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摘要

体内微透析已使大脑间质液中存在的分子从清醒的、自由行为的动物中收集。为了分析该化合物中相对较大的分子, 本文重点研究了用高分子量切断膜探针的微透析协议。

摘要

在体内微透析是一种强大的技术, 收集从清醒, 自由行为的动物基于透析原理。虽然微透析是一种测量相对较小的分子, 包括氨基酸或神经递质的已建立的方法, 它最近也被用来评估大分子的动力学, 利用探针与高分子量切断膜。使用这种探针时, 微透析必须以推拉模式运行, 以避免探头内部积聚的压力。本文提供了分步协议, 包括立体定向手术, 以及如何建立微透析线收集蛋白质从。在微透析中, 药物可以系统地或直接输注到疫苗中。反向微透析技术是直接将化合物注入到其上的一种方法。在微透析灌注缓冲器中加入药物, 可使它们通过探针扩散到。以头蛋白为例, 通过对化学点燃癫痫的反向微透析, 揭示了其水平在刺激神经元活性方面的变化。本文结合其他体内方法, 介绍了微透析技术的优点和局限性。

引言

该方法包括总脑容积的 15-20%, 并提供了一个关键的微环境对信号传导, 基质运输和废物清除1。因此, 收集活体动物的能力将对各种生物过程和疾病机制带来更大的影响。体内微透析是从清醒的、自由移动的动物中取样和量化细胞外分子的为数不多的方法之一, 从而在神经科学研究领域2、3中成为有用的工具。在该方法中, 透膜的微透析探针插入脑中, 以相对缓慢的流速 (0.1-5 µL/分钟) 灌流灌注缓冲液。在此灌注过程中, 细胞外分子根据浓度梯度被动扩散到探针中, 并作为透析液收集。虽然本文的重点是对脑部标本的方法, 但无论是原则还是方法, 都可以通过适当的修改在必要的情况下应用于其他器官。

微透析在二十世纪六十年代代初首次被使用, 从那时起, 它被广泛用于收集小分子, 包括氨基酸或脑内神经递质。然而, 最近的商业可用性微透析探针与高分子量的切割膜 (100 kDa-3 MDa) 已扩大其应用到相对较大的蛋白质, 以及4,5,6 ,7。使用这些探针的研究结果发现, 长时间被认为是专属细胞质的头或α synuclein 的蛋白质也在生理上存在于4,5,8。

使用微透析探针与大型切断膜 (通常超过 1000 kDa) 的难点之一是, 由于探针中积聚的内压, 它们更容易受到超滤液的损耗。这里使用的微透析探针有一个独特的结构来避免这个问题。压力不会被建立由于这个结构, 因此微透析与这些探针应该操作在 "推挤-拉扯" 方式使用注射器泵灌注探针 (= 推挤) 和滚筒/蠕动泵收集从探针出口的透析器(= 拉)9 (虽然它需要推挤和拉扯泵, 由于压力取消透气孔存在于探针, 系统在技术上仅由拉扯泵驱动)。本文从引导套管植入的立体定向手术入手, 介绍了如何建立微透析线, 以便通过微透析探针与 1000 kDa 膜分离来采集。

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研究方案

所有动物研究都由东京大学医学研究生院机构动物护理和使用委员会审查和批准。

1. 手术前的程序

  1. 在开始手术前, 用70% 乙醇擦拭所有的东西以保持不育的条件。推荐使用加热垫的热支持。
  2. 麻醉对小鼠进行腹腔注射水合氯醛 (400 毫克/千克)。通过执行脚趾夹来确认麻醉。推荐使用 meloxicam SR 在感应和丁丙诺啡恢复出价至少24小时。
  3. 用手术剪刀刮头发。用耳棒和鼻钳固定鼠标和新生老鼠适配器。
    注意: 确保鼠标头在这个阶段是安全的, 并且不并排移动是非常关键的。
  4. 在麻醉时, 应将兽医软膏涂抹于眼部, 以防干燥。

2. 引导套管植入的立体定向手术

  1. 在立体定向装置上设置鼠标和新生大鼠适配器。用手术刀在头骨的皮肤上做切口弧矢。用湿棉签擦拭头骨上的血液和结缔组织。
  2. 用脑图谱确定大脑感兴趣区域的坐标。在开始测量之前, 确保中线是直的, 以便钻头可以移动 A P 和保持在中线缝合的整个时间。
    注: 本文使用坐标 (A/P:-3.1 毫米, 米/升:-2.5 毫米, d-/V:-1.2 毫米, 12 度) 靶向后海马。
  3. 水平头骨 A-P
    1. 在立体定向的机械手上安装钻头。向下钻, 直到它轻轻地接触 lambda 并记录其腹侧坐标。对 bregma 重复此过程。
      注意: 当头骨被夷为平地时, bregma 的垂直测量等于 lambda。如果没有, 相应调整鼻钳的高度。在头骨被夷为平地后, 记录 bregma 的前/后侧坐标。
  4. 水平头骨左-右
    1. 将钻头从 bregma 移动到坐标 (A/P:-3.1 毫米, 米/升: +2.0 毫米), 将钻头下钻到头骨并记录垂直坐标。然后重复此过程的坐标 (A/P:-3.1 毫米, 米/升:-2.0 毫米)。
      注: 如果头骨被夷为平地, 这些垂直测量的两个等距点从中线是平等的。如果没有, 则调整耳棒的高度。
  5. 小心地在靶坐标系上钻一个毛刺孔 (a/P:-3.1 毫米, M/升:-2.5 毫米) 以植入导套管。如果毛刺孔的直径不够大, 不能用于引导套管植入, 请钻另一个与第一个孔重叠的洞。在右侧 (对侧) 壁骨上钻另一孔, 插入骨螺钉, 这有助于确保1.10 的牙科水泥 (见图 1B)。
  6. 用剃刀刀片从1.5 毫升离心机管盖的后侧切开一个圆形锁片, 然后做一个 "皇冠"。这种皇冠是用来防止牙科水泥蔓延到皮肤。把它放在头骨上, 使步骤2.5 中的毛刺孔留在圆圈内 (见图 1)。
  7. 通过将引导套管放在立体定向适配器的较短臂上, 并使用帽螺母将其固定, 从而设置立体定向组件。在电极钳上设置立体定向适配器的长臂。将其附着在立体定向装置的机械手上 (见图 1A)。
  8. 旋转机械手臂上的 d-V stereotax 组件12度 (见图 1B)。将导套管移至1.6 所制造的毛刺孔。通过降低1.2 毫米, 将引导套管慢慢插入大脑。
    注: 探针的角度特定于海马体;其他地区可能需要其他角度或根本没有角度。请参考大脑图谱以得到精确的坐标。干的头骨表面, 因为如果没有水泥将不坚持和水泥帽可以成为脱落
  9. 在牙冠内添加牙科水泥, 以充分覆盖导套管的金属部分和足够的螺钉来保护它们。如果头骨中有一部分被暴露, 则应用附加的牙科水泥。
  10. 等待, 直到牙科水泥完全干燥 (~ 12-20 分钟)。从电极钳上卸下立体定向适配器。取下瓶盖螺母, 用一个虚拟探头替换立体定向适配器, 并固定盖螺母。
  11. 将鼠标从立体定向装置中释放, 并将鼠标单独放在单独的笼子里。
    注意: 鼠标不应该被留在无人看管, 直到它恢复了足够的意识, 以维持胸骨卧床。每天检查鼠标直到微透析。老鼠收到的非甾体类抗炎, 如卡洛芬, 如果它似乎是在疼痛。等待2周对睡眠唤醒的研究是必要的, 所以鼠标 habituates 到新的环境10, 但其他类型的研究可能需要较短的恢复期 (例如, 1-2 天)。

3. 微透析设置

  1. 探针质量检查: 用蒸馏回水填充一次性1ml 注射器, 用 byton 管将其连接到探头的插座 (较短的端口)。用手指盖住排气孔, 轻轻地压低注射器的柱塞, 将水注入探针。检查探头入口是否出现水, 微透析膜表面没有渗漏。
    1. 探针活化: 将探针的膜浸入乙醇 (70-100%) 两秒钟。然后再用注射器将蒸馏水注入探针。
  2. 灌注缓冲剂的制备: 为了避免靶分子与油管的粘附, 添加 bsa 通过稀释 30% bsa 溶液到4% 与人工脑脊液 (1.3 毫米 CaCl2, 1.2 毫米 MgSO4, 3 毫米氯化钾, 0.4 毫米的 NaHCO2., 122 毫米氯化钠, pH 值 = 7.35), 与脑脊液中的电解质浓度密切相关, 在使用前立即。用0.1 µm 孔径的注射器过滤器过滤灌注缓冲器。
    注: 4% BSA 提高了黏附蛋白的回收率, 但可以严重限制化合物的传递, 特别是对具有高 BSA 结合性的化合物。这是使用较低浓度的 BSA (如 0.15%) 在某些情况下,3的优势之一。注意, BSA 可以很容易地聚集时, 由涡流或搅拌板搅拌。这些骨料可以堵塞探针或膜孔。在准备 BSA 解决方案以限制此聚合时, 请谨慎使用
  3. 为入口和出口准备两条单独的线路 (见图 1C), 并用连接针连接两条线。填充一个一次性的3毫升注射器填充灌注缓冲, 并连接到导管的入口端使用钝端针。通过运行注射器泵填充整个油管与灌注缓冲。
  4. 使用步骤3.3 中的活化微透析探针, 停止注射器泵并更换进线和出口线之间的连接针 (见图 1C)。在更换之前, 把瓶盖螺母放在探头上。
  5. 在滚筒泵的出口油管上安装滚子管。启动注射器泵在10µL/分钟, 然后辊泵的速度稍慢 (9.5-9.8 µL/分钟)。确保删除整个油管中的所有气泡, 这可能会影响他们进入探头时的恢复。
  6. 麻醉步骤1.12 中的鼠标与步骤1.2 中的方法相同。把鼠标项圈放在脖子上。取下帽螺母和假探头, 慢慢地从3.4 通过导套管插入微透析探针, 并固定盖螺母。
  7. 将鼠标放在连接到自由移动系统的笼子里, 并将鼠标拴在衣领上。在步骤3.5 中, 保持注射器泵和滚子泵的运行速度至少为1小时。
    注意: 为了达到从醒的动物收集, 这篇文章使用一个自由移动的系统, 笼子本身响应动物的运动, 以防止油管扭曲。另外, 也可以使用各种公司提供的液体旋转。
  8. 先停止滚筒泵, 然后再用注射器泵。设置所需的流速率。运行注射器泵比滚筒泵快20%。
    注: 例如, 如果你运行在1µL/分钟, 操作注射器泵在1.2 µL/分钟. 最佳流速应根据经验对每个分子。
  9. 收集样品: 将出口油管的自由端放在冷藏馏分收集器上。
    注: 适当的样品体积因分析使用的化验结果而异。
  10. 实验完成后, 取出探头。(根据需要麻醉鼠标。 处理鼠标恢复与步骤2.11 中的方法相同。用 HPLC 法和 ELISA 方法对采集的试剂进行分析。
  11. 要在微透析后冲洗整个油管, 请用连接针替换探头, 并在整个油管中运行稀释漂白剂, 然后用清水冲洗。干燥和储存, 以重复使用。
    注: 其他类型的油管是可以接受的, 但是, 在灌注缓冲中 BSA 可以堵塞小直径的油管, 因此这些油管被认为是一次性使用。油管可以在多次使用后被磨损或堵塞, 所以确保每次使用前的流量都是一致的。

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结果

为了刺激或抑制反向微透析11,12,13, 化学点燃癫痫, GABAA受体拮抗剂或河豚毒素的神经活动, Na+通道阻滞药已被使用。结果表明, 通过神经元活动的增加13,14刺激了头的释放。与以前的观察一致, 当50µM 化学点燃癫痫 (PTX) 通过反向微透析 (参见讨?...

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讨论

高分子量切断膜的微透析必须采用推拉方式操作, 因此流速准确、恒定是至关重要的。流动速率的不准确性可能是气泡产生的原因和样品浓度不一致。如果流程不一致, 请检查所有连接是否有泄漏。如果问题仍然存在, 可能需要重新启动新的探头和油管。

Microdilaysis 探头通过灌注缓冲液不断灌注。因此, 细胞外分子没有足够的时间在灌注缓冲液中达到完全平衡。因此, 透析液中?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了来自下个和年轻科学家 (B) (16K20969) 资助的 "对创新领域 (脑蛋白质老化和痴呆控制) (15H01552) 进行科学研究的资助" 的支持。作者感谢 David m. Holtzman 博士和 Cirrito 博士在这一方法的发展过程中提出的技术建议。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
The Univentor 820 MicrosamplerUniventor8303002Refrigerated fraction collector
Syringe pumpKD scientificKDS-101
Roller pumpEicom microdialysisERP-10
Raturn Stand-Alone SystemBASiMD-1409Free-moving system
Dual species cage kitBASiCX-1600
AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm)Eicom microdialysisPEP-8-02Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical.
Microdialysis guide (shaft length 8 mm)Eicom microdialysisPEG-8
Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm)Eicom microdialysisPED-8
Bone screwBASiMD-1310
Super bond C&B setSunmedicalDental cement
Small animal Stereotaxic Instrument with digital display consoleKopfModel 940Stereotaxic apparatus
Mouse and neonatal rat adaptorStoelting51625
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse StereotaxicStoelting51648
Albumin solution from bovine serumSigmaA7284-50ML30% BSA solution
FEP tubing (70 cm)Eicom microdialysisJF-10-70Internal volume = 0.5 µL/cm
Teflon tubing (50 cm)Eicom microdialysisJT-10-50Internal volume = 0.08 µL/cm
Byton tubeEicom microdialysisJB-30
Intramedic luer stab adaptor 23GBD427565Blunt end needle
Roller tubeEicom microdialysisRT-5SInternal volume = 4 µL
Cap nutEicom microdialysisAC-5
0.25 mL microcentrifuge tube with capQSP503-QTubes for fraction collector
Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm)Eicom microdialysisPESG-8
Connection needleEicom microdialysisRTJ
Mouse animal collarBASiMD-1365
High Speed Rotary Micromotor kitFOREDOMK.1070Drill
PicrotoxinSigmaP1675
Screw driver for bone screws
Scalpel
Cotton swab
Surgical clipper

参考文献

  1. Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
  2. Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free-moving animals. Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).
  3. Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
  4. Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
  5. Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
  6. Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).
  7. Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
  8. Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
  9. Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
  10. Kang, J. -E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
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  13. Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
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  16. Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).
  17. Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).

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