萝卜品种多糖的 PNGase 研究

摘要

本文介绍了一种简便、快速的方法, 对不同品种萝卜 (萝卜) 的n-多糖进行了制备和分析。

摘要

近年来, 植物的碳水化合物基团受到了相当大的关注, 因为它们是交叉反应, 引起过敏性免疫反应的潜在来源。此外, 碳水化合物结构在植物代谢中也起着至关重要的作用。在这里, 我们提出了一个简单和快速的方法, 以制备和分析不同品种的萝卜 (萝卜) 的n-多糖, 利用n-glycanase 的具体释放植物衍生碳水化合物结构。为了达到这一目的, 萝卜组织匀浆的粗乙酸酸沉淀处理 PNGase H⁺, 并标记使用 2-苯酰胺作为荧光标记。随后用超效液相色谱 (UPLC) 分离法和基质辅助激光解吸电离-飞行时间 (MALDI) 质谱法对糖样品进行了分析, 详细结构对萝卜衍生n-糖结构的相对 abundancies 进行评价和量化。该协议也可用于对不同植物种类的n-多糖进行分析, 对多糖对人体健康的作用和作用的进一步研究有一定的参考价值。

引言

近年来, 植物中的n-多糖引起了越来越多的关注, 因为先前的研究突出了n-多糖作为免疫交叉反应的潜在来源, 可能引发过敏反应^1,2.此前已证明, 植物糖蛋白的n-多糖会影响催化活性^3,4, 热稳定性和折叠^5,6或亚细胞定位和分泌物⁷。为了使糖结构与它们各自的功能相关联, 多糖必须首先从化学或酶的糖蛋白中释放出来。经典的化学方法释放n-和O型多糖是β消除, 其中碱性样品处理是伴随着减少与硼氢化, 以产生一个糖醇⁸。然而, 这一过程排除了荧光的标记, 并导致单糖单位从糖结构的减少端显著衰减。基于氢氧化铵/碳酸盐处理的化学 deglycosylation 也是常用的替代方法⁹。这两种化学释放方法都没有降解完整的蛋白质, 这允许在不存在同质量范围内的肽片段干扰的情况下对未标记的糖池进行质谱分析。然而, 这些方法的一个缺点是增加的降解率α1,3-fucosylated n-多糖, 一个共同的碳水化合物结构发现在植物¹⁰。另外, 使用肽的酶释放方法:n-glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) 也被广泛应用。重组 PNGase F (从杆菌 meningosepticum) 是最常见的选择, 允许释放所有类型的n-多糖, 除了轴承核心α1,3 岩藻糖^11,12的结构。因此, PNGase (从杏仁籽中分离) 通常用于植物n-多糖¹³的分析。然而, 这种酶 deglycosylates 只 proteolytically 衍生糖肽, 无法 deglycosylate 本族糖蛋白¹⁴。因此, 在进一步分析之前需要进行多步骤的抽样检查, 从而导致大量的多糖损失, 尤其是低丰度的¹⁵。该方法的总体目标是以简单、稳健的方式为n-糖发布和荧光标记提供一个优化的工作流。基本的基本原理是, 最近在Terriglobus 长春发现的 PNGase H⁺可以 recombinantly 表达在大肠杆菌中, 可以直接从蛋白质支架中水解n-多糖酸性情况¹⁶。使用 PNGase H⁺替代方法的一个关键优点是荧光标记反应可以在同一反应管内进行, 而不会改变反应缓冲器^17,18。低丰寡糖的制备条件简单, 回收率高, 使该方法成为多糖分析的重要工具. 该协议适用于不同植物种类的n-多糖分析。

研究方案

1. 样品收集

1. 购买不同品种的鲜萝卜 (萝卜)。

2. 从萝卜中分离蛋白质

1. 融汇约100克新鲜萝卜与厨房搅拌机10分钟。
2. 将浆料转移到50毫升离心管和离心机在 1.4万 x克4 摄氏度, 以消除不溶性的材料。
3. 将上清液小心地转移到新的50毫升离心管中, 加入等量的2米乙酸酸 (TCA) 溶液。
   注: 添加 TCA 将沉淀可溶性 (糖) 蛋白。
4. 离心机在 1.4万 x g在4°c 为30分钟并且从颗粒 (糖) 蛋白质去除上清。
5. 用20毫升去离子水和离心机清洗颗粒, 1.4万 x克4 摄氏度, 去除可溶性寡糖和多糖。
6. 重复步骤2.5。四次。
7. 在1毫升的去离子水中重新悬浮小球, 转移到新鲜的1.5 毫升离心管。

3. n-多糖的制备

1. 从步骤2.7 中混合50µL 蛋白质溶液。(等于5克新鲜萝卜), 0.2 亩重组 PNGase H⁺ 10 毫米醋酸。
2. 孵育反应混合物在37°c 为12小时。孵化后, 离心机在 1.4万 x g 5 分钟内除去多余的蛋白质和酶。
3. 将上清液转移到新鲜的1.5 毫升离心管。

4. n-多糖的纯化

1. 制备固相萃取 (SPE) 柱, 以丰富n-多糖, 从反应混合物中除去盐和其他杂质, 提高荧光 2-苯酰胺 (2-AB) 标记剂对n-糖的选择性衍生。
   1. 加入3毫升的去离子水洗涤柱。
   2. 加入3毫升80% 乙腈溶液, 含三氟乙酸酸 (TFA, 0.1% 伏/v) 活化 SPE 柱。
   3. 加入3毫升去离子水, 平衡 SPE 柱。
2. 将该示例从步骤3.3 转移到该列, 然后丢弃该流程。
3. 加入1.5 毫升的去离子水洗涤柱并丢弃流经。
4. 洗脱从柱上释放的n-多糖, 使用1.5 毫升水中20% 乙腈溶液, 含有 0.1% TFA (v/v) 到2毫升离心管中。
5. 室温离心蒸发去除溶剂。蒸发, 直到样品完全干燥。

5. n-多糖的荧光衍生化

1. 准备1毫升的 2 ab 溶液, 包括35毫米 2 AB 和0.1 米 cyanoborohydride 钠在二甲基亚砜/乙酸溶液 (7:3, v/v)。
2. 添加5µL 2 AB 溶液的干燥样品 (步骤 4.5) 来源于六不同的萝卜。漩涡每个样品直到完全地溶化。
3. 在65摄氏度孵育2小时的混合物。
4. 让样品冷却到室温5分钟, 加入5µL 去离子水和40µL 乙腈。离心管在 1.4万 x g 3 分钟。
5. 将48µL 从上清到300µL 高回收率 HPLC 瓶。将衍生物糖样品存放在摄氏-20 摄氏度, 可达一个月。

6. HILIC-UPLC 多糖的分析

1. 使用与在线荧光 detectorset 连接的标准 UPLC 系统, 分别在 330 nm/420 nm 的激发/发射波长上分析样品。
2. 使用疏水性相互作用液相色谱 (HILIC)-UPLC 糖柱在60°c 的柱温度为分析。
3. 通过稀释50毫升的库存溶液 (1 米甲酸铵溶液, pH 4.5), 用950毫升的液相色谱-质谱 (LCMS) 级水, 制备溶剂 A。准备库存解决方案, 如下所示:
   1. 添加43毫升甲酸到700毫升的 LCMS 级 H₂O。
   2. 用滴状加水氨溶液 (25% 瓦特/瓦) 将 pH 值调整为4.5。
   3. 将溶剂转移到测量缸内, 并填充1000毫升, LCMS 级 H₂o 型存储在4-6 摄氏度, 可达3月。
4. 采用 LCMS 级乙腈为溶剂 B。
5. 用以下梯度洗脱分离n-多糖:
   1. 从95% 的溶剂 B 开始加入溶剂 a. 将流量设置为0.5 毫升/分, 从0到44.5 分钟。
   2. 从0分钟到6分钟, 逐渐减少溶剂 B 与线性梯度 to78 的比例。
   3. 从6分钟到44.5 分钟, 逐渐降低溶剂 B 的比例, 线性梯度为55.9%。
   4. 从44.5 分钟到46.5 分钟, 快速将溶剂 B 的比例从55.9% 降到 0%, 并在0% 处保持2分钟, 并开始洗涤柱。将流量降低到0.25 毫升/分, 从44.5 到55分钟。
   5. 通过将溶剂 B 从48.5 分钟增加到50.5 分钟, 并在95% 处保持4.5 分钟, 进一步洗涤柱。
   6. 将该柱重新平衡95% 溶剂 B 的起始条件为0.5 毫升/分, 从50.5 到57分钟。
6. 在 UPLC 系统中注入45µL 的样品。
7. 洗脱多糖由 UPLC 与保留时间在15和40分钟之间。
8. 用2毫升离心管收集每个观测到的 UPLC 峰值分数, 并通过离心蒸发干燥样品。
9. 注射约 1 pmol 2 AB 标记葡聚糖标准 (2−20葡萄糖单位), 以校准植物n-糖的分析, 并分配他们的洗脱时间为标准化的葡萄糖单位。

7. MALDI 分析

1. 在5µL LCMS 级水中溶解6.8 步的样品。混合1µL 的样品溶液和1µL 6-aza 2 thiothymine (的) 溶液 (0.3% 瓦特/v 在70% 伏/五水中乙腈), 并将混合物移到 MALDI-飞行样品载体上。
2. 通过按下启动按钮, 在正离子模式下使用 MALDI 质谱仪对样品进行分析。
3. 采用随附的 MALDI 分析软件对质谱进行分析。
4. 使用开放源码糖解释软件¹⁹解释频谱。设置 2 AB 标记的搜索参数, [M + Na]⁺, 并将精度参数设置为 2.0 Da。

结果

图 1显示了描述的协议的示意图, 包括从萝卜中分离 (糖) 蛋白、 n-多糖的制备、UPLC 分析以及这些成分的 MALDI--MS 分析。图 2显示了萝卜品种衍生物多糖的代表性 UPLC 图谱。图 3显示了2衍生物n-糖结构用 MALDI-飞行质谱法获得的结果。图 4显示了每个萝卜品种的n-

讨论

我们在这里提出的协议允许比较不同品种的萝卜的n-糖剖面。与现有协议相比, 这种方法的一个显著优点是, 多糖的酶释放与 2 AB 的衍生反应之间没有缓冲的变化。这个过程最关键的步骤是用 SPE 柱纯化n-多糖, 因为在反应混合物中除去盐或其他杂质可能会对荧光衍生效率产生负面影响。此处提出的方法仅允许对不同的n-多糖的相对丰度进行评估;绝对量化需要在步骤2.1 中添...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
Trichloroacetic acid	SCR, Shanghai	80132618
Acetic acid glacial	Huada, Guangzhou	64-19-7
Acetonitrile	General-reagent	G80988C
Trifluoroacetic acid	Energy chemical	W810031
2-aminobenzamide	Heowns, Tianjin	A41900
Sodium cyanoborohydride	J&K Scientific Ltd	314162
Dimethyl sulfoxide	Huada, Guangzhou	67-68-5
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol	Agilent Technologies	AT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine	Sigma	275514
Tools/Materials:
Kitchen blender	Bear, Guangzhou	LLJ-A10T1
Centrifuge	Techcomp	CT15RT
Centrifugal Evaporator	Hualida, Taicang	LNG-T120
SPE column	Supelco	Supelclean ENVI Carb SPE column
MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker	Autoflex
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	# 5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
Column oven	Hengxin	CO-2000
HPLC Column	Waters	Acquity UPLC BEH glycan column	2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size
LCMS-grade Water	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	# 100029
Formic acid	Aladdin	F112034
Ammonia solution	Aladdin	A112080