一种基于液滴的单链 dna 放大术和微球 pcr 扩增法

摘要

本工作为液滴基微流体平台的制备和聚丙烯酰胺微球在微球 pcr 扩增中的应用提供了一种方法。微球 pcr 方法可以在不分离双链 dna 的情况下获得单链 dna 扩增器。

摘要

液滴基微流体能够在微流体通道中可靠地生产均匀的微球, 从而提供所获得的微球的控制大小和形态。成功地制备了一种与丙烯酸-dna 探针共聚的微球。不同的方法, 如不对称 pcr, 外切酶消化, 和隔离条纹包覆磁珠可以用来合成单链 dna (ssdna)。然而, 这些方法不能有效地使用大量高度纯化的 ssdna。在这里, 我们描述了一个微球 pcr 协议, 详细介绍了如何通过从 pcr 反应管中移液来有效地扩增和分离 ssdna。ssdna 的扩增可作为 dna 微阵列和 dna-selex (通过指数富集的配体系统演化) 过程的潜在试剂。

引言

单链 dna (ssdna) 由于其 dna-dna 杂交 1^,2 的固有特性, 被广泛认为是一种分子识别^元素(mre)。ssdna 合成系统的发展可导致生物应用, 如 dna 微阵列³、寡糖学、诊断和基于互补相互作用^4,5的综合分子传感。

迄今为止, 微尺度聚合物颗粒已成功地使用微流体器件进行了演示。在微通道环境^6、7中, 几种微流体技术已被证明是在连续流动上产生高度均匀微球的强大技术。

在李等人的研究中.⁸、基于液滴的微流体平台, 用于共聚寡微球的微流体合成和 ssdna 扩增。微流体平台由两个 pdms (聚二甲基硅氧烷) 层组成: 一个上部具有用于产生微球的微流体通道网络和一个底部平面部分。其中包括三种 pdms 流体通道: 1) 用于液滴生成的流聚焦通道, 2) 混合两个溶液的蛇形通道, 以及 3) 用于微球凝固的连续聚合通道。一旦两个不混溶的流被引入到一个单一的 pdms 流体通道中, 这些流就可以通过狭窄的孔口结构来强制。通道几何形状、流速和粘度等流动行为影响微球的大小和形态。因此, 主流可分为^微尺度^{单圈9、10.}

本文提供了一种详细的微球 pcr 扩增方法。首先, 介绍了一种基于液滴的微流体器件的设计过程。然后, 阐述了用随机 dna 模板互补化聚丙烯酰胺微球的方法。最后, 给出了一种扩增 ssdna 的微球 pcr 协议。

研究方案

1. pdms 微流体平台的制作

1. 采用体积比为10:1 的基础聚合物和催化剂制备20毫升液体 pdms 预聚物。将液体 pdms 的10毫升倒在微流体网络上部的硅片上制备的 su-8 模具上。对于底部扁平部分, 在没有模具结构的硅片上倒入相同体积的液体 pdms。
   注: 微流体网络是在 cad 程序中设计的, 然后转换为光刻机, 以便使用典型的光刻工艺制造母版 (参见补充数字)。这位大师是由硅片11上的负光刻胶 su-8 模具组成的.
2. 将涂有液体 pdms 预聚物的两个硅片放在热板上, 在75°c 下固化30分钟。
   1. 从 su-8 模具中手动剥离固化的 pdms 层。将直径 1.5 mm 的圆孔冲孔工具与复制的微流体网络上的油口对齐, 以便将微米级流动通道与宏观流体样品连接在一起。手动打孔。
   2. 重复此冲孔过程三次, 形成两个解决方案和出口端口。
3. 使用手持电晕处理器12对上、下的 pdms 层进行亲水性表面处理, 每个样品可持续数秒。
   1. 使用热板进行 pdms-pdms 粘接过程, 在90°c 下堆叠两个经过等离子体处理的 pdms 层并加热30分钟。使用注射器泵将加压水供应到三个入口端口, 用于制造设备的结构粘接和泄漏测试。

2. 聚丙烯酰胺低聚微球的生产

1. 准备表1中详述的珠混合物。
2. 涡旋和短暂离心标准 ssdna 丙烯酸酯标记探针 (app, 100μm) 和丙烯酰胺: 之二 (19:1) 库存溶液。
3. 通过混合25μl 的40% 丙烯酰胺二度溶液、10μl 的 ssdna (丙烯酸矿探针)、10μl 的 5x tbe 缓冲液 (1.1 m tris; 900mm 硼酸盐; 25mm edta) 和5μl 的水制备溶液 i。用50μl 的20% 过硫酸铵制备溶液 ii。
4. 准备两个单独填充了溶液 i 和溶液 ii 的注射器, 并将它们安装在泵上, 将溶液流引入微流体平台。制备与 0.4% temed 混合的矿物油, 用于微球的表面凝固。
   注: temed 是众所周知的自由基稳定剂。自由基可以加速过硫酸铵 (aps) 形成聚合物的速度, 从而催化丙烯酰胺的聚合。
5. 在玻璃瓶中加入4毫升矿物油, 形成连续流动。
6. 将两个管子插入玻璃瓶盖中的两个端口作为微流体储罐: 用于将压缩空气从空气压缩机应用到玻璃瓶中的气动端口和用于向微通道网络供应加压油的流体端口从玻璃瓶。在微流体装置中的玻璃瓶和油口之间连接管道。
   1. 将管道连接到微流体设备中的两个溶液端口, 以便从注射器泵中提供两个溶液。将管道插入出口端口, 以便将生成的微球转移到烧杯中。
7. 将注射器泵的流速设置为 0.4-0.7 mlh, 使用调节器 (82-116 kpa) 调整压缩机的压缩空气压力。将玻璃烧杯中的磁搅拌器杆的转速 (500 转/分) 设置在热板上。操作注射器泵, 并使用电磁阀13的 onsoff 控制将外部压缩机产生的压缩空气供应到玻璃瓶中.
8. 用数字显微镜观察玻璃烧杯中产生的微球在流动聚焦几何中的形成和凝固情况。
   注: 微球的大小和生产速度取决于溶液的流量和矿物油流动所施加的压力(表 2).

3. 执行聚丙烯酰胺低微球计数

1. 对于血细胞计的定量, 取少量 (约 100μl) 的聚丙烯酰胺低微球水溶液, 放在玻璃血细胞计上, 轻轻地将微球悬浮液填充到计数室的井上。
   注意: 有关详细信息, 请参阅 http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer。
2. 使用显微镜和手理计数器在16个正方形的一组中计数微球。然后, 将血细胞仪移动到下一组腔内, 并进行计数, 直到所有四组16个角都被计算在内。
3. 确定平均微球计数, 并计算原珠子悬浮液中微球的数量。
4. 将100μl 微球转移到 1.5 ml 微离心管中。通过温和的离心 (400 x g) 和移液去除上清液。

4. 在聚丙烯酰胺低微球表面进行 dna 杂交

注: 在溶液 i 中加入一个具有 5 '-nh₂组而不是 5 '-丙烯酸酯修饰的相同 dna 探针, 并同时对含有 ap-fnas 的微球进行了测试。dna 杂交结果如图 2所示。在黑暗的房间里, 应放置在一个黑暗的房间里, 用 cy3 标记的互补寡核苷酸探针 (cAp) 溶液。

1. 使用100μl 的1xte 缓冲液 (te 缓冲液:10 mm tris 和 1xTE edta, ph 8.0) 重新使用 cy3-capp, 以达到100μm 的最终浓度。例如, 在 te 缓冲液100毫升中重新悬浮 1 pmol 的 cop, 并转移到覆盖着铝箔的微离心管中。
   注: 有关链序列, 请参见表 3。
2. 在含有 ap-co-co-col 微球的无菌 1.5 ml 微离心管中加入100μm 的 cy3-capp。
3. 轻拍管几次, 在室温下在黑暗中混合孵育1小时。
4. 丢弃上清液, 通过移液去除残留缓冲液。
5. 用500μl 的 te 缓冲液冲洗三次。
6. 通过轻轻敲击微离心管来重新填充微球。然后, 重复步骤4.4。
7. 在成像前, 将微球放在玻璃滑块 (75 毫米 x 50 毫米) 上, 并用铝箔覆盖。

5. 扩增 ssdna 的 pcr 不对称

1. 制备用于扩增 ssdna 的非对称 pcr 试剂混合物进行分析。在冰上解冻表 4中的试剂。不要将 taq 聚合酶 (50 ueμl) 保存在冰上, 而是将其保存在-20°c, 直到需要。
2. 轻轻涡旋所有试剂, 然后短暂离心管在 10, 000 x g 的10秒。
3. 按照表4中的说明组合所有试剂.
4. 将样品放入热环器中, 并在以下条件下启动非对称 pcr: 25个周期 (95°c 为 30秒, 52°c 为 30秒, 72°c 为 30秒), 85°c 为 5分钟, 保持在4°c。

6. 扩增 ssdna 的微球 pcr

注: 本节介绍 pcr 反应管中扩增 ssdna 的协议。在50μl 的反应体积下进行微球 pcr 反应。用于扩增 ssdna 的详细序列见表 5。在这种情况下, 微球表面的 app 可以以互补的方式退火到随机 dna 模板。这是产生互补 dna 链 (反义 dna 链,图 3) 的一个非常重要的步骤。扩展的 dna 被用作微球 pcr 扩增的模板。

1. 制备微球 pcr 试剂混合物。在冰上解冻表 6中的试剂;但是, 不要将 taq 聚合酶保持在冰上。将其存放在-20°c, 直到需要。
2. 轻轻涡旋所有试剂, 然后短暂离心管在 10, 000 x g 的10秒。
3. 通过显微计数获得约 ~ 25个微球。
   注: 一个反应管中的微球数量是使用40x 放大倍率的光学显微镜计算的。约25个微球用于微球 pcr 扩增。更多详细信息在步骤3中。
4. 按照表6中的说明组合所有试剂.
5. 将样品放入热环器中, 并在以下条件下启动非对称 pcr: 25个周期 (95°c 为 30秒, 52°c 为 30秒, 72°c 为 30秒), 85°c 为 5分钟, 保持在4°c。
6. 扩增后, 加入6x 的负载缓冲液, 并将每个样品的15μl 加载到2% 琼脂糖凝胶中。然后, 在 1x tae (醋酸盐 edta, 40 mm 醋酸 tris, 1 mm edta, ph 8.2) 缓冲液中, 在 100 v 下进行电泳35分钟。

7. 共聚焦显微镜采集

注: 在共聚焦显微镜下对微球-dna 探针杂交的结果进行了成像。图像分析是使用 imagej 执行的。

1. 将杂交微球固定在支架的显微镜阶段。
2. 选择激光 (helium/neon 激光器, 543 nm 线), 并在激光控制中打开它。
3. 在显微镜控制中选择物镜。
4. 在配置控制中为 cy3 和通道选择所需的筛选器。
5. 开始实验并观察样品。表 7汇总了共聚焦显微镜的设置。

结果

基于聚合物液滴的微流体平台由两个 pdms 层组成 (图 1a)。三种微流体通道网络用于产生微球: 1) 流动聚焦几何, 如图 1b所示, 2) 用于混合溶液 i 和溶液 ii 的蛇形通道, 3) 微球聚合通道凝固。所有通道的高度为60微米。混合和聚合的通道长度分别为74.35 毫米和94.45 毫米。两个不混溶流体流动的微通道宽度和矿物油流动的微通道宽度?...

讨论

dsdna 的污染物是 ssdna 扩增中的一个主要问题。在传统的不对称 pcr 扩增中, 仍然很难将 dsdna 扩增降至^最低。此外, 尽管生成 ssdna 的技术改进使我们能够提高样品吞吐量的效率, 但由于其成本高、纯化产量不完整, ssdna 分离仍然存在问题。

不对称 pcr 是处理 ssdna 时最具挑战性的方法之一。这种方法应用不等数量的引物 (例如, 20:1 比率), 以产生大量的 ssdna?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres