人网膜和皮下脂肪组织 CD34+CD31+ 内皮细胞的分离、扩增和脂肪诱导

摘要

脂肪组织血管祖细胞中白、米色脂肪体的分化具有改善肥胖代谢的潜力。我们描述了 CD34+CD31+ 内皮细胞与人的脂肪分离的协议, 并为随后的体外扩增和分化为白色和米色脂肪。讨论了几种下游应用。

摘要

肥胖伴随着脂肪组织的广泛重塑, 主要是通过脂肪细胞肥大。极端脂肪细胞的生长导致胰岛素、局部缺氧和炎症反应不良。通过刺激祖细胞功能性白细胞的分化, 可以预防脂肪细胞的自由基肥大, 从而可以改善脂肪组织的代谢健康, 同时减少炎症。另外, 通过刺激米色/褐色脂肪细胞的分化, 总能量消耗可以增加, 导致体重减轻。这种方法可以防止肥胖症的发病率, 如2型糖尿病和心血管疾病的发展。

本文描述了 CD31 和 CD34 标记的人脂肪组织内皮细胞的一个子集对白色和米色脂肪体的分离、扩增和分化。该方法相对便宜, 不劳动密集型。它需要进入人体脂肪组织和皮下仓库是适合取样。对于这个协议, 肥胖症患者的新鲜脂肪组织样本 [身体质量指数 (BMI) > 35] 是在减肥手术过程中收集的。使用序贯 immunoseparation 从基质血管的分数, 足够的细胞产生的小到 2–3 g 的脂肪。这些细胞可以在10–14天内进行培养, 可以冷冻保存, 并保留其脂肪的性质, 传代直至通过5–6。细胞被治疗14天与脂肪鸡尾酒使用人胰岛素和 PPARγ激动剂-罗格列酮的组合。

这种方法可用于获取分子机制的概念实验的证明, 推动脂肪内皮细胞的脂肪反应, 或筛选新的药物, 可以提高脂肪反应, 无论是对白色或米色/棕色脂肪细胞分化。使用小皮下活检, 这种方法可用于筛选非应答者的临床试验目的是刺激米色/棕色和白色脂肪细胞的治疗肥胖和共同疾病。

引言

最近的证据显示, 在小鼠和人类中, 在脂肪组织血管中的细胞子集可以被区分成白色或米色/褐色脂肪体^1,2,3。这种细胞的表型是一个争议的主题, 有证据支持内皮细胞, 平滑肌/周细胞, 或一光谱的中间表型^4,5,6,7。这种方法的发展范围是测试从肥胖人群中分离出不同脂肪库的 CD34+CD31+ 内皮细胞的脂肪电位。文献中的其他研究集中在脂肪电位的总基质血管分数或已知脂肪细胞祖细胞^2,8,9。由于目前现有的技术可以专门针对脂肪组织内皮细胞的药物传递¹⁰, 了解这种细胞的潜力接受脂肪诱导向白色或米色脂肪体是重要的未来靶向治疗。

不同的组报告, CD31 和 CD34 标记作为代理人, 以隔离内皮细胞从人脂肪组织^11,12,13。通常情况下, 隔离是使用两个连续步骤和一个使用磁性珠子的正选择来执行的。在本报告中, 利用 CD34+ 磁珠结合 CD31 塑料珠 immunoseparation。我们发现这种技术优于顺序磁性 immunoseparation 的保存典型的鹅卵石内皮形态学。此外, 我们能够产生足够的细胞, 以扩大和脂肪诱导开始从尽可能少的脂肪 g。小样本皮下脂肪活检足以为下游应用生产所需的细胞数量。这方面是潜在的重要, 特别是如果这一方法将被用于筛选对脂肪诱导的人的对象的反应。

与文献报道的其他系统不同, 这种方法仅利用两种成分脂肪诱导 CD34+CD31+ 细胞: PPARγ激动剂-罗格列酮-和人胰岛素。重要的是, 使用胰岛素的数量在正常/高范围内循环后吸收胰岛素的人¹⁴。Akt 磷酸化测定的细胞体外对胰岛素的反应程度与它们对诱导性鸡尾酒反应的能力没有关联。有趣的是, 使用这种诱导鸡尾酒和实验条件, 由白色和米色/褐色细胞的混合, 由细胞内脂质滴的大小和数量和分子标记的表达决定。这种简单和经济高效的诱导协议以及对应答器细胞表型的定量评估 (白色与米色) 允许筛选可能改变差异性米色平衡的药剂。: 白色脂肪细胞。

该方法还为了解人体脂肪组织中血管内皮祖细胞成脂的基本机制提供了一种平移方法。使用这种特殊的隔离/分化技术, 调查人员可以审问各种途径, 负责成脂在血管内皮细胞的子集, 从不同脂肪库的瘦身和肥胖的人。

研究方案

东弗吉尼亚医学院的机构审查委员会批准了研究和收集人体脂肪组织样本用于研究。从病人那里收集了知情的书面同意书。

1. 编制缓冲器、媒体和仪器

1. 准备一个克雷布斯的碳酸氢钠-缓冲溶液 (KRBBS): 135 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 1 毫米硫酸镁, 0.4 毫米磷酸钾二元, 5.5 毫米葡萄糖, 1 毫米腺苷, 0.01% 抗生素/防霉混合 (50 µg/毫升青霉素,50µg/毫升链霉素, 30 µg/毫升庆大霉素, 15 ng/毫升两性霉素) 和10毫米 HEPES (pH = 7.4)。这个解决方案是准备新鲜的每一次的组织收集和消化。
2. 制备新的胶原酶溶液: 1 毫克/毫升的胶原酶, 类型 1, 在 KRBSS;做3毫升/克的脂肪。在组织消化前, 在水浴中预热37摄氏度的胶原酶溶液。
3. 准备一个 CD34 细胞隔离缓冲: 2% 胎牛血清 (血清) 和1毫米 EDTA 在无菌磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)。
4. 准备成脂培养基: DMEM/F12, 5% 血清, 50 µg/毫升青霉素/链霉素, 1.25 µL/毫升的人胰岛素 (5 µg/毫升或144亩/毫升), 0.36 µL/毫升2.8 毫米罗格列酮 (1 µM)。
5. 用0.3% 油红 O (破产) 库存溶液 (重量/容积) 将0.3 克的破产, 溶解为100毫升异丙醇。

2. 脂肪间质血管分数隔离

注: 该研究包括一组2例病态肥胖型糖尿病 (T2D) 和非糖尿病患者, 年龄18–65岁, 在森塔拉代谢和减肥手术中心 (森塔拉医学小组, 诺福克, VA) 进行减肥手术。排除标准包括一种自身免疫性疾病, 包括1型糖尿病、需要长期免疫抑制剂治疗的条件、抗炎药物、thiazolinendiones、有效烟草使用、慢性或急性感染或历史在过去12月内治疗的恶性肿瘤。T2D 被定义为空腹血糖为126毫克/dl 或更大, 葡萄糖200毫克/dl 或更大后2小时葡萄糖耐受性测试, 或使用抗糖尿病药物。

1. 收集人网膜 (OM) 和皮下 (SC) 脂肪组织 (AT) 从人体进行减肥手术。
2. 保持 OM 和 SC 在单独的小瓶包含汉克的缓冲盐溶液与50µg/毫升青霉素/链霉素在室温下立即组织提取。
3. 当样品在组织提取后到达实验室时, 用70% 乙醇擦拭剪刀和镊子仔细清洁和去除组织中的纤维化和烧灼部分。
4. 对脂肪组织进行称量, 将其分成5克 (或更少) 整除数胶原酶消化。
5. 用两对剪刀, 在室温闪烁的小瓶中, 在5毫升的胶原酶溶液中, 切碎5克。
6. 添加额外的10毫升胶原酶溶液的切碎组织为15毫升总。
7. 在连续晃动的水浴中, 将样品消化1小时, 摄氏37摄氏度。
8. 切断20毫升注射器的尖端, 使钝端。
9. 从250µm 网格中剪下一个9厘米 x 9 厘米的正方形, 用钝端注射器将其推到50毫升圆锥管中。
10. 将样品倒入20毫升钝端注射器中, 通过250µm 尼龙网过滤成50毫升锥形管, 将脂肪细胞和基质血管干细胞从未消化的组织中分离出来。
    注: 不要使用超过5克的每50毫升圆锥管, 因为网将被堵塞由于过度纤维化未消化的材料。
11. 用10毫升的 KRBBS 冲洗出闪烁的瓶子, 然后通过过滤器将其倒入收集残余细胞。
12. 在室温下孵化过滤样品5分钟。
    注意: 这一步是很重要的, 让脂肪细胞漂浮在管的顶部和一些基质血管干细胞, 以解决在管的底部。
13. 利用20毫升注射器和一个20克 x 6 在吹打针去除基质血管分数层, 并将其转移到一个干净的50毫升圆锥管。
14. 添加10毫升的 KRBBS, 并允许样品坐在板凳上5分钟, 在室温下。
15. 重复步骤2.12–2.14 两次。
    注: 这些步骤将确保无污染的基质血管细胞与漂浮脂肪。
16. 将两个仓库的基质血管分数保持在冰上进行进一步处理, 如下面的步骤所述。
    注意: 不要把细胞放在冰上超过1小时, 因为这可能会影响细胞的生存能力。脂肪细胞可以在液态氮中被闪光冷冻, 用于长期贮存或用于实验。

3. 脂肪组织内皮细胞的分离

1. 将基质血管馏分 (SVF) 在 500 x g处旋转5分钟, 在4摄氏度。
2. 从离心机上取出样品, 仔细地倒上清液;保持含有 SVF 细胞的颗粒。
3. 在5毫升的 PBS 中轻轻并用重悬细胞颗粒。
   注: 如果5克以上的 a 在车厂被处理成多个整除数 (见步骤 2.4), 把细胞颗粒聚集在一起。
4. 旋转样品在 500 x g 5 分钟, 在4摄氏度。
5. 移除上清, 并用重悬1毫升的 PBS 细胞, 并计数细胞。
   注: 在这里, 一个自动细胞计数器用于细胞计数。细胞的生存能力是通过混合12µL 细胞悬浮与12µL 的吖啶橙/碘碘 (AO/PI) 解决方案 (见材料表)。每个车厂每克的平均单元数为: (a) OM 车厂: 1.69 x 10⁵ @ 4.51 x 10⁴;(b) SC 车厂: 1.24 x 10⁵ @ 6.45 x 10⁴。两个仓库的细胞的生存能力是 > 90%。
6. 将样品按 500 x g分5分钟, 在4摄氏度。
   注: CD34 磁选择协议 (见材料表) 已适应步骤3.7–3.15。
7. 并用重悬100µL CD34 隔离缓冲器中的颗粒。
   注: 总细胞计数要求以下再悬浮容量: (a) < 2 x 10⁷个细胞: 并用重悬颗粒在100µL;(b) 2 x 10⁸–5 x 10⁸细胞: 并用重悬在1毫升的颗粒。在步骤3.9–3.16 中, 所用试剂的体积缩小为 < 2 x 10⁷细胞。
8. 添加10µL CD34 鸡尾酒, 并在室温下孵化样品15分钟。
9. 在室温下添加5µL 的磁性珠子, 并孵育样品10分钟。
10. 在每个样品中加入2.5 毫升的 CD34 隔离缓冲器, 将样品放入磁铁中, 在室温下放置5分钟。
11. 将磁铁反转5秒, 将隔离缓冲器倒掉。
12. 从磁铁中取出样品, 重复步骤3.10 和 3.11 4x。
13. 从磁铁中取出管子, 加入2毫升的 CD34 隔离缓冲器。
14. 将细胞以 500 x g为5分钟, 在4摄氏度。
15. 并用重悬细胞颗粒在1毫升的 CD34 隔离缓冲和计数细胞。
    注: 在这里, 每克的平均细胞数是: (a) OM 车厂: 4.75 x 10⁴ @ 3.36 x 10⁴;(b) SC 车厂: 1.06 x 10⁴ @ 9.53 x 10³。CD31 塑料 immunobead 协议适用于步骤 3.16–3.34 (见材料表)。
16. 颗粒细胞在 500 x g 5 分钟和并用重悬的颗粒在250µL 的缓冲 B 和250µL 的洗涤缓冲器。
17. 涡流管彻底并用重悬 CD31 珠。
18. 添加20µL 的 CD31 珠。
    注: 由于总单元数 > 1 x 10⁶, 卷根据制造商的输入被缩小了。
19. 在室温下用摇摆30分钟孵化样品。
20. 将过滤器连接到无菌50毫升圆锥管。
    注: 过滤器的较大开口必须在顶部。
21. 在细胞分离之前, 加入1毫升的洗涤缓冲器, 平衡过滤器。将步骤3.16 下生成的混合物应用于过滤器。
22. 用5毫升的洗涤缓冲器在圆形运动中清洗过滤器, 总容积为20毫升。将接头连接至无菌50毫升圆锥管, 并关闭鲁尔锁。
23. 将过滤器连接到接头。在滤网壁上添加1毫升洗涤缓冲器。在滤网壁上添加1毫升的活化缓冲 D。轻轻旋转样品, 在室温下孵化10分钟。
24. 添加1毫升的洗涤缓冲器。将细胞从珠子中分离出来, 吹打10x。
    注意: 避免产生气泡。
25. 打开鲁尔锁, 允许分离的细胞流入50毫升锥形管。每次用1毫升的洗涤缓冲器清洗过滤器10x。
26. 丢弃接头和过滤器, 离心样品在 300 x g 10 分钟, 在4摄氏度。并用重悬细胞颗粒在2毫升完整的 EGM-2 培养基中进行培养。
    注: 此时每克的平均细胞数为: (a) OM 车厂: 5.92 x 10³ @ 4.27 x 10³;(b) SC 车厂: 4.12 x 10³ @ 2.1 x 10³。两个仓库的细胞的生存能力超过90%。

4. 成脂在离体内皮细胞中的诱导

1. 在37摄氏度, 5% CO₂孵化器中, 用完整的 EGM-2 培养基在6井组织培养处理的板材中生长细胞。每3–4天更换介质, 直到细胞达到80–90% 汇合。
   注: 人口加倍是在2–3天之间。
2. 在100毫米培养皿上涂上细胞, 然后将细胞分成1:3 次, 然后将其展开。在这个阶段, 细胞在2通道上。
3. 使用自动单元格计数器计数单元格 (参见材料表)。
4. 种子大约100–200,000 细胞成6井板确保每个车厂重复井, 并培养他们在完整的 EGM-2 媒体2天。
5. 吸取任何生长培养基, 并用2毫升的 DMEM/F12 与5% 的血清和50µg/毫升的青霉素/链霉素的控制细胞, 并取代它与2毫升的成脂培养基 (见步骤 1.4) 的治疗细胞。
6. 在湿润 5% CO₂孵化器中孵育37摄氏度的细胞13天, 每3到4天更换各自的培养基。
   注: 在治疗4天后, 细胞将开始积聚脂质。
7. 根据公布的方法^15-17进行破产和尼罗河红染色。
8. 要分离 RNA 提取的细胞, 从6井感应板中取出介质, 用1毫升的无菌 PBS 冲洗。
9. 添加350µL guanidium 硫氰酸盐-苯酚-氯仿溶液 (见材料表), 并在室温下孵化5–10分钟。
10. 用细胞刮刀刮掉盘子上的细胞, 将细胞转移到1.5 毫升的离心管上。
    注: 样品可存储在-80 °c 冷冻库中, 用于 RNA 提取和以后进一步处理。
11. 使用一种适应的 RNA 萃取协议从样品中提取 mRNA (见材料表)。
12. 使用以下探针进行实时聚合酶链反应 (rt-pcr) 来评估基因表达: 脂联素、UCP-1 和 CIDEA (见材料表)。
    注: 在这里, RT PCR 程序是采用以下标准协议: 变性 (95 °c; 十五年代), 退火和延长 (60 °c; 1 分钟) 40 循环。用 C_T值 > 35 表达基因的样本被认为是无法检测的。

结果

我们的协议旨在提供一种体外方法, 以确定 CD34+CD31+ 血管细胞从不同的储存库的人脂肪组织的脂肪电位。图 1A显示了简化流程图。第一步使用阳性选择的 CD34 表达细胞导致 > 95% CD34+ 细胞在人口的新鲜隔离细胞 (图 1A)。重要的是, 这个标记是丢失后, 细胞培养了几个段落。由于 CD34 是多种造血和非造血祖细胞的常见标记, 因?...

讨论

本文的重点是为 CD34+CD31+ 内皮细胞从内脏和皮下的脂肪组织的分离、扩增和脂肪诱导提供一种方法。

已报告的方法, 以隔离从不同的啮齿动物或人类的血管床内皮细胞, 主要涉及使用 CD31 抗体荧光标记或耦合磁性珠^{18,19,20,21,22,23}....

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Water Bath	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Electrophoresis Box	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescent Microscope	Olympus	BX50
Inverted Microscope	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Bovine Serum Albumin	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Syringe	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetting Needles	Popper	7934
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Dishes, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Treated
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Viability Stain	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridine Orange/Propidium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Beads	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connector Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-well chambered slides	Corning Life Sciences	354559	Fibronectin coated
4-well chambered slides	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Uncoated glass
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Bovine Serum (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulin	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96 well PCR plates	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, with PCR Buffer N
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final in PCR reaction
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	40% stock solution
Ammonium Persulfate	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	Mouse monoclonal
Anti-pAKT antibody	Cell Signaling Technology	9271S	Rabbit polyclonal
Anti-UCP1 antibody	Abcam	ab10983	Rabbit polyclonal
Anti-Mouse IgG antibody	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG antibody	LI-COR	926-32211	Goat Polyclonal, IRDye 800CW
Anti-Rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Phosphate Buffer Saline	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15686	4% solution for cell fixation
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% blocking solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% permeabilization solution
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI labeled Acetylated LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484