立体定向移植人胶质瘤多形性移植小鼠细胞毒性免疫细胞模型的研究

摘要

在这里, 我们提出了一项协议, 以制备和立体定向管理的异基因人淋巴细胞在 immunodeficient 小鼠携带原位人原发性脑肿瘤。本研究为 intrabrain 细胞免疫疗法的可行性和抗肿瘤疗效提供了概念验证。

摘要

胶质瘤多形性 (肾小球) 是成人中最常见和最有攻击性的原发性脑癌, 通常与预后较差有关, 在过去十年中提出了缺乏有效的治疗方法。在设计新的治疗策略的有希望的候选者中, 细胞免疫疗法已被用来消除高度侵袭性和化疗放射抗拒肿瘤细胞, 可能涉及迅速和致命复发的癌症。因此, 在肿瘤附近的同种异体肾小球-反应性免疫细胞效应剂 (如人 vυ9vδ2 T 淋巴细胞) 的管理, 将是一个独特的机会, 以提供高效和高度集中的治疗药物直接进入脑恶性肿瘤现场。在这里, 我们提出了一项协议, 以制备和立体定向管理的异基因人淋巴细胞在 immunodeficient 小鼠携带原位人原发性脑肿瘤。本研究为这些细胞免疫疗法的可行性和抗肿瘤效果提供了一个临床前的概念证明, 它们依赖于 intrabrain 肿瘤床内的异基因人淋巴细胞的立体定向注射。

引言

肾小球 (IV. 型星形细胞瘤) 是成人最常见和最有攻击性的原发性脑癌。尽管有积极的治疗, 结合手术和射频化疗, 肾小球仍然与一个非常糟糕的预后 (中位存活率14.6 月和2年死亡率 > 73%)¹。这一证据表明, 在过去十年²中, 没有有效的治疗进展得到证实。在设计更有效的治疗策略^3,4,5, 免疫疗法⁶的候选者中, 目前正在探索追踪和消除高度侵入性和无线电/抗化疗肿瘤细胞, 怀疑他们的关键贡献迅速和致命的肿瘤复发⁷。对免疫疗法的各种潜在免疫指标进行了鉴定和建议, 涉及天然或改良的αβ或υδ T 淋巴细胞, 如肾小球特异肿瘤抗原或应力诱导分子^{8,9, 10}。管理选定的肾小球活性免疫细胞效应器的可能性代表了一个独特的机会, 提供高数量的效应淋巴细胞直接进入残余恶性肿瘤的部位。为支持这一策略, 我们最近发现, 基于 immunodeficient 小鼠的同种异体肾小球移植的模型忠实地重述了肾小球肿瘤的发展^9,11。此外, 这些模型被用来证明过继转输转移异体人 vυ9vδ2t 淋巴细胞的强抗癌功效。

本协议描述了在同种异体 T 淋巴细胞的移植基础上实现脑肿瘤立体定向免疫疗法的关键实验步骤。本文说明: (i) 治疗同种异体免疫效应 T 淋巴细胞 (如人 vυ9vδ2t 淋巴细胞) 的扩增;(ii) 制备注射用的这些效应 T 淋巴细胞;(iii) 大脑内立体定向管理的程序, 靠近肿瘤。本文还介绍了立体定向注射后这些细胞效应的行为。

这里提出的治疗方法是基于每剂量 20 x 10⁶效应细胞为每个脑肿瘤-轴承 immunodeficient 鼠注射。一个初始的体外扩张步骤是需要产生大量的免疫细胞。因此, 非特异细胞扩张是使用 phytohemagglutinin (PHA L) 和辐照异基因饲养细胞: 外周血单个核细胞 (PBMCs) 的健康捐献者和 eb 病毒 (eb) 转换的 B-永生细胞线 (BLCLs), 从 PBMCs 的体外感染, 从狨 B95-8 细胞系的 eb 病毒的培养上清液中提取, 在1µg/毫升环孢素 a 的存在。

从体外测定⁹中比较和选择了肾小球活性效应免疫细胞。这些效应细胞的激活和放大使用标准协议, 根据其性质 (例如, 人类 Vγ9Vδ2 T 淋巴细胞⁹或人抗疱疹病毒αβ T 淋巴细胞¹²) 与最低纯度 > 80%, 例行由细胞分析检查。下面详述的细胞扩张程序适用于各种人类淋巴细胞子集。

研究方案

下列涉及动物的程序是根据机构指南 (协议 #00186) 执行的. 02; 意大利 (法国) 的区域道德委员会人类 PBMCs 从知情的健康捐献者的血液中分离出来 (景区法国法国南特)。所有步骤都是在无菌条件下进行的。

1. 细胞毒性效应 T 淋巴细胞的非特异扩张

1. 准备并照射35的馈线细胞。为刺激 2 x 10⁵ -4 x 10⁵个效应细胞, 准备 10 x 10⁶ PBMCs 和 1 x 10⁶ BLCLs 从三个不同, 健康捐赠者。
2. 并用重悬15毫升 RPMI 中的饲养细胞和效应细胞, 辅以10% 热灭活 FCS、2毫米 l-谷氨酰胺、青霉素 (100 毫升/ml)、链霉素 (0.1 µg/毫升) 和300毫升/ml 重组 IL-2。
3. 在最终浓度为1µg/毫升, 仔细混合, 并分配150µL 的细胞悬浮每井在96井 U 底板。
4. 孵育在37°c 和与 5% CO₂在一个湿润的大气。
5. 每日检查板材直到大细胞团簇形成在养殖井 (~ 天 7)。
6. 在新鲜培养基中将细胞转化为 1 x 10⁶细胞/毫升的培养瓶。
7. 通过计数 (每周 2x) 确定细胞总数, 并在新鲜培养基中保持 1 x 10⁶细胞/毫升。
   注意: 效应免疫细胞应准备好治疗管理的休息状态 (通常3周后, 最初的放大刺激)。在体内注射前应检查这些效应细胞的纯度和反应性 (如体外测定)。

2. 手术前效应细胞的制备

1. 在检查效应细胞计数后, 通过离心 (300 x g 5 分钟) 收集50毫升管中的效应细胞。
   注: 为弥补任何损失, 准备过量的细胞 (例如, 50 x 10⁶)。
2. 小心取出上清液, 在15毫升的无菌 PBS 和离心机中并用重悬细胞, 在 300 x g 5 分钟进行洗涤。
3. 仔细和彻底清除上清, 然后并用重悬细胞颗粒在1毫升的无菌 PBS。
4. 将悬浮细胞转移到一个1.5 毫升的微细中, 以 300 x g的离心为5分钟。
5. 小心, 完全清除上清吹打缓慢。
6. 并用重悬细胞颗粒在8µL 不育 PBS 每只老鼠。
   注意: 这是一个关键步骤。
7. 使用微测量细胞悬浮液的体积。如果需要, 添加无菌 pbs (20 x 10⁶细胞在每剂量的 PBS 的15µL), 并仔细混合。
8. 使用微检查, 每个鼠标的最终音量介于15和 20 ul 之间 (势在必行 < 20 µL)。
9. 保持细胞在冰上, 直到立体定向注射。
   注: 超过3小时 timepoints 未测试。

3. 立体定向注射

1. 设备安装
   1. 根据制造商的指示, 组装和校准小型动物立体定向框架, 以确保颅内注射的准确性 (如注射器大小、所需体积和注射率)。
      注: 建议采用慢速输液 (即2-3 µL/分钟)。
   2. 在微生物安全柜 (MSC) 下安装材料, 以维持器械的不育, 保护小鼠不受感染。
      注: 在37摄氏度的水浴中放置 "等温集团"。这个系统限制了小鼠在手术中的体温过低。加热垫, 这是必要的后程序护理, 必须使用在连续的温度监测。
2. 手术前动物制剂
   1. 麻醉小鼠腹腔注射氯胺酮 (10 毫克/毫升) 和甲苯噻嗪 (0.1 毫克/毫升) 在10µL/克体重的鼠标。
   2. 执行脚趾捏试验, 以确保完全麻醉和镇痛的动物。
      注意: 任何运动都是不深镇痛的征兆, 如果出现这种情况, 在重复手术前需要几分钟的时间。
   3. 一旦鼠标被正确麻醉, 使用剪刀从手术部位 (两个耳朵之间, 由鼻子) 去除皮毛。
3. 手术前细胞准备
   1. 在每次注射前用吸管 (几次) 仔细并用重悬细胞, 以防止细胞结块。
   2. 仔细绘制所需的细胞悬浮量 (15-20 µL) 到22克微量泵, 以避免气泡的渴望。
      注意: 这个单元格加载步骤进入微量泵是很重要的, 以尽量减少差异的注入量。在程序之间重新加载每个单独注入的单元格, 以防止细胞聚集, 并确保队列中的效应细胞管理甚至数量。
   3. 然后, 把注射器放进适应的注射器泵中。
4. 程序护理
   1. 使用聚维酮碘5% 溶液浸泡的拭子对手术部位进行消毒, 至少3x。
   2. 在鼠标的眼睛里放一个润滑的眼膏, 防止角膜的任何干燥。
   3. 将麻醉的鼠标放在立体定向的框架上, 在一个温暖的等温块上, 覆盖着无菌塑料包装, 以维持在手术中的老鼠的体温, 并限制死亡率。
      注: 鼠标的鼻子和牙齿应适当地放置在牙杆上方, 以确保在手术过程中有足够的呼吸流量。
   4. 一旦鼠标定位在牙杆上方, 将耳棒牢牢地拧紧在鼠标的耳朵下, 以固定头部。
      注意: 小心不要破坏耳膜或损害呼吸。
   5. 用无菌剪刀在颅骨的上半部, 从前到后, 使头骨显露出 1-2 厘米中线矢状皮肤切口。
   6. 确定矢状和冠状缝线 (Bregma) 的交叉点, 作为注射前立体定向定位的地标 (如图 1所示)。
   7. 把微量泵放在这一点上。
   8. 移动微量泵2毫米右侧面和0.5 毫米前的 Bregma。
   9. 使用 microdrill, 在预定坐标处用无菌钻头在头骨上做一个小孔。小心保持肤浅, 以避免任何外伤的大脑。
      注: 在本议定书中, 免疫细胞注射在一个已建立的肿瘤 (肿瘤细胞注射后一周)。皮肤应重新打开 (疤痕) 和注射是执行在同一坐标用于肿瘤细胞植入 (孔通常仍然存在2周后注射)。在脑实质^13、14中为注射肿瘤和效应细胞选择了坐标。
5. 免疫效应细胞的注射
   1. 小心地将微量泵插入钻孔中, 缓慢移动, 将针3毫米向下的硬脑膜, 然后向后0.5 毫米到最后深度2.5 毫米之前注入效应细胞。
   2. 在 2-3 µL/分钟内运行效应细胞注射, 并在注射时间内监测小鼠。
   3. 一旦注射完成, 取出针仅1毫米, 并保持微量泵在一个额外的分钟, 然后慢慢地完全撤回微量泵, 以防止任何渗漏从输液现场。
      注: 在将动物从立体定向装置移走后, 立即清洁注射设备进行实验。
6. 小鼠术后护理及随访
   1. 将动物从立体定向的框架中取出, 立即在切口部位应用聚维酮碘5% 溶液, 用适当的手术缝合闭合皮肤。
   2. 在伤口上直接应用2% 利多卡因凝胶, 用皮下注射治疗丁丙诺啡0.15 µg/克, 术后镇痛。
   3. 将被麻醉的老鼠放回它的笼子上面的加热垫设置为37°c, 以保持适当的老鼠体温和避免任何体温过低。
      注: 不需要单独的住房。
   4. 监视鼠标直到它完全从麻醉中恢复, 并将其转移到一个住房室。
      注意: 到目前为止, 该协议得到很好的支持, 因为很少发生意外并发症 (< 5% 的注射小鼠)。
   5. 每日监测小鼠和弄死, 当任何下降的健康迹象被观察 (例如, 驼背的姿势, 减少流动性, 虚脱, 或重大体重下降 [≥ 15%])。

结果

这项研究描述了在肿瘤携带的小鼠脑内进行细胞免疫效应细胞转移的策略, 其基础是直接在瘤床内进行的立体定向注射。

为了尽量减少与大注射量相关的脑损伤的风险, 需要将效应细胞悬浮液集中 (20 x 10⁶细胞在 PBS 的 15-20 µL 中)。为了检查这个细胞浓度步骤是否可能影响效应细胞的生存能力, 这些细胞是根据所描述的协...

讨论

经选择的本机或工程免疫效应细胞的移植, 是有效治疗肿瘤的一种有希望的方法, 如浸润性脑癌, 注意限制活性对非转化细胞^{15, 16,17,18}。然而, 包括大脑在内的中枢神经系统具有特殊的免疫状态, 特别是由于血脑屏障的存在以及缺乏典型的淋巴引流系统^19、20。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBMCs			from 3 different healthy donors
BLCLs			from 3 different donors
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)	Gibco	31870-025
FCS	Dutscher	S1810-500
L-glutamine	Gibco	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
IL-2	Novartis	proleukin
PHA-L	Sigma	L4144
Stereotaxic frame	Stoelting Co.	51600
Mouse adaptator for stereotaxic frame	Stoelting Co.	51624
microsyringe pump injector	WPI	UMP3-4
NanoFil Syringe	WPI	NF34BV-2
NSG mice	Charles River	NSGSSFE07S
Ketamine	Merial	Imalgène 1000
Xylazine	Bayer	Rompur 2%
Scissors	WPI	201758
Forceps	WPI	501215
OmniDrill 115/230V	WPI	503598
Vicryl 4-0	Ethicon	VCP397H
Xylocaine	Astrazeneca	3634461