体内结肠细胞 Photolabeling 对新生小鼠造血细胞迁移潜能的评价

摘要

这里描述的协议使用了 photolabeling 方法在新生老鼠特别辨认免疫细胞移居从结肠到肠外的站点。这一策略将有助于研究早期生命中宿主-微生物的相互作用。

摘要

肠道细菌群落是早期建立的, 对免疫细胞的发育和功能有影响。新生儿微生物群易受多种外部影响, 包括抗生素的使用和饮食, 这会影响对自身免疫和炎症性疾病的敏感性。炎症性肠病 (IBD) 等疾病的特点是大量的免疫细胞涌入肠道。然而, 由微生物群所调节的免疫细胞可能会另外从肠道中移出, 以影响肠道的免疫应答。因此, 有必要识别和鉴定可能携带微生物信息从肠道到远端部位的细胞。在这里, 我们描述了一种方法来标记细胞在结肠的新生小鼠在体内, 使他们的身份, 在肠外的地方, 迁移后鉴定。

引言

哺乳动物胃肠道有数以百计的细菌存在于与宿主¹的共生关系中。在当地环境中存在的免疫细胞加强了与这些微生物的和平共处, 并对病菌入侵建立了保护性屏障。因此, 免疫细胞和微生物群之间的双向相互作用是建立一个共生社区, 教育宿主免疫系统并设定免疫反应性的阈值的关键。微生物组成的变化, 或 dysbiosis, 可能扰乱免疫动态平衡和扰乱调节电路, 抑制肠道炎症导致免疫介导的疾病, 如1型糖尿病和 IBD^2,3.

出生后的时间是一个独特的发展窗口, 肠道微生物群落开始建立的同时免疫系统成熟⁴。产后微生物群是不稳定的, 与转移在社区构成自然地和频繁地发生⁵。与微生物群相互作用的免疫细胞位于肠道的两个不同的解剖位置--固有层和肠道上皮⁶。许多类型的免疫细胞存在于肠道, 包括淋巴细胞 (如 T 细胞, B 细胞, 和先天淋巴细胞) 以及髓细胞 (包括树突状细胞, 单核, 和巨细胞)。这些细胞, 也称为造血细胞, 执行多种功能, 保持肠道屏障和维持动态平衡。

除了在肠道部位的调节功能外, 粘膜的免疫细胞还可能携带微生物信息到肠外的部位, 以调节全身免疫^7、8、9。这是一个日益增长的研究兴趣的领域, 并强调需要的方法, 以确定免疫细胞迁移出肠道组织, 以探讨其功能。这里报告的协议使用了一个商业上可用的老鼠模型, 其中 photoconvertible 荧光蛋白被利用来标记细胞。范^切除小鼠无所不在表达绿色荧光 Dendra2 蛋白, 是不可逆转地切换到红色荧光激活时紫外线 (UV) 光¹⁰。利用光纤套管将405纳米光传送到新生小鼠结肠中, 我们证明了 photoconverted 造血细胞 (起源于或通过结肠过渡) 可以在脾脏中找到。

研究方案

所有动物程序都是在马萨诸塞州总医院的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准和遵守的情况下进行的。

注意: 此协议涉及使用3b 类激光 (LG3)。LG3 激光安全护目镜在操作激光时必须始终使用。必须遵循适当的培训和安全准则, 以避免受伤的危险。

1. 激光的设计与装配

1. 通过连接到 led 的4针 M8 连接器电缆, 将发光二极管 (LED) (405 nm、19.3 兆瓦、1400 mA、光纤耦合) 连接到 led 驱动程序。小心拧紧螺钉以固定连接。
2. 在将光遗传学补丁电缆连接到 led 之前, 请按住指示灯的连接器打开至指示灯, 以确保没有可见障碍物。吹孔, 以消除任何障碍, 如果必要的, 并插入光遗传学补丁电缆进入开口。
3. 通过将套管插入连接器套筒的任一端, 将光纤套管连接到光遗传学贴片电缆。将连接器套筒的另一端连接到修补电缆。 施加足够的压力, 以确保连接, 但要小心不要弯曲或打破在套管中的光纤。
   注: 当激光不使用时, 脆弱的光纤套管被保护罩覆盖。
4. 将 LED 驱动程序设置为连续波 (CW) 模式, 连续调整旋钮为 0, 当前限制设置为 1.2 A。

2. 结肠中细胞的 Photoconversion

注: 雄性和雌性小鼠在出生后暴露于 intracolonic 405 nm, 1-2 天, 在1岁之前被献祭。

1. 安全的一个黑暗的位置, 进入一个电源插座。将 LED 驱动程序插入插座。
   注意: 这一过程是在最小的白光, 因为长时间暴露的小鼠对周围的光可能导致不必要的 photoconversion 细胞。红灯被用作替代品。
   注意: 以下步骤涉及使用动物麻醉剂。麻醉的管理发生在二类敞篷或使用另一个适当的清除系统。吸入麻醉药可能会引起头晕、嗜睡甚至昏迷。
2. 麻醉 4-5% 异氟醚在感应盒 100% O2 中接触到的小鼠。通过紧捏后爪 (无反应) 来验证适当的麻醉深度。通过鼻锥在大约2% 异氟醚保持麻醉。使用适当的罩或麻醉剂清除装置, 防止处理程序暴露于异氟醚。
3. 使用1只手用食指和拇指将鼠标的背部轻轻地背在 intracolonic 上, 将麻醉鼠标放置在其上。把鼠标打开, 露出腹部。松开手柄, 如果鼠标开始失去其粉红色的颜色或它的呼吸速度开始减慢。在圆环和小手指之间保护鼠标的尾部。
4. 另一方面, 从套管上取下防护帽。在保持套管与鼠标中线平行的长轴时, 轻轻地将光纤套管插入肛门内, 以便所有5毫米光纤都在鼠标内。
   注意: 本程序执行缓慢, 小心不要穿孔结肠壁。分钟摆动和扭曲的套管帮助推进到结肠。
5. 戴上安全护目镜, 将激光电流增加到最大值 (顺时针方向)。通过观察鼠标的半透明腹部来确认紫外线的存在。
   注: LG3 激光安全护目镜显著降低能见度。有一个同事 (佩戴防护设备) 协助戴上护目镜并打开激光。
6. 将冒号暴露在激光照射下, 共2分钟. 每三十年代取出套管大约1毫米, 以最大限度地扩大暴露在光线下的腔区。在2分钟结束时, 关掉激光。
7. 慢慢地从鼠标中取出套管。在一个空温暖的笼子里从麻醉中恢复后, 把老鼠送回家庭笼子。

3. 肠道淋巴细胞的分离

1. 准备 1 L 的汉克平衡盐溶液/小牛血清 (HBSS/CS) 缓冲, 200 毫升的上皮带缓冲, 500 毫升的洗涤介质, 200 毫升的乙二胺四乙酸 (EDTA) 无洗涤介质。
   注: 试剂卷的计算样本大小为9。
   1. 通过增加50毫升的 cs 到950毫升的 HBSS, 使 HBSS/cs 缓冲器 (HBSS; 5% cs)。把它储存在冰上。
   2. 准备上皮带缓冲液 [HBSS; 5% CS; 1 毫米 dithiothreitol (德勤); 5 毫米 edta; 15 毫米 4-(2-羟乙基) piperazine-1-ethanesulfonic 酸 (HEPES) (pH 7.2-7.5)] 通过加入10毫升的 CS, 200 µL 的 1 m 的, 毫升的 EDTA, 2 毫升的0.5 米的 HEPES 缓冲到3毫升的 HBSS。将上皮带缓冲剂放置在37摄氏度的水浴中。
   3. 通过增加5毫升的 cs 和1毫升的0.5 米 edta 到494毫升的 HBSS, 使洗涤介质 (HBSS; 1% cs; 1 毫米 edta)。把它储存在室温下。
   4. 通过加入2毫升的 cs 和3毫升的1米 HEPES 至195毫升 HBSS, 制备无 EDTA 洗涤介质 (HBSS; 1% cs; 15 毫米 HEPES)。把它储存在室温下。
   5. 制作一个外地资产管制署缓冲区 [1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (pH = 7.2); 2% cs] 通过增加10毫升 cs 到490毫升 PBS。把它储存在冰上。
2. 在 60 x 10 毫米培养皿内放置70µm 细胞过滤器, 准备组织收集皿。添加10毫升的 HBSS/CS 缓冲器 (HBSS; 5% cs 缓冲器在步骤3.1.1 和储存在冰上) 到盘子里, 放在冰上。
3. 弄死鼠标通过过量吸入异氟醚使用适当的麻醉清除 (约3分钟接触 > 4% 氟醚在室内空气或 100% O₂)。在明显停止呼吸和反射运动后, 通过牢牢捏一只后爪 (建议使用镊子) 来验证是否没有深部疼痛。使用一双手术剪刀或一把新的直剃刀, 确保安乐死通过斩首。
   注: 由于动物的大小和年龄, 不建议在这一步骤中颈椎脱位。这些方法符合 2013 AVMA 关于安乐死的指导原则, 并得到 MGH IACUC 的批准。
4. 用干净的钳子和剪刀收割结肠, 打开腹部。将肠道反射到老鼠腹部的1侧露出结肠。首先 transecting 它的远端 (向肛门) 切除整个结肠到盲肠。然后, 用钳子牢牢抓住结肠, 用剪刀切开尿道到直肠。把结肠尽可能的靠近肛门。取出结肠后取脾 (见下面步骤 4.1-4.2)。
   注意: 虽然 photoconversion 协议只针对新生儿结肠的 25% (5 毫米的光纤套管), 但整个结肠的收获是为了帮助细胞隔离。
5. 用镊子将结肠中的内容从结肠中推到干纸巾上, 以清除冒号。融汇用剃刀刀片将结肠细砍成一个培养基的盖子上的糊状, 然后将这个浆糊转移到培养皿中的细胞过滤器上。
6. 将清洁的 8 mm 长的磁力搅拌棒添加到过滤器上, 将盘子放在9位磁性搅拌器板上。将磁搅拌棒速度设置为 800 rpm, 室温下孵化细胞5分钟。丢弃缓冲区并重复使用10毫升的 HBSS/CS (HBSS; 5% 级 cs 缓冲器, 在步骤3.1.1 和储存在冰上)。在洗涤结束时丢弃缓冲区。
7. 添加10毫升的 prewarmed 上皮带缓冲液 (HBSS) 游离上皮细胞; 5% CS; 1mM. 5mM EDTA; 15mM HEPES [pH 7.2-7.5] 缓冲器, 是在步骤3.1.2 和存储在37°c 水浴) 到细胞过滤器和搅拌 800 rpm 30 分钟在37°c 孵化器。在孵化结束时, 将上皮细胞中丰富的缓冲液转移到干净的15毫升管中。
   注意: 上皮细胞和相关细胞 (肠道上皮干细胞和肠道上皮淋巴细胞) 被释放到缓冲区中, 而在本步骤¹¹中, 完整的固有层中的细胞仍保留在细胞过滤器中。
   1. 在室温下离心浓缩肠上皮分数 (IELs) 在 700 x g 5 分钟。丢弃上清液, 并在1毫升的并用重悬中对细胞颗粒进行去除。储存在冰上, 以便在步骤3.15 中使用。
8. 在细胞过滤器2x 内, 用 HBSS/CS 洗净叶片固有部分。为此, 添加10毫升的 HBSS/CS 解决方案 (HBSS; 5% cs 缓冲区, 这是在步骤 3.1.1, 已储存在冰上) 到细胞过滤器, 并搅拌在 800 rpm 5 分钟在37°c 孵化器。每次清洗后丢弃缓冲区。
9. 在洗涤介质中清洗样品2x。添加10毫升的洗涤介质 (HBSS; 1% CS; 1 毫米 EDTA 缓冲器, 在步骤3.1.3 和储存在室温下) 到细胞过滤器, 并在15摄氏度孵化器中以 800 rpm 为37分钟搅拌。每次清洗后丢弃缓冲区。
   1. 使用洗涤介质后, 将其存储在冰上以供步骤3.14 使用。
10. 用 HBSS/cs 清洗样品 2x. 添加10毫升的 HBSS/cs 缓冲器 (HBSS; 5% cs 缓冲器, 在步骤3.1.1 已储存在冰上) 到细胞过滤器, 并在37°c 孵化器 800 rpm, 以5分钟。每次清洗后丢弃缓冲区。
11. 在无 EDTA 洗涤缓冲液中孵化组织。加入10毫升无 EDTA 洗涤缓冲液 (HBSS; 1% CS; 15 毫米 HEPES 缓冲器, 在3.1.4 和室温下储存) 到细胞过滤器中, 在室温下将板材孵化为10分钟而不搅拌。在该步骤的末尾丢弃缓冲区。
12. 用 HBSS/CS 冲洗样品 2x, 并准备酶溶液。添加10毫升的 HBSS/CS (HBSS; 5% cs 缓冲器, 在步骤 3.1.1, 已储存在冰上) 缓冲区到细胞过滤器, 并在37°c 孵化器 800 rpm, 以10分钟的搅拌。每次清洗后丢弃缓冲区。
    1. 制备酶溶液 (无 edta 洗涤缓冲器; 0.1 毫克/毫升 DNase I; 167 毫克/毫升胶原酶) 在第二洗涤期间: 添加9毫克的 DNase I 和15毫克的冻干胶原酶, 以90毫升无 EDTA 洗涤缓冲。在室温下存储解决方案。
13. 消化细胞过滤器内的固有层含量, 获得固有的细胞膜 (LPLs)。添加10毫升的酶溶液 (无 EDTA 洗涤缓冲器; 0.1 毫克/毫升 DNase I; 167 毫克/毫升胶原酶缓冲液在步骤3.12.1 和储存在室温下) 到细胞过滤器, 并搅拌在 800 rpm 45 分钟在37°c 孵化器。
    注: LPLs 在酶消化后释放到溶液中。
    1. 收集含有细胞的酶解, 并将其通过新的细胞过滤器滤入50毫升锥形管中。
14. 加入20毫升的冷洗介质 (HBSS; 1% CS; 1mM EDTA 缓冲液, 3.1.3 步进3.9.1 中的冰上, 储存在台阶上的冰块中), 以阻断酶解中的胶原酶活性。在室温下离心管在 700 x g 处6分钟。在1毫升的并用重悬中, 将含有 LPLs 的颗粒丢弃上清液。
15. 结合 IEL (从步骤 3.7.1) 和 LPL (从步骤 3.14) 分数和染色他们与荧光共轭抗体为流细胞分析 (见步骤 5)。
    注: 如果需要间隔信息, IEL 和 LPL 分数可能会被单独染色。

4. 从脾脏分离淋巴细胞

1. 在离心管中加入500µL 的内流器缓冲器, 准备收集管。把它储存在冰上。
2. 除去结肠 (步骤 3.4) 后, 收获整个脾脏并将其放在收集管中。把纸巾储存在冰上。
3. 使用电组织均质器, 融汇脾在离心管约1分钟离心机在 300 x g [微离心机] 在室温下5分钟, 并吸取上清。
4. 通过 resuspending 500 µL 铵-氯-钾 (ACK) 裂解缓冲液中的样品进行红细胞裂解, 以渗透裂解启动细胞死亡。允许样品在室温下孵化 1-2 分钟, 然后将其并用重悬725µL。
5. 离心样品在 300 x g [微离心机] 在室温下5分钟, 并吸取上清。并用重悬500µL 中的颗粒, 并将其通过40µm 细胞过滤器过滤成一个新的离心管。将整个样品转移到一个新的离心管, 并用荧光共轭抗体对其进行染色细胞分析 (见步骤 5)。

5. 用流式细胞仪识别 Dendra 细胞

1. 离心的 IEL/LPL 和脾脏样品在 300 x g [微离心机] 5 分钟室温和吸出上清。
2. 并用重悬100µL 抗体染色混合体中的颗粒。通过将荧光共轭 anti-CD45 抗体的1µL 添加到每个样品的100µL, 以制备抗体染色组合。
   注意: 在实验之前滴定流式细胞术中的抗体是很重要的, 以确定结合饱和度发生的最佳浓度。
3. 在冰上孵化样品35分钟 (在黑暗的地方)。
4. 并用重悬300µL 的样品, 并将其离心机在 300 x g [微离心机] 中, 室温下5分钟。在325µL 的并用重悬中吸出上清液和样品。分析流式细胞仪上的样品。

结果

用光纤电缆将405纳米光传送到2天的老范^切除小鼠的冒号中。在以前的实验中, 三十年代的暴露被确定为最大 photoconversion 的结肠细胞具有最小的细胞毒性 (图 1a)。因此, 按照《议定书》的规定, 对结肠的不同部分进行连续三十年代的曝光。激光照射后, 老鼠立即被安乐死, 细胞的 photoconversion 被确定。采用荧光共轭 anti-CD45 抗体对全?...

讨论

细胞的识别和鉴定与结肠菌群的影响是重要的, 应该有助于理解如何将信息从粘膜微环境传递到身体的其余部分。研究肠道相关细胞迁移的一种方法, 需要将肠道相关细胞分离出来, 然后将移植到受体小鼠体内, 以确定它们的组织自导模式和功能^12,13。此方法是有限的, 因为仅可以跟踪传输的特定单元格类型。此外, 由于从组织中分离细胞和纯化过程而产生...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser
Light Emitting Diode (LED)	THORLABS	M405FP1	CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1
LED driver	THORLABS	LEDD1B	Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616
Optogenetics patch cable	THORLABS	M87L01	1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454
Fiber optic cannula	Doric lenses	MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45	5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036
Power supply	THORLABS	KPS101	Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101
LG3 laser safety goggles	THORLABS	LG3	Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523
Red light	Electron Microscopy Sciences	74327-10	15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences
Intestinal cell isolation
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.  https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3
1X HBSS	Gibco	14025076	Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076
Calf Serum	Hyclone AZM	197696
EDTA	Invitrogen	15575020	0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020
DTT	Sigma	10197777001	CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US
HEPES	Gibco	15630080	1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080
Petri dish	Corning	353004	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F
70 micron cell strainer	Falcon	352350	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712
Micro magnetic stir bar	Fisherbrand	1451364	Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364
Magnetic stir plate	Corning Laboratory Stirrers	440826	https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE
Collagenase	Roche	5401020001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE
DNase I	Sigma	10104159001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US
1X PBS	Gibco	20012-027	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027
Pipet aid	Thermo Scientific	14387165	https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165
10 mL serological pipet	Falcon	357530	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
25 mL serological pipet	Falcon	357515	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
15 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339651	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
50 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339653	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Single cell suspension
Eppendorf tubes	Seal-Rite	1615-5500	Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx
Tissue homogenizer	Kimble	K7495400000	Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000
Homogenizer tips	Kimble	7495210590	Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01
40 micron cell strainer	Falcon	08-771-1	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
Antibodies
BV786 anti-mouse CD45	BD	564225	Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225
Live/Dead	Invitrogen	L34962	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962
Other
Razor blades	VWR	55411-050	Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades