

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讨论

这项工作中描述的所有方法都是为记录发育阶段42和 49 (根据 Neiuwkoop 和费伯15) 的蝌蚪的 tectal 神经元而优化的。在阶段 42, 蝌蚪是足够大和充分开发的, 以便昆虫别针可以被安置在脑子的任一侧为在体内录音和进行整个脑解剖。在早期阶段, 当蝌蚪本质上是二维 (即, 平), 这里描述的方法是不最佳的。

由于 tectal 神经元可以在整个细胞配置中被访?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

由 NIH 赠款 SBC COBRE 1P20GM121310-01 支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Stemi Stereo 508Zeiss495009-0006-000 Dissecting microscope
MS-222 "Tricane"FinquelARF5GAmphibian general anesthetic
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-3Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Potassium Chloride (KCl)Fisher ScientificP217-500Used to prepare Stienberg's solution and external solution
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGUsed to prepare Stienberg's solution and external solution
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GUsed to prepare Stienberg's solution  
Magnesium Sulfate (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Used to prepare Steinberg's solution
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GUsed to prepare external recording solution
Magnesium Chloride (MgCl2)J.T. Baker2444-01Used to prepare external recording solution
D-glucose AnhydrousMallinckrodt Chemicals6066-04Used to prepare external recording solution
Tubocurarine hydrochloride pentahydrateSigmaT2379Nicotinic acetylcholine receptor antagonist
Insect PinsFine Science Tools26002-100.1mm diameter stainless steel pins
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning761028Preweighed monomer and curing agent kit
Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mmFisher ScientificAS4052Small petri dishes
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)BD305122Syringe needles
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe BD309659Disposable, sterile syringes
Borosilicate pipette glassSutter InstrumentBF150-86-10HPPulled to desired specifications using pipette pulling machine
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter InstrumentsP-97Fabricates micropipettes for electrophysiology recording
Kimwipes Kimtech wipesKimberly-Clark34120Delicate task lint-free wipers
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7BCurrent clamp and voltage clamp headstage
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop ControllerSutter InstrumentMP-285/TControl for headstage on electrophysiology rig
Fiber-Coupled LED (Green)ThorlabsM530F2Fiber optic cable paired with green LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter)FHC30207Bipolar stimulating electrode
ISO-Flex StimulatorA.M.P.I. (Israel) Contact manufacturerFlexible stimulus isolator
Axon Instruments 700B Multipatch AmplifierMolecular Devices2500-0157Amplifier for voltage- and current-clamp recording 
Digidata 1322A digitizerMolecular Devices2500-135Data acquisition system for electrophysiology recording
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 Microscope for electrophysiology
Micro-g Lab TableTMC63-533Air table for electrophysiology microscope
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bitDellD06D001Computer running electrophysiology software
c2400 CCD cameraHamamatsu70826-5Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging
7 O'Clock Super Platinum Stainless RazorbladesGilletteCMM01049Platinum-coated stainless razor blades
Transfer PipetsFisher Scientific13-711-7MDisposable Polyethylene transfer pipets

参考文献

  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
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