c-fos 和 dusp1 在癌基因依赖性中的作用评价方法

摘要

在这里, 我们描述了 c-fos 和 dusp1 作为白血病药物靶标的遗传和化学验证协议, 在体外和体内使用遗传和人性化的小鼠模型。该方法可应用于遗传验证和治疗发展的任何目标。

摘要

酪氨酸激酶抑制剂 (tki) 在治疗慢性髓系白血病 (cml) 方面的示范预示着癌症治疗的一个新时代。然而, 少数细胞对 tki 治疗没有反应, 导致残留疾病最小;即使是最强大的 tki 也无法消灭这些细胞。这些 mrd 细胞作为对治疗产生抵抗力的水库。为什么 tki 治疗对 mrd 细胞无效尚不清楚。生长因子信号转导与 tki 治疗过程中支持 mrd 细胞存活有关, 但缺乏机械理解。最近的研究表明, 由于 mrd 细胞中收敛的致癌和生长因子信号, c-fos 和 dusp1 表达升高, 可以介导 tki 的抗性。c-fos 和 dusp1 的遗传和化学抑制使 cml 对 tki 非常敏感, 并在遗传和人性化的小鼠模型中治愈 cml。我们使用来自 tki 敏感和耐药细胞的多个微阵列确定了这些目标基因。在这里, 我们提供了在体外和体内使用小鼠模型进行目标验证的方法。这些方法可以很容易地应用于任何目标的遗传验证和治疗发展。

引言

bcr-abl1 融合癌基因的本构酪氨酸激酶活性引起 cml, 为小分子抑制剂靶向激酶活性提供了依据。tki 在治疗 cml 患者方面的成功彻底改变了靶向治疗的概念^1,2。随后, 抗激酶治疗作为精确的医学被开发了为其他几个恶性肿瘤, 包括实体肿瘤。到目前为止, 已有30多种激酶抑制剂被美国 fda 批准用于治疗各种恶性肿瘤。虽然 tki 治疗对抑制疾病非常有效, 但并不治疗。此外, 在治疗过程中, 少量癌细胞持续存在: mrd^3、4、5。即使是表现出完全缓解的患者, 也会留下 mrd, 如果不持续抑制, 最终会导致复发。因此, 需要根除 mrd 细胞, 以实现持久或治疗性的反应。cml 代表了一个有价值的范式, 用于定义精确医学的概念、肿瘤发生的机制、合理的靶向治疗、疾病进展和耐药性。然而, 即使在今天, 导致 tki 诱导的癌细胞死亡的机制还没有完全了解, 也没有完全了解为什么 mrd 细胞 (由白血病干细胞组成) 对 tki^4,6具有内在的耐药性。然而, "癌基因依赖" 突变激酶蛋白的现象与 tki 的有效性有关, tki 对靶向癌基因的急性抑制会导致致癌休克, 导致细胞出现大规模的原凋亡反应或静止上下文相关的方式^6,7,8,9。然而, 癌基因依赖的机械基础是缺乏的。最近的研究表明, 生长因子信号减少了癌基因的依赖性, 从而导致抵抗 tki 治疗^10,11,12。因此, 为了深入了解癌基因依赖的机制, 我们从 bcr-abl1 成瘾和非成瘾细胞 (随生长因子生长) 进行了全基因组表达谱分析, 揭示了 c-fos 和 dusp1 是犯罪基因依赖的关键介质。癌基因成瘾¹³。c-fos 和 dusp1 的遗传缺失对 bcr-abl1 表达细胞是合成致死的, 实验中使用的小鼠没有发生白血病。此外, 小分子抑制剂对 c-fos 和 dusp1 的抑制作用, 治愈了 bcr-abl1 诱导的小鼠 cml。结果表明, c-fos 和 dusp1 的表达水平定义了癌细胞的凋亡阈值, 因此较低的水平会产生药物敏感性^,而较高的水平会导致对治疗的抵抗力13。

为了确定导致癌基因依赖性的基因, 我们在生长因子存在的情况下进行了几次全基因组表达分析实验, 并使用了鼠肉和 cml 患者衍生细胞 (k562)。这些数据与 cml 患者数据集在伊马替尼治疗前后从 cd34⁺造血干细胞中获得的数据进行了并行分析。这一分析揭示了三个基因 (转录因子 [c-fos]、双特异性磷酸酶 1 [dusp1] 和 rna 结合蛋白 [zfp36]) 通常在 tki 耐药细胞中被凝聚。为了验证这些基因在赋予耐药方面的意义, 我们进行了体外和体内的逐步分析。通过实时 qpcr (rt-qpcr) 和耐药细胞中的西方印迹证实了这些基因的表达水平。此外, cdna 过度表达和击倒的 shrna 发夹的 c-fos, dusp1 和 zfp36 揭示了升高的 c-fos 和 dusp1 表达是足够和必要的, 以赋予 tki 的抵抗力。因此, 我们仅使用 c-fos 和 dusp1 的小鼠模型进行了体内验证。为了对 c-fos 和 dusp1 进行基因验证, 我们创造了 rosacreert 诱导的 c-fos^f函(条件淘汰赛)¹⁴ , 并与 dusp1-p/(直接淘汰赛)¹⁵交叉, 使 rosacreert2-c-fos^fl双转基因 小鼠。在一个菌落形成单元 (cfu)^中, 对表达 bcr-abl1^的骨髓衍生的 c-kit + 细胞 (来自 c-fos fl/fl^-/---和 c-fos fusp1-\-) 进行了体外分析, 活体骨髓移植在小鼠体内, 单独或共同检测白血病发展中对 c-fos 和 dusp1 的要求。同样, 用 bcr-abl1 表示, 用 bcr-abl1^表达, 用 dfc (二氟姜黄素) 16 和 dusp1 对 c-fos 的化学抑制, 用 bci (苯并二己胺)^-2 , 3-二氢-1h-1) 17 在体外和体内进行了测试。来自野生类型 (wt) 鼠标的骨髓衍生的 c-kit⁺细胞。为了确认白血病干细胞中对 c-fos 和 dusp1 的要求, 我们利用 cml 小鼠模型, 通过多西环素 (tet-转动剂在小鼠干细胞白血病 (scl) 基因 3 ' 基因下表达) 在其干细胞中特异性诱导 bcr-abl1章程)^18,19。我们在体内移植试验中使用了这些小鼠的骨髓^林-sca⁺c-kit⁺ (lsk) 细胞。此外, 我们还建立了 phopsho-p38 水平和 il-6 的表达, 分别作为药物动态生物标志物,分别用于 dusp1 和 c-fos 的抑制。最后, 为了扩大这项研究对人类的相关性, 患者衍生的 c-Kit⁺细胞 (相当于小鼠的 c-kit⁺细胞) 接受了长期的体外培养细胞检测 (ltcic) 和体内人性化的小鼠模型。cml^20,21。免疫缺陷小鼠移植 cml cd34 + 细胞, 其次进行药物治疗和人白血病细胞存活分析。

在这个项目中, 我们开发了使用遗传和化学工具进行目标识别和验证的方法, 使用不同的临床前模型。这些方法可以成功地应用于验证其他目标开发化学模式的治疗发展。

研究方案

所有动物实验都是根据辛辛那提儿童医院医疗中心 (cchmc) 动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的指导方针进行的。人类标本 (正常 bm 和 cml (p210-bcr-abl +) 白血病) 的样本是通过机构审查委员会批准的协议 (机构审查委员会: 全联邦保证 #00002988 辛辛那提儿童医院医疗中心) 获得的;得到 cchmc 和辛辛那提大学的捐助方知情同意。

1. 实时 qpcr 分析

1. 从 rpmi 中生长的 bf3 细胞中分离总 rna, 并辅以10% 的 fbs 和10% 的 wehi, 将培养基作为白细胞介素-3 (il-3) 的来源。
2. 在对数阶段 (99% 活着) 从经过处理的样品 (il-3 和伊马替尼) 以及未经处理的样品中采集细胞, 并在 435 x 克的情况下离心3分钟。细胞的健康和生长阶段至关重要, 因为它们的基因表达谱可能会发生巨大的变化。
3. 通过纯化总 rna^{22 来}分离 rna。定量总 rna;然后, 对其进行 dnase 治疗²³。用逆转录酶²⁴将等量的无 dna rna (2μg) 转换为 cdna。
4. 使用特定基因的引物执行 qPCRs (表 1)。使用1x 聚合酶混合物 (见材料表)、每个引物0.5μm、1μl dna 和水, 在 0.2 ml 中进行20μl 反应, 使用光学帽的薄壁 pcr 管。将反应置于热环器中, 循环: 步骤 1, 95°c 10分钟;步骤 2, 95°c 为 15秒;步骤3在60°c 下 1分钟;步骤 4, 重复步骤 2–3 40次。在绘制之前, 以三重奏的形式执行所有 pcr, 并将实时数据归一化到β-肌动蛋白表达。

2. 西式印迹

请注意:完整细胞提取物是通过添加250μl 的1x 裂解缓冲液制备的, 如 kesarwani 等^人13 所述, 辅以蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂鸡尾酒2。

1. 通过 435 x 克离心, 在435下 3分钟, 从经过处理的 (il-3 和伊马替尼) 以及未经处理的 baf3 细胞中采集 500万 bha3 细胞。通过上下液移 1x, 将裂解缓冲液 (250μl) 中的细胞裂解 1x, 然后在80°c 下孵育5分钟。在4°c 的冷藏室里, 用 5-6 个5秒的脉冲将裂解裂解的裂解物, 分解所有的 dna。
2. 将裂解液转移到 1.5 ml 管中, 以 16, 000 x g的速度将其离心 5分钟, 以去除任何不溶性材料。提取物可在-80°c 下存储, 直至使用。在装载前, 将样品加热到 80°c, 在热块中加热5分钟。使用 10% sds-page 凝胶上的凝胶加载尖端加载样品10μl。
3. 将蛋白质解析为 150 v, 直到参考染料到达凝胶底部。通过1安培1小时的电泳转移将蛋白质转移到硝化纤维素膜中。转移后, 用5% 的非脂肪牛奶在1x 的挤出缓冲盐水 + 0.1% 补间 20 (tbst) 中封堵膜, 并在4°c 下用适当的抗体在1:1000 稀释时进行隔夜探查。
4. 用 tbst 将膜清洗3倍至 5倍, 每次 10分钟;然后, 在室温下进行1小时的 hp 共轭适当的二级抗体 (1:5000 稀释) 探针。使用的 tbst 量取决于容器大小。确保将膜完全淹没在 tbst 中。用 tbst 清洗二级抗体 3倍, 每次5分钟。
5. 利用化学发光基板试剂研制出了该模糊物质。在使用前, 将两个瓶子中的基板和缓冲液的等量混合。将基板添加到膜的顶部, 用1毫升的移液器覆盖整个膜, 孵育1分钟。应在添加基板后1-10分钟内对印迹进行成像。
6. 使用钝钳, 小心地将膜放置在成像系统的平台上 (见材料表), 避免大量液体。选择实时视图, 然后从菜单中选择印迹和化学照明。使用手动采集, 在不同的时间点获得多次曝光。这些文件可以可视化和量化使用成像软件。

3. 敲除老鼠的世代

1. 用rosacret2^小鼠交叉 c-fos fl2l 小鼠产生 rosacret2c-fos^fl2l小鼠13。为了制造双敲除 (ko) 小鼠, 用 dusp1^/ ----小鼠繁殖 rosacret2c-fos fl/fl 小鼠, 以产生 rosacreert2c-fos fusp1-\^{- ---小}鼠 13.按尾夹对小鼠进行基因型, 然后进行 pcr, 如下所述。
2. 基因:
   1. 为了准备 dna, 用剪刀夹下尾巴的一小部分, 并把它放入 1.5 ml 管。用加热的剪刀小心尾巴。在管内被夹紧的尾巴上加入200μl 的 50 mm naoh, 在95°c 时在热块中孵育1小时。
   2. 涡流良好, 然后通过加入50μl 的 1 tris hcl ph 6.8 和涡旋来中和。以最大速度离心管1分钟。
   3. 在0.2 毫升中进行20μl 反应的 pcr, 使用含有染料的 1x taq 聚合酶主混合剂、每个引物0.5μm、1μl 的 dna 和水的薄壁 pcr 管。将管子放入热环器中, 并运行相应的循环, 如表 2所示。
   4. 使用凝胶文档系统在2% 琼脂糖凝胶和图像上运行 pcr 产品。

4. 从骨髓中分离 c-kit⁺细胞

1. 根据机构指南牺牲老鼠。
   请注意:在这里, 小鼠暴露在二氧化碳 (co2) 根据 avma 推荐的流速, 直到死亡是由停止呼吸和心跳, 其次是宫颈脱位。
2. 从老鼠身上收获腿部骨骼--两个股骨, 两个脊椎, 两个胫骨。用手术刀刮掉骨头上的所有组织。将腿部骨骼放在冷的 1x pbs 冰上--5 毫升, 放在15毫升的试管中。把管子里的东西倒进砂浆里, 用子压碎。
3. 使用移液器将细胞悬浮液通过70μm 电池过滤器过滤成一个50毫升的螺帽管, 并连接一个 10 ml 的移液器。用冷的 1x pbs 多次清洗砂浆和钉, 收集细胞悬浮液并将其添加到 50 ml 管中。在4°c 下, 以 1200 x 克的速度旋转骨髓 5分钟,通过真空和玻璃移液器取出上清液。用移液器将细胞颗粒悬浮在 1 x pbs 的5毫升中。
4. 用移液器, 慢慢地将悬浮骨髓添加到室温5毫升的顶部 (温度很高), 注意不要打扰界面。在室温下旋转 20分钟 , 关闭刹车。
5. 用移液器收集多云的全单核电池 (tmnc) 接口, 并将其放入新的 15 ml 管中。将体积高达10毫升, 用 1x pbs 进行清洗, 取20μl 计数, 在4°c 下以 1200 x g 旋转 5分钟. 丢弃上清液, 将颗粒保存在冰上, 以便4.6.1 步进。
6. 执行 c-kit⁺细胞隔离。
   1. 按照微珠^套件协议进行 c-kit + 细胞隔离。将细胞颗粒在80μl 的 1x pbs + edta + bsa 中重新移植到 10个^7个细胞中。在细胞悬浮液中, 加入20μl 的 cd117 微比德斯/共 7个^细胞。在4°c 条件下, 通过涡流和孵育10分钟即可混合均匀。加入 1x pbs + edta + bsa, 在4°c 下以 1200 x g 旋转 5分钟, 使体积达到10毫升。
   2. 通过真空去除上清液, 并将细胞颗粒悬浮在 1x pbs + edta + bsa 中 500μl/10^8个总细胞中。使用带有磁柱的磁柱的磁体支架, 添加3毫升的 1x pbs + edta + bsa, 并允许它通过重力流入15毫升的收集管。
   3. 一旦第一个缓冲加法完成通过列, 将细胞悬浮液添加到列中, 使其能够通过重力流入15毫升的收集管。这种流动是不需要的细胞分数。
   4. 每次用3毫升 1x pbs + edta + bsa 清洗柱 3次, 使其通过重力流入收集管. 从磁铁中取出柱, 放在15毫升管的顶部。
   5. 加入5毫升的 1x pbs + edta + bsa, 并立即将其与柱上的柱塞冲洗。取出柱塞, 并重复刷新与额外的5毫升的 1x pbs + edta + bsa。使用标准方法对总体积中的单元格进行计数。
   6. 在4°c 下, 以 1200 x g 的速度旋转细胞 5分钟. 取出上清液, 重新悬浮在完整的 imdm (imdm + 10% fbs + il-6 [10 ng/ml] + mscf [50 ng/ml] + flt3 配体 [20 ngml] + il-3 [10ng/ml]) 中培养。将这些细胞在细胞 imdm培养基的 2 x 10 6 细胞中培养一夜, 方法是将其置于37°c 和 5% co₂的孵化器中。

5. 传导

1. 逆转录病毒质粒转染
   1. 在一个设置为37°c 的水浴中, 在前一天下午, 新鲜解冻的 hek293 细胞。将含有 hek 细胞的低温管在 435 x克的室温下旋转 3分钟,通过真空取出上清液, 并将细胞颗粒悬浮在 dmem 的1毫升中, 辅以10% 的 fbs、青霉素、链霉素和谷氨酰胺。
   2. 计数细胞, 并添加适当的体积到一个10厘米的处理盘 (~ 4 x^{10 6} hek293t 细胞)。在菜上加入14毫升的 dmem 10 介质, 通过上下滑动很好地混合, 以实现相等的分布。将盘子放入37°c、5% 的二氧化碳_孵化器中过夜。
   3. 第二天早上, 在倒置光显微镜下检查细胞的融合 (50% 或更多效果良好)。
   4. 结合 dna (所需的抗逆转录病毒质粒), pcleco (包装质粒), 2 m ccl₂和 h2 0 在 1.5 ml 管 (= 500μl) 中使用的微粒化物 dna (bcr-abl1-yfp), 7.5 微克 pcleco, 62 微米 ccl₂ , 水的最终体积为 500μl. 在另一个 1.5 ml 管中加入500μl 的 2x hbs。
   5. 在混合过程中, 将 dna 混合液滴入含有500μl 的 hbs (280 mL ncl、100 mm hepes 和 1.5 mL_{na 2}hpo_{4) 的}1.5 ml 管中。通过将涡流设置为最低速度, 并在添加转染混合物的同时, 将 hbs 管固定在其上进行恒定的混合, 从而实现这一点。
   6. 允许转染混合在室温下孵育20-30分钟。在孵育过程中, 在 hek 细胞中添加 25 nm 氯奎因, 并将其放回孵化器中。孵育后, 将转染混合滴入 hek 细胞, 然后轻轻旋流介质, 将转染混合在整个板上。
   7. 将细胞与混合孵育约 8小时, 在 37°c, 5%_co2孵化器中。通过非常缓慢地添加14毫升的新鲜 dmem 10 培养基来改变这些细胞上的介质。慢慢地移开盘子的墙壁, 有助于防止 hek 细胞的任何剥离。在 37°c 5% co2 孵化器中孵育细胞一夜.
   8. 用10毫升注射器收集病毒上清液, 将上清液放入注射器中, 并连接0.45μm 注射器过滤器。将病毒上清液插入新的收集管中。以病毒上清液的第一批收集 ~ 16小时后。
2. 纤维连接蛋白病毒浓度与转导
   1. 在未处理的6井培养板中加入2毫升的0.1 毫克重组人纤维连接蛋白片段, 在 1x pbs 中。根据需要准备尽可能多的纤维连接蛋白, 这取决于细胞的数量和基因型。一口井可以充分地传递 1000万个 c-kit⁺细胞。在4°c 下将板材连夜孵化。
   2. 第二天, 用移液器从井里取出纤维连接蛋白, 在 1个 pbs 中取出无菌 2% bsa 的移液器2毫升, 以阻塞板材, 并在室温下孵育30分钟。通过真空取出 bsa, 通过输送 1x pbs 的2毫升彻底清洗, 然后通过真空将其取出。
   3. 立即添加新鲜采集和过滤 (0.45μm) 病毒上清液, 最高可达5毫升。在32°c 下以 435 x克离心 2小时,通过真空取出上清液, 用新收集的病毒上清液重复这一步骤, 然后再次旋转。通过真空去除上清液,加入2ml 的 1x pbs 清洗井;然后, 通过真空将其取出。
   4. 将一夜培养的 c-kit⁺小鼠细胞 (步骤 4.6.6) 加入病毒包覆井中, 将细胞悬浮液很好地混合在一起, 并将其移液到现在的病毒浓缩纤维连接蛋白板上。在25°c 下以 1200 x g的速度旋转 90分钟, 将细胞放入 37°c 5% co 2 孵化器中.
   5. 48小时转导后, 在4°c 下在 1, 200 x克的温度下离心细胞 5分钟, 并在流化核细胞缓冲液中重新悬浮 #1 (1x pbs + 0.5% bsa) 至 6 x 10 6/ml^.通过流式细胞仪测量 yfp 阳性细胞的百分比, 确定 bcr-abl1 阳性细胞的百分比。
   6. 使用标准过程获取事件。首先, 根据向前和侧面散射来启动活细胞。然后, 启动 yfp 阳性活细胞, 不包括由负控制确定的 yfp-负细胞 (图 4)。

6. 形成殖民地的联合分析

1. 用细胞因子在室温下将小鼠的甲基纤维素解冻 1-2 h. 在流式细胞仪管中使用没有针头的5毫升注射器, 将3毫升甲基纤维素的倾斜3毫升解冻。对细胞分选器上的 yfp 阳性细胞进行排序。
2. 将细胞向下旋转, 并在 imdm 完整介质中悬浮颗粒。计数要镀的细胞, 并将其稀释, 以获得 5, 000个 yfp 阳性细胞在100μl 的 imdm 完整介质中。
3. 在甲基纤维素3毫升中加入含有 5, 000 yfp 阳性细胞的细胞悬浮液 100μl, 并添加适当的抑制剂 (见材料表)。高的漩涡混合10-30秒。
4. 在大多数气泡逃逸后, 使用1毫升注射器将1毫升的介质板在三个复制3厘米的板上, 将介质喷射到一侧, 并以圆周运动的速度缓慢地倾斜板, 以均匀地分布。
5. 使用的抑制剂的最终浓度为3μm 的伊马替尼, 0.2μm 时的 dfc, 0.5μm 的 bci, 单独或组合。在适当的情况下, 用添加到甲基纤维素中的 4-羟基他莫西芬 (1μg/ml) 的细胞取出 c-fos。
6. 电镀后, 将盘子放在一个大的培养皿中, 中间有一个装有2毫升无菌水的开放盘。覆盖大型培养皿, 在 37°c 5% co 2 孵化器中仔细孵育.通过在显微镜下计算菌落总数, 记录经过一周电镀的菌落数量。
7. 通过 pcr 分析适当的板的几个菌落, 以便删除 c-fos。收集殖民地通过吸吮他们与 p1000 提示。通过多次清洗 pbs 中的尖端, 将500μl 中的细胞取出 1 x pbs 中的细胞。将细胞悬浮液悬浮在 6, 000 x克, 每次 1分钟, 并使用基因组 dna 分离试剂盒从细胞颗粒中提取 dna。
8. 如表 2所示, 使用引物 mfos-fp3 和 mfos-rp5 进行 pcr pcr。使用凝胶文档系统分析2% 琼脂糖凝胶和图像上的 pcr 产物。
9. 对于菌落的图形显示, 染色菌落, 使用碘氮四唑氯化物。在水中溶解10毫克的氯碘四唑, 得到 1 mg/ml 溶液。在组织培养罩无菌条件下, 使用带有0.2μm 过滤器的 luer 锁对溶液进行消毒。
10. 在组织培养罩中, 在 cfu 板周围滴入100μl 的染色溶液;小心不要滑动或扰乱殖民地。在 37°c 5% co2 细胞培养孵化器中孵育板材.殖民地将变成深红色棕色。使用无菌组织培养罩中的白色背景, 拍摄染色 cfu 板的照片。

7. 移植和死亡率评估

1. 用 137 c 为基础的伽马射线对小鼠进行分度辐射, 剂量为7.0 戈瑞, 然后是移植前3小时间隔的4.75 戈瑞 (0.5 gymmin)。
2. 移植 4 x^{10 4}未分类 yfp 阳性 (根据 yfp 的百分比计算) 细胞, 3 x^{10 5}正常骨髓细胞作为载体, 通过尾静脉注射进入每只小鼠。
3. 移植一周后, 利用流式细胞仪分析外周血 yfp 阳性细胞, 确定移植。
4. 进行尾静脉出血和流式细胞仪分析。
   1. 在热灯下加热老鼠的笼子, 小心不要过热或烧焦。
   2. 在小鼠的约束器中约束老鼠, 并用无菌刀片将尾巴静脉划伤。轻轻挤奶的尾巴从前到后, 让血滴积累。用肝素化毛细血管收集血液, 直到灌满血液 (收集约 75-100μl)。将充满的毛细血管中的血液放入含有 edta 的采血管中, 搅拌均匀。
   3. 通过在1x 红细胞裂解缓冲液 (150 mm 氯化铵、10 mm 碳酸氢钾和 0.13 mm edta) 的3毫升中加入30-40μl 血液, 使红细胞裂解。混合好, 多次倒置管。在室温下10–15分钟在 1, 200 x g 的4°c 下旋转 5分钟,通过真空取出上清液, 并将颗粒悬浮在 1x pbs 的2毫升中清洗。
   4. 在4°c 下在 1200 x g 下旋转 5分钟, 取出上清液并将其悬浮在流式细胞仪缓冲液 #1 中。在步骤 5.2.5 5.2.66 中进行上述流式细胞仪分析。短期将剩余的血液储存在收集管中, 可用于各种其他用途, 温度为4°c。
5. 实验中使用外周血中 yfp 阳性细胞为10–40% 的移植小鼠。在 yfp 阳性细胞中低于2% 的小鼠被排除在研究之外。
6. 在60°c 的玉米油中, 在 20mg/ml 处制备他莫西芬, 间歇性涡流, 直到完全溶解, 并在处理期间在4°c 的黑暗中储存。移植一周后, 连续三天^,通过腹腔注射他莫西芬 (玉米油中的 100 mg/kg) (i. p.), 连续三天取出 c-fos fl/fl 等位基因。重要的是, 老鼠的体重, 以确定有多少他莫西芬注射。在他莫西芬治疗后 (在适当的情况下), 对小鼠进行药物治疗 (n = 5 组)。
7. 监测小鼠白血病的进展和存活情况, 并通过流式细胞仪每周确定存活小鼠的白血病负担 (由 fp 阳性细胞), 时间长达八周。
8. 如上文第6节所述, 在适当的情况下分析血液以删除 c-fos。记录每天存活的老鼠数量, 并在实验结束时使用图形软件绘制生存曲线。

8. bcr-abl1 白血病转基因小鼠模型

1. lsk 隔离
   1. 在多西环素周上保持 scl-tta 转基因小鼠, 以防止 bcr-abl1 的表达。移植前四周, 将小鼠从多西环素食物中取出, 以获得 bcr-abl1 的表达。
   2. 如上文第4节所述, 从 scl-tta 转基因小鼠中分离 tmnc。将流式细胞下的 tmnc 挂 #2 (1x pbs + 0.5% bsa + 2 mm edta), 以获得 10⁶ cellse/ml。
   3. 通过添加10μl 的谱系细胞检测鸡尾酒生物素 (生物素结合单克隆抗体抗 cd5 [大鼠 igg2a], cd11b [大鼠 igg2a], cd45r [b220] [rat igg2a], 抗 7-4 [大鼠 igg2a], 抗 gr-1 [ly-6g c, 大鼠igg2a] 和抗 ter-119 [大鼠 IgG2a]) 每 1 x 10⁶个细胞。在黑暗中将细胞在4°c 下培养 10分钟, 然后用5毫升的流式细胞仪缓冲液 #2 清洗, 在4°c 下在 1200 x g 下旋转 5分钟, 将上清液完全吸气, 并将细胞悬浮在400μl 的流式细胞架缓冲液 #2 中。
   4. 加入5μl 的抗生物素抗体-fitc 共轭, 1.2μl 的 ly-6ae (Sca1)PECy7, 2.4μl 的 c-Kit (c-it) apc 抗体, 用于多达 10^{, 800万}细胞。在室温下用流式细胞仪缓冲 #2 在黑暗中进行10分钟的洗涤, 使体积达到5毫升;然后, 在4°c 下的 1, 200 x克离心机5分钟内取出上清液, 并将细胞颗粒悬浮在500μl 的流式细胞仪缓冲液 #2 中。
   5. 将细胞悬浮液过滤成蓝色的滤帽流式细胞仪管。
   6. 使用向前和侧面散射来门活细胞。然后, 选择显示 mfi (平均荧光强度小于 10²⁾的 in^-细胞, 从 lin^-父级的双指数图上获取 lsk 细胞 c-kit⁺和 Sca1⁺ , 并对其进行排序 (图 7) c)。
   7. 收集分类的细胞, 并在4°c 下离心 5分钟。
2. 移植
   1. 在移植前, 以7.0 戈的分裂辐射剂量照射 boyj 小鼠, 然后在3小时后对 4.75 gy 进行照射。
   2. 通过尾静脉⁽ i. v.) 将 wt boyj 小鼠 0.3 x 10 6 辅助骨髓细胞的 3 x 10 3 至^{5 x 3} bcr-abl1-lsk 细胞注入经过辐照的 boyj 小鼠体内。
   3. 移植后四周, 对 cd45.1 和 cd45.2 的受者小鼠进行分析。如步骤7.4 所述, 通过尾静脉出血从外周血中获得 tmnc。在100μl 的流式细胞仪缓冲液中重新移植细胞。在室温下, 将细胞各培养 1μl cd45-fitc 和 cd452-pe 抗体1小时。
   4. 用流式细胞袋缓冲液将体积提高到3毫升, 在4°c 下在 1, 200 x g下旋转 5分钟, 取出上清液, 在 1x pbs 的200μl 中重新悬浮。
   5. 通过根据前向和侧面散射对活细胞进行前置门控, 然后根据未染色样本对 fitt-和 pe 阳性细胞进行门控, 分析 cd45.1 和 cd45.2 上的百分比。
   6. 将小鼠分为四组 (n = 每组 6)。单独使用伊马替尼 (每天 75 mg/kg 2x) 并与 dfc + bci 联合开始治疗 (两种药物的剂量为每天 10 mg/kg 2x)。
   7. 同样, 用伊马替尼 (75 mgkg) + 姜黄 (150 mgkg) + bci (10mg/kg) 和伊马替尼 (75 mg kg) + ndga (100 mgkg) + bci (10mg/kg) 的组合治疗其他群体, 为期三个月, 每天2倍注射
   8. 如步骤7.4 所述, 通过确定尾静脉出血在外周血中 cd45.2 阳性细胞的百分比, 分析小鼠每月 1x, 为期 6个月, 以确定白血病嵌合。

9. bci 和 dfc 活动的活体评估

1. 磷-p38 分析
   1. 如第7节所述, 用 bcr-abl1 表达 c-kit + 细胞移植的三头白血病^小鼠 (8-12周)。在移植后四周注射 bci (10mg/kg), 向小鼠注射 bci (10mg/kg)。
   2. 根据供应商的说明, 使用磷酸化流式细胞仪测量磷 p38 外周血 tmnc 的水平。在注射药物之前和注射后6小时内收集每只老鼠的血液。通过 rbc 耗尽隔离 tmnc, 并按如下方式对其进行修复。
   3. 每100μl 外周血加入4毫升红细胞裂解液。在冰上混合孵育 5分钟, 将红细胞裂解, 在4°c 下, 以 1200 x g的速度将细胞向下旋转 5分钟, 并去除上清液。重复裂解1x 以上。
   4. 第二次裂解步骤后, 在 pbs 中用1毫升 2% bsa 清洗细胞颗粒。通过添加100μl 的固定和渗透溶液来固定细胞, 并在4°c 的黑暗中孵育20分钟。在4°c 条件下, 以 1, 200 x g离心 5分钟, 将细胞颗粒状。
   5. 用1x 渗透洗涤的1毫升清洗颗粒。在室温下在渗透洗涤缓冲液中加入300μl 的 2% bsa, 将细胞分成三个等于100μl 的等价物, 每个 (~ 1x10⁶⁾。
   6. 在固定细胞的每个 aliquot 中, 分别加入 p-38 抗体中的1μl、po-p38 抗体的1μl 或同型 igg 对照的 1μl, 并在4°c 下孵育一夜。
   7. 在 pbs 中用5ml 的 2% bsa 清洗细胞 1x, 并在室温下用二级抗体 (亚历克莎氟-888 共轭1μl 共轭) 孵育1小时。再次清洗细胞 1x, 并将其悬浮在 1x pbs 的200μl 中。
   8. 通过流式细胞仪采集数据, 并通过流式细胞仪分析软件对其进行分析。
   9. 从实验样品的 mfi 中扣除 igg 控制的 mfi。然后将磷-p38 的 mfi 值归一化为 p-38, 以确定 bci 注射后的磷-p38 水平。
2. c-fos 靶向基因的定量基因表达分析
   1. 取3只白血病小鼠 (8-12周大), 这些小鼠被移植到 bcr-abl1 表示 c-kit^{+ 细胞中}, 如第7节所述。收集每只小鼠的外周血, 然后给小鼠注射 10mg kg 的 dfc + bci。
   2. 药物注射6小时后收集外周血。如上文所述, 通过 rbc 耗尽隔离 tmnc。将 tmnc 颗粒, 并将其悬浮在基于酚类的裂解缓冲液中 (参见材料表)。
   3. 使用基因特异性引物对 bcl2l11、lif 和 il-6 进行 rt-qpcr 分析 (如第1节所述)。

10. 长期培养细胞检测

请注意:如前面^所述的25进行了 ltcic 检测。

1. 在 memα中生长小鼠成纤维细胞细胞系 ms-5, 使其在 t175 组织培养瓶中融合。如上文所述的 hek293t 细胞的胰蛋白酶化。将 memα中的细胞悬浮在 2 x^{10 6 细胞}中。在50毫升锥形管中取 10 x¹⁰ 6 个细胞, 在80戈尔照射。在 memα中将细胞稀释至 0.5 x¹⁰ 6 细胞/ml, 并辅以10% 的 fbs (m10) 培养基。将每口2毫升的板放在12孔板中, 并在37°c、5% co₂孵化器中孵育一夜。
2. 第二天, 通过在5毫升的 memα (1 m 溶液) 中溶解 2.5 mg/mc, 制备氢化可的松钠半顺司酸钠。在生物安全罩中使用0.2μm 注射器过滤器对氢化可的松溶液进行过滤消毒。在 mem 中通过连续稀释稀释氢化可的松, 得到100μm 溶液。在使用前将250μl 添加到人类长期培养基 (hltm) 的 25μl (见材料表) 中, 以达到1微米的最终浓度。
3. 向下旋转 cml-cd34 + 和 ucp3 tmnc^,并通过短暂的涡流将它们悬浮在 hltm 中, 并用血细胞计确定计数。
4. 从12井板上真空使用基质细胞播种的 mL 介质, 并将其替换为 hltm^中的1毫升 (cml-cd34 + [10, 000] 和 ucp3 tmnc [1 x^{10 6]}) 悬浮液。每个细胞类型每组合使用三口井。
5. 将药物库存稀释到所需浓度的2倍。在上述细胞中加入1毫升的培养基, 以获得1x 的药物浓度。在五个星期的时间里, 每周用新准备的 hltm 取代一半的媒体。
6. 在为期六周的 lpc-ic 检测期结束时, 将不粘附细胞从培养物中收集到一个管中。胰蛋白酶化粘附细胞, 并将其与相应的非粘附细胞结合。
7. 在含有30% 胎儿小牛血清的甲基纤维素培养基中清洗细胞并检测 cfu, sf (50 ng/ml) 和 il-3 (20 ng/ml)、il-6 (20 ng/ml)、g-csf (20 ng/ml) 和肉芽肿/巨噬细胞集落刺激因子 (gm-csf) (20 ng/l)用血细胞仪确定计数。
8. 将 5 x 10^4个单元格分为三个副本。冻结 20% fbs 和 10% dmso 中的剩余细胞。把盘子放在一个大的培养皿里, 中间有一个装有水的开放盘子。小心覆盖大型培养皿, 并在 37°c, 5% 二氧化碳_孵化器中孵育两周。
9. 两周后给殖民地打分。在某些情况下, 只对部分收获进行 cfu 检测)。根据从部分细胞收获中获得的 cfu 进行推断, 计算初始细胞悬浮液中存在的 ltcic 总数。每台 ltc-ic 的平均 cfu 输出为8。
   请注意:例如, 如果最初在井中镀出 1 x^{10 6}个细胞, 5周后, 收获 0.5 x^{10 6个}细胞, 对于 cfu, 5 x^{10 4个细胞}被镀膜, 并获得 50个 cfu。这等于 500 cusn/500万个镀电池。将此数字除以8以获取 ltcic, 即62.5。

11. 使用 cml cd34⁺细胞的人性化小鼠模型

1. 对8只一周大的 nod 型工商业小鼠进行亚辐射, 表示人 il3、gm-csf 和 scf (nsgs), 单剂量 7.0 gy (700 ras), 50 radss/min。
2. 静脉注射 3 x 10 6 cd34^{+ 选定}细胞从 bcr-abl1 阳性 cml 慢性期患者中静脉注射到辐照小鼠体内。
3. 移植两周后, 利用流式细胞仪 (facs) 测定骨髓中的白血病植皮, 并使用针对 cd45 的特定于鼠肉和人的抗体。
4. 执行流式细胞仪分析。
   1. 从移植的小鼠的股骨中取出骨髓吸气。如上所述, 使用 rbc 裂解缓冲液, 通过离心收集 tmnc。用冷的 1x pbs 清洗颗粒1x。
   2. 用人 fcr 阻滞和小鼠 fcr 阻滞块块细胞, 然后在4°c 下隔夜用抗人类 cd45 fitc 和抗小鼠 cd45 apc^cy7染色。在 lsri 上进行流式细胞仪分析, 并使用流式细胞仪分析软件对数据进行分析。
5. 将小鼠分为四个不同的群体 (n = 6 组), 与车辆进行治疗, 伊马替尼 (75 mg/kg)、dfc + bci (均为 10mg/kg) 或伊马替尼 (75 mg/kg) + dfc + bci (均为 10 mg/kg)。稀释 1x pbs (车辆) 中的库存药物, 并通过每天注射2。
6. 治疗小鼠六个星期, 并确定白血病负担每两周, 直到第8周移植后, 如上文11.4 所述。

结果

癌基因成瘾与 tki 的治疗效果有关。然而, 驱动癌基因依赖的机制并不清楚。我们进行了多次无偏见的基因表达分析, 以确定参与策划成瘾的基因成分。这些分析揭示了 c-fos、dusp1 和 zfp36 这三个基因在癌细胞中的上升, 这些基因不依赖于肿瘤信号的生存, 因此对 tki 治疗不敏感。由 shrna 介导的击倒降低 c-fos 和 dusp1 的调节, 足以恢复其他 tki 耐药细胞的药物敏感性。

讨论

对于大部分癌细胞, 对 tki 的治疗反应是通过阻断肿瘤所依赖的酪氨酸激酶-onco蛋白信号来介导的。然而, 对少数促成 mrd 的癌细胞如何摆脱癌基因依赖和治疗^的了解相对较少4。最近的研究表明, 生长因子信号介导白血病和实体器官肿瘤的耐药性。这表明, 各种分子机制可能是内在阻力^{10、11、12 的}基础。为了了?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Materials
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)	Stem Cell	3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)	Stem Cell	4434
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H6278
Recombinant Murine SCF	Prospec	CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Prospec	CYT-340
Recombinant Murine IL-6	Prospec	CYT-350
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratory	I-5508
Curcumin	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in water
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0.45 μM acro disc filter	PALL	2016-10
70 μm nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5762
Nitrocullulose Membrane	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD	558612
CD117 APC	BD	553356
BD Pharm Lyse	BD	555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)	BD	554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow)	BD	554723
phospho p38	Cell Signaling Technologies	4511S
total p38	Cell Signaling Technologies	9212
Mouse IgG control	BD	554121
Alexa Flour 488 conjugated	Invitrogen	A-11034
Calcium Chloride	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Blood Capillary Tubes	Fisher	22-260-950
Blood Collection Tube	Giene Bio-One	450480
Newborn Calf Serum	Atlanta biological	S11295
Erythropoiein	Amgen	5513-267-10
human SCF	Prospec	CYT-255
Human IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay)	Stem Cell Technologies	5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar)	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Doxycycline chow	TestDiet.com	52662	modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline
Tamoxifen	Sigma	T5648
Iodonitrotetrazolium chloride	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit)	Qiagen	217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)	Bio-Rad	1725270
CD117 MicroBead Kit	Miltenyi	130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (boold counter)	Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)	BD
Fortessa I (FACS analyzer)	BD
FACSAriaII (FACS Sorter)	BD
Magnet Stand	Miltenyi
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Model 68A	source Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ	mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Made in house
Cells
BaF3	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells	University Hospital, University of Cincinnati