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Method Article
植物细胞悬浮液中咖啡因的提取、酶活性及咖啡因合成酶基因的表达
摘要
本协议描述了一种高效的方法, 用于提取和定量的咖啡因在细胞悬浮液中的表达水平和评价咖啡因合酶酶活性的实验过程。编码这种酶的基因。
摘要
咖啡因 (13, 7-trimethylxanthine) 是一种嘌呤生物碱, 目前流行饮料, 如咖啡和茶。这种次生代谢产物被认为是一种化学防御, 因为它具有抗菌活性, 被认为是一种天然杀虫剂。咖啡因也可以产生负面的化感作用, 防止周围植物的生长。此外, 世界各地的人们使用咖啡因的镇痛和刺激作用。由于对咖啡因技术应用的兴趣, 这种化合物的生物合成途径的研究已经发展。这些研究主要集中于了解调节咖啡因生物合成的生物化学和分子机制。体外组织培养已成为研究这种生物合成途径的有用系统。本文将介绍一步一步的协议, 以量化咖啡因和测量的转录水平的基因 (CCS1) 编码咖啡因合成酶 (CS) 的细胞悬浮液, 以及它的活动。
引言
咖啡因是咖啡1属植物 biosynthesized 的次生代谢产物。这生物碱属于甲基黄嘌呤家庭并且被认为作为一个化工厂防御, 因为它可能采取行动反对病原体和草食动物的有害作用2,3。此外, 这种代谢物负责的刺激性能的咖啡饮料, 这是普遍消费全球4,5。由于其特性, 一些研究小组对咖啡因6,7的生物合成途径和分解代谢有兴趣。目前, 植物体外细胞/组织培养作为评价咖啡因积累的替代品, 在不同的生物和非生物学的战略8,9。
咖啡因的生物合成涉及 7-甲基黄嘌呤的水解释放从相应的核糖核苷, 其次是有序的n-methylations 在位置3和1。特定的s-甘基蛋氨酸 (SAM) 依赖 n-甲基 (NMT) 催化甲基化在位置 7, 而可可碱合酶 (TS) 和 CS 分别参与3和 1-methylation....
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研究方案
1. 咖啡因在咖啡细胞悬浮液中的提取。
- 使用C. 咖啡细胞悬浮液9。保持悬浮由双周亚文化在 Murashige 和 Skoog 培养基在 pH 值4.3 与恒定的 100 rpm 震动25°c 在连续的光之下 (8.3 瓦特/m2)。
- 用11µm 孔滤纸和傅书礼漏斗在真空过滤下收获细胞。
- 用鳞片将收集到的细胞的新鲜重量进行登记, 用铝箔包裹, 将它们冷冻在液氮中, 并保持在-80 摄氏度直到分析。
- Lyophilize 冷冻细胞材料为72小时。
- 登记冻干细胞的重量, 以估计干重产量。
- 将粉状物料存放在可重复使用的聚乙烯袋中 (9 厘米 x 7.5 厘米)。浸渍的材料, 以细粉和储存在干燥, 直到使用。
- 测量0.5 克的干细胞物质的分析尺度, 并添加到一个玻璃瓶 (25 毫升)。
- 在冻干细胞中加入10毫升丙酮, 混合在三十年代的涡旋搅拌机中均匀化。然后, 用铝箔封住瓶子。
- 混合在 100 rpm 使用一个转子在室温 (25 °c) 为5小时。
- 将所有材料转移到15毫升圆锥管和离心机在 1.3万 x g 10 分钟. 将液相转移到一个新的管, 并减少在室温下的通风罩干燥。
- ....
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结果
根据图 1所示的方案, 通过对样品进行色谱分析, 对通过本工艺获得的咖啡因提取物进行了薄层定量分析。为了量化细胞提取物中咖啡因的含量, 使用了这种化合物的各种商业标准的曲线 (图 2A)。用 273 nm 的最大吸收峰值 (图 2B) 分析了咖啡因的吸光度模式, 在薄层色谱板上, 咖啡因的峰值分离显示出0.34 和0.39 .......
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讨论
我们在这里提出了评价咖啡因含量, CS 活动和转录水平的最佳条件在体外植物组织培养, 如细胞悬浮的C. 阿拉伯咖啡。以前的报告已经证实, 在光照射下维持细胞和在培养基中存在可可碱, 是提高咖啡因含量的合适参数, 从而可以评价咖啡因分离方法。采用反相高效液相色谱法 (RP)。目前, 很少有报道使用一种简单而快速的方法和经济优势来研究细胞悬浮液中的咖啡因生物合成。在这里, .......
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披露声明
作者没有什么可透露的。
致谢
我们实验室的工作由委员会 Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) 的赠款提供给 SMTHS。这项研究还得到了 CONACyT 和 Sistema 全国 Investigadores (4422) 授予 RJPK (37938 号) 的奖学金的支持。作者感谢 CIATEJ 在撰写本手稿时使用了它的安装。特别感谢 Víctor 博士的所有建议在分子生物学科和 Valentín 门多萨, 国际金融公司, UNAM 的设施在拍摄这篇文章。
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材料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
参考文献
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sled....
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