调频染料循环在突触: 高钾偏极化, 电和 Channelrhodopsin 刺激的比较

摘要

突触囊泡 (SV) 循环是神经元突触中细胞间通讯的核心机制。调频染料的摄取和释放是定量测定 SV 内胞吐作用的主要手段。在这里, 我们比较所有的刺激方法, 以驱动 FM1-43 循环在果蝇神经肌肉连接 (NMJ) 模型突触。

摘要

FM 染料用于研究突触囊泡 (SV) 周期。这些双亲探头有亲水性的头和疏水的尾巴, 使他们水溶性的能力, 可逆进入和退出膜脂双层。这些苯乙烯染料在水介质中相对非荧光, 但插入到等离子膜的外小叶中会导致荧光 > 40X 的增加。在神经元突触中, FM 染料在 sv 吞的内部和之间被内部内化, 并与 sv 胞吐作用一起释放, 提供了一个强有力的工具来可视化神经传递突触前阶段。谷氨酸突触发育和功能的一个主要遗传模型是果蝇神经肌肉结 (NMJ), 其中 FM 染料成像已广泛用于量化 SV 动力学在广泛的突变条件。NMJ 突触终端是容易接近的, 与一个美丽的阵列大突触 boutons 理想的成像应用。在这里, 我们比较和对比三种方法来刺激果蝇NMJ 驱动活动依赖 FM1-43 染料摄取/释放: 1) 浴应用高 [K⁺] 去极化神经肌肉组织, 2) 吸入电极马达神经刺激去极化的突触前神经终端和 3) 靶向转基因表达 channelrhodopsin 变种为光刺激, 空间控制的退极化。这些方法中的每一个都对研究果蝇NMJ 的 SV 周期的遗传突变效应有好处和坏处。我们将讨论这些利弊, 以协助选择刺激方法, 以及每个战略的具体方法。除了荧光成像, FM 染料可以 photoconverted 电子密集信号可视化使用透射电镜 (TEM) 研究 SV 周期机制的超微结构水平。我们提供的比较共聚焦和电子显微成像的不同方法的果蝇NMJ 刺激, 以帮助指导选择的未来实验范式。

引言

用精美的果蝇幼虫神经肌肉结 (NMJ) 谷氨酸突触模型研究了巨大的基因扰动¹的突触形成和功能。运动神经元终端由多轴突分支组成, 各有多个突触 boutons。这些宽敞的静脉曲张 (直径达5µm) 包含所有的神经传递机械, 包括均匀谷氨酸突触泡 (SVs; ~ 40 毫微米直径) 在胞浆储备和容易发布池 2.这些囊泡停靠在突触前等离子膜融合点活性区 (AZs), 胞吐作用介导谷氨酸神经递质释放为反式突触通信。随后, SVs 从等离子膜中提取, 通过接吻和运行回收或网格蛋白介导的吞 (CME) 为重复的外周/吞周期。果蝇NMJ 易于访问, 适合于孤立和表征 SV 周期突变体。利用正向基因筛, 新的突变导致了对 SV 周期³的关键基因的鉴定。而且, 从已经已知的基因开始的反向遗传方法, 通过对突变体循环表型⁴的仔细描述, 导致了新的 SV 循环机制的澄清。果蝇NMJ 几乎是理想的, 作为一个实验性突触准备, 解剖 SV 吞和胞吐作用机制通过方法, 光学跟踪囊泡循环在神经传递。

一系列荧光标记允许视觉跟踪的水泡在循环动力学, 但最多才多艺的是 FM 染料类似物, 首先合成的毛, F., et al。⁵. 结构上, FM 染料含有亲水头和通过芳香环连接的亲脂尾巴, 其中心区域赋予光谱性质。这些苯乙烯染料在膜中可逆地分解, 不会在膜小叶之间 "翻转", 所以在细胞质中从来没有自由, 而且在膜中的荧光比水的⁵还要多。可逆插入脂质双层导致荧光⁶的40倍增加。在神经元突触中, 经典的调频染料标记实验包括在去极化型刺激过程中, 通过 SV 吞, 沐浴与染料的突触准备。然后将外部染料冲走, SV 循环在无钙的响铃解决方案中被捕获, 以图像加载的突触⁷。第二轮的刺激, 在无染料浴触发 FM 释放通过胞吐作用, 一个过程, 可随后测量荧光强度下降。从单个囊泡到包含数以百计水泡的水池的 SV 种群可以定量地监视^6,7。FM 染料被用来解剖活动依赖的动员功能不同的 SV 池, 并比较亲吻和运行与 CME 循环^8,9。该方法已被修改, 以单独检测诱发, 自发和微型突触周期活动 (具有高度敏感的设备, 以检测非常小的荧光变化和减少漂白)¹⁰。通过将荧光调频信号 photoconverting 为透射电镜^{11、12、13、}14 的电子密标签, 可以将检测范围扩展到超微结构水平..

从历史上看, 高浓度钾的沐浴突触准备 (以下简称 "高 [K⁺]") 一直是去极化型刺激诱发 SV 循环的选择方法;从青蛙胆碱能 NMJ⁵到培养啮齿动物大脑海马神经元¹⁵, 到果蝇谷氨酸 NMJ 模型^16,17。这种高 (K⁺) 方法简单, 不需要专用设备, 因此大多数实验室都可以访问, 但对应用程序和数据解释都有限制。一个更加生理上适当的方法是使用吸入电极电刺激神经^4,5,12。这种方法推动动作电位的传播, 直接刺激突触前神经终端, 结果可以直接与神经传递功能的电生理学^分析,^{13,14, 15}, 但需要专用设备, 技术上更具挑战性。随着光遗传学的出现, channelrhodopsin 神经元刺激的使用具有额外的优势, 包括使用二进制 Gal4/UAS 系统20对信道表达进行严密的时空控制.这种方法在技术上比吸力电极刺激更容易, 只需要一个非常便宜的 LED 光源。在这里, 我们使用 FM1-43 的成像 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) 苯乙烯) 吡啶二溴) 来比较和对比这三种不同的刺激方法在果蝇 NMJ: 简单高 [K + ], 挑战电气和新的 channelrhodopsin 方法。

研究方案

1. 幼虫胶解剖

1. 从弹性体套件 (材料表) 中彻底混合10部分硅胶弹性体底座与1部分硅胶弹性体固化剂。
2. 外套 22 x 22 毫米玻璃盖玻片与弹性体和治疗在一个热板在75˚C 几个小时 (直到不再粘到触摸)。
3. 将一个单一的弹性体涂层玻璃盖玻片到定制的树脂玻璃解剖室(图 1, 底部), 为幼虫解剖作准备。
4. 用标准微电极拉拔剂从硼硅酸盐玻璃毛细管中制备胶吸管, 以获得所需的锥度和尖端尺寸。
5. 轻轻折断微尖端, 另一端附加2英尺的柔性塑料管 (1/32 英寸内径, ID; 3/32 "外径, 外径; 1/32" 墙;材料表)配口管 (P2 吸管尖)。
6. 填充一个小容器 (0.6 毫升离心管帽) 与小容积 (~ 20 µL) 的胶水 (材料表), 为幼虫解剖准备。
7. 用生理盐水填充房间 (毫米): 128 氯化钠, 2 氯化钾, 4 氯化镁₂, 1 CaCl₂, 70 蔗糖和 5 2-[4-(2-羟乙基) piperazin-1 基] 磺酸 (HEPES) pH 值7.2。
8. 添加抗马萝卜过氧化物酶 (HRP) 抗体共轭到 Alexa 647 (anti-HRP:647; 稀释1:10 从1毫克/毫升股票), 以标记 NMJ 突触前终端在^解剖21, 22.
9. 使用精美的画笔 (尺寸 2), 从食品瓶中移除一个流浪的第三个龄, 并放置在弹性体涂层的盖玻璃上。
10. 用带有附件的嘴产生的负气压填充玻璃微尖, 用少量胶水 (步骤 1.5)。
11. 将幼虫背侧与镊子一起放置, 将头部粘附在弹性体涂层的盖玻片上, 用一小滴胶水, 用口正面气压。
12. 重复这个过程与幼虫的后端, 确保动物在两个胶水附件之间绷紧。
13. 使用剪刀 (刀片3毫米;材料表), 在后部和垂直切口沿背中线进行水平切口 (~ 1 毫米)。
14. 使用细钳 (#5,材料表), 轻轻地去除背气管, 肠道, 脂肪体和其他内部器官覆盖肌组织。
15. 重复四体壁襟翼的胶合过程, 确保在水平和纵向上轻轻伸展身体壁。
16. 用镊子抬起腹神经线 (VNC), 用剪刀小心地切断马达神经, 然后完全删除 VNC。
17. 用 Ca^{2 +}-游离生理盐水替换解剖盐水 (与上述解剖生理盐水相同, 没有 CaCl₂) 以停止 SV 循环。

2. 备选案文 1: 高 [K⁺] FM 染料加载

1. 从 FM1-43 的股票溶液 (4 毫米), 增加1µL 到1毫升90毫米氯化钾溶液 (高 [K⁺] 在解剖盐水) 为最后浓度4µM。
2. 使用吸管, 用高 [K⁺] FM 染料溶液替换成像腔中的 Ca^{2 +}无盐盐水, 以刺激 SV 吞染料的吸收。
3. 立即启动数字计时器, 以确定高 [K⁺] 去极化型刺激期间的预定时间(e. g, 5 分钟;图 2)。
4. 要确认一个健康的幼虫制剂, 请注意在高 [K⁺] 退极化期的持续时间内肌组织的强烈收缩。
5. 当计时器周期结束时, 快速删除高 [K⁺] FM 染料解决方案, 并替换为 Ca^{2 +}-免费生理盐水以停止 SV 循环。
6. 快速连续清洗与 Ca^{2 +}-免费生理盐水 (5x 1 分钟), 以确保高 [K⁺] FM 染料解决方案被完全删除。
7. 在新鲜的 Ca^{2 +}-免费生理盐水中保持幼虫的准备, 以便立即用共焦显微镜进行成像。

3. 成像: 共焦显微术

1. 使用直立共焦显微镜与40X 水浸泡目标图像 NMJ 染料荧光 (其他显微镜可以使用)。
2. 图像肌肉 4 NMJ 腹部段 2-4 (其他 NMJs 可以成像) 和收集图像使用适当的软件 (材料表)。
3. 使用 HeNe 633 nm 激光激发 HRP:647 (带长通滤波器 > 635 nm) 和氩 488 nm 激光器激发 FM1-43 (带通滤波器 530-600 nm)。
4. 操作确定两个通道的最佳增益和偏移量。
   注意: 这些设置在整个实验的其余部分将保持不变。
5. 采取一个共聚焦 Z 栈通过整个选定的 NMJ 从 HRP 标记的顶端到底部的突触终端。
6. 仔细注意 NMJ 成像 (段, 侧面和肌肉), 以确保过剩的完全相同的 NMJ 后, 调频染料卸载。

4. 高 [K⁺] 刺激: FM 染料卸载

1. 用高 [K⁺] 生理盐水 (不含 FM1-43 染料) 替换 Ca^{2 +}无盐盐水, 以驱动退极化、SV 胞吐作用和染料释放。
2. 立即启动数字计时器, 以确定高 [K⁺] 刺激期间的预定时间 (e. g, 2 分钟;图 2)。
3. 当计时器周期结束时, 立即删除高 [K⁺] 生理盐水并替换为 Ca^{2 +}-免费生理盐水以停止 SV 循环。
4. 用 Ca^{2 +}免费生理盐水 (5x 1 分钟) 快速连续清洗, 以确保完全删除高 [K⁺] 生理盐水。
5. 在新鲜的 Ca^{2 +}-免费生理盐水中保持幼虫的准备, 以便立即用共焦显微镜进行成像。
6. 一定要在相同的 NMJ 上使用相同的共聚焦设置 FM1-43 染料荧光图像。

5. 备选案文 2: 电刺激调频染料加载

1. 使用微电极拉拔器 (材料表) 准备吸入吸管, 以获得所需的锥度和尖端尺寸。
2. 用微型锻造将微电极尖端点火, 直到单个马达神经能被紧配合。
3. 将吸吸管滑入机器人上的电极支架上, 并附着在长柔塑料管和注射器上。
4. 设置刺激器参数 (e. g, 15 V, 20 Hz 频率, 20 毫秒的持续时间和5分钟 (图 2) 或1分钟 (图 3))。
5. 在电生理学平台上, 用以上 FM1-43 生理盐水 (4 µM; 1 毫米 CaCl₂) 取代 Ca^{2 +}无盐的幼虫制剂。
6. 将准备工作放在显微镜阶段, 并提高到幼虫和吸吸管的聚焦 (40X 水浸泡目标)。
7. 吸一圈切断电机神经支配选定的 hemisegment 与负气压的注射器产生的吸入电极。
8. 在视觉监测所选 hemisegment 的肌肉收缩时, 用短时间刺激来测试吸入电极的功能。
9. 使用所选参数 (步骤 5.4) 刺激运动神经元, 以驱动 SV 吞和 FM1-43 染料摄取 (图 2)。
10. 用 Ca^{2 +}无盐 (5x 1 分钟) 快速连续清洗, 以确保 FM1-43 染料溶液完全移除。
11. 使用上面的共焦成像协议, 在新鲜的 Ca^{2 +}-免费生理盐水中保持幼虫准备。
12. 仔细注意 NMJ 成像 (段, 侧面和肌肉), 以确保获得完全相同的 NMJ 后, 调频染料卸载。

6. 电刺激: 调频染料卸料

1. 用常规生理盐水 (无 FM1-43 染料) 替换 Ca^{2 +}无盐生理盐水, 并将制剂放回电生理钻机阶段。
2. 设置卸载的刺激器参数 (例如、15 V、20 Hz 频率、20毫秒持续时间和2分钟 (图 2) 或二十年代 (图 3))。
3. 将相同的马达神经吸入到同一个电极上, 然后刺激激活 SV 胞吐作用和 FM1-43 染料释放。
4. 快速连续洗涤与 Ca^{2 +}-免费生理盐水 (5x 1 分钟), 以确保外部染料完全删除。
5. 在新鲜的 Ca^{2 +}-免费生理盐水中保持幼虫的准备, 以便立即用共焦显微镜进行成像。
6. 确保在相同的 NMJ 上使用相同的共焦设置 FM1-43 染料荧光图像。

7. 选择 3: Channelrhodopsin 刺激 FM 染料装载

1. 在含有 ChR2 因子的全反式视网膜 (溶解于乙醇; 100 µM 最后浓度) 的食物上饲养 ChR2-expressing 幼虫。
2. 将幼虫制剂放置在有机玻璃室的解剖显微镜阶段, 配备有摄像头端口。
3. 附上蓝色 LED (470 毫微米;材料表)使用同轴电缆的可编程刺激器, 并将 LED 放到照相机端口。
4. 利用显微镜变焦功能将蓝色 LED 光束聚焦到解剖幼虫的功能上。
5. 在 optogenetic 阶段, 用以上 FM1-43 生理盐水 (4 µM; 1 毫米 CaCl₂) 取代 Ca^{2 +}无盐的幼虫制剂。
6. 使用刺激器 (例如、15 V、20 Hz 频率、20毫秒持续时间和5分钟 (图 2)) 设置 LED 参数。
7. 启动光刺激和跟踪计时器的预先确定的持续时间的 optogenetic 刺激期 (例如, 5 分钟;图 2)。
8. 当计时器停止时, 请快速删除 FM 染料解决方案, 并替换为 Ca^{2 +}-免费生理盐水以停止 SV 循环。
9. 用 Ca^{2 +}免费生理盐水 (5x 1 分钟) 快速连续清洗, 以确保 FM 染料溶液完全移除。
10. 使用上面的成像协议, 在新鲜的 Ca^{2 +}-免费生理盐水中保持幼虫的准备, 以立即成像与共焦显微镜。
11. 仔细注意 NMJ 成像 (段, 侧面和肌肉), 以确保获得完全相同的 NMJ 后, 调频染料卸载。

8. Channelrhodopsin 刺激: FM 染料卸载

1. 在解剖显微镜阶段替换 Ca^{2 +}无常规生理盐水 (不含 FM1-43 染料), 并以幼虫为焦点的摄像头端口 LED。
2. 设置卸载的刺激器参数 (例如, 15 V, 20 Hz 频率, 20 毫秒持续时间和2分钟 (图 2))。
3. 启动光刺激和跟踪计时器的预先确定的持续时间的 optogenetic 刺激期 (例如, 2 分钟;图 2)。
4. 当计时器周期结束时, 请快速删除 FM 染料解决方案, 并替换为 Ca^{2 +}-免费生理盐水以停止 SV 循环。
5. 快速连续洗涤与 Ca^{2 +}-免费生理盐水 (5x 1 分钟), 以确保外部染料完全删除。
6. 在新鲜的 Ca^{2 +}-免费生理盐水中保持幼虫的准备, 以便立即用共焦显微镜进行成像。
7. 确保在相同的 NMJ 上使用相同的共焦设置 FM1-43 染料荧光图像。

9. 荧光定量

1. 加载图像 J (NIH 开源), 并创建一个最大强度投影通过单击图像 |栈 |Z 项目。
2. 使用 anti-HRP:647 通道, 转到图像 |调整 |阈值和滑动顶部工具栏, 直到只突出显示 NMJ。
3. 使用魔杖工具, 点击 NMJ。如果 NMJ 不连续, 请按住 Shift 按钮并选择所有部件。
4. 将图像更改为 FM1-43 染料通道并转到分析 |测量得到荧光测量。
5. 重复步骤 9.1-9.4 的 "卸载" 图像从相同的 NMJ (确定的部分, 侧面和肌肉)。
6. 要获得被卸载的染料的百分比, 取被卸载的/被装载的荧光强度的比率。
   注意: 可以修改此过程, 以使用 "椭圆形" 或 "徒手" 选择工具, 在溥每溥的基础上进行荧光分析。通过对肌肉荧光的取样可以减去背景荧光。还可以添加代理以减少此背景。

结果

图 1显示了与活动相关的 FM 染料成像协议的工作流。无论后来使用何种刺激方法, 实验总是以相同的幼虫胶解剖开始。图 1a是解剖幼虫的示意图, 显示腹神经线 (VNC)、辐射神经和重复 hemisegmental 肌肉模式。VNC 被删除, 准备沐浴在 FM1-43 的4µM 解决方案中 (图 1b, 粉红色)。然后, 在 FM 染料存在的情况下, 使用三?...

讨论

高 [K⁺] 生理盐水去极化型刺激是迄今为止最容易的三种选择活动相关的 FM 染料循环, 但可能是最小的^生理29。这个简单的方法 depolarizes 在整个动物中的每一个可访问的细胞, 所以不允许定向研究。可能在本地应用高 [K⁺] 生理盐水与微, 但这仍将去极化前/突触细胞和可能突触相关的神经胶质 1.另一个主要关注的问题是高 (K⁺) 偏极化驱动器?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388	To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber	N/A	N/A	Handmade
Borosilicate Glass Capillaries	WPI	1B100F-4	To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-2000	To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	For mouth and suction pipette
P2 pipette tip	USA Scientific	1111-3700	For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap	Fisher Scientific	05-408-120	Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Glue used for dissections
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S5886	For saline
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	M35-500	For saline
Calcium Chloride Dihydrate	Millipore Sigma	C7902	For saline
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	For saline
HEPES	Millipore Sigma	H3375	For saline
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	To label neuronal membranes
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5	WPI	500233	Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)	WPI	14177	Used during dissection
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluorescent styryl dye
Digital Timer	VWR	62344-641	For timing FM dye load/unload
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope	Zeiss		For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser	Lasos		To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser	Lasos		To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip	BD	301625	To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)	Narishige	MMN-9	To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator	Grass	S48	To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope	Zeiss		Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Used for ChR activation
T-Cube LED Driver	ThorLabs	LEDD1B	To control the LED
LED Power Supply	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	To power the LED
Optical Power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	To measure LED intensity