基于基因组编辑的果蝇组织特异二进制转录系统的高效生成策略

摘要

在这里, 我们提出了一个方法, 以产生组织特定的二进制转录系统的果蝇, 取代第一编码外显子的基因与转录驱动。CRISPR/Cas9-based 方法在被替换的基因的内生调控下放置一个 transactivator 序列, 从而促进 transctivator 表达专门在基因特定的时空模式。

摘要

二进制转录系统是强大的遗传工具, 广泛用于可视化和操作细胞的命运和基因表达在特定群体的细胞或组织的模型有机体。这些系统包含两个组分作为分开的转基因线。一条驱动线在组织特异的促进剂/促增强剂的控制下表达转录激活物, 一个报告/效应线将一个目标基因放置在转录激活器的结合部位。饲养两个组分的动物诱导了靶基因表达的组织特异转录激活。精确的时空表达基因在靶向组织是至关重要的无偏见的解释细胞/基因活动。因此, 开发一种生成专属细胞/组织特定驱动程序线的方法是必不可少的。在这里, 我们提出了一个方法来产生高度组织特定的目标表达系统, 采用 "聚集定期 Interspaced 短回文重复/CRISPR 相关" (CRISPR/Cas) 的基因组编辑技术。在这种方法中, 限制性 Cas9 的目标是两个嵌合导向 rna (gRNA) 到特定地点的第一编码外显子的基因在果蝇基因组, 以创建双链断裂 (争端)。随后, 使用含有 transactivator 序列的外源性捐赠质粒, 细胞自主修复机械能够实现争端处理机构的同源定向修复 (HDR), 从而精确删除和替换外显子与 transactivator序列。被敲入的 transactivator 是完全地表达在被替换的基因的cis调控元素起作用的细胞。在这里提出的详细的分步协议, 以产生一个二进制转录驱动程序表达在果蝇/branchless产生的上皮/神经细胞细胞可以采取任何基因或组织特定的表达。

引言

基因工具箱的目标基因表达已经在果蝇中得到了很好的发展, 这使得它成为一个最好的模型系统, 以调查有关基因的功能, 涉及多种细胞过程。二进制表达系统, 如酵母Gal4/UAS (上游活化序列), 首次采用的组织特异性增强诱捕和基因 misexpression 在果蝇遗传模型¹ (图 1)。该系统促进了许多技术的发展, 如基因过度表达的时空调控, misexpression, 在选定的细胞组的挖空, 以及细胞消融, 细胞标记, 细胞和分子的实时追踪在发育过程中的胚胎和组织, 沿袭追踪和马赛克分析。一些二进制转录系统, 如细菌莱克萨/莱克萨操作系统 (图 1) 和粗糙Q 系统, 是强大的基因工具, 现在广泛用于果蝇,除了原 Gal4/UAS 系统的目标基因表达^1,2,3。

在这里, 我们提出了一个方法来生成高可靠的组织特定的二进制表达系统, 采用基因组编辑技术。最近在 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术方面的进步, 使得在广泛的生物体中进行定向基因组改变的机会空前。与其他可用的基因组编辑技术相比, CRISPR/Cas9 系统成本低廉、效率高、可靠。这项技术利用细菌适应性免疫系统的组成部分:化脓链球菌的 Cas9 限制性, 创建双链断裂 (争端), 和嵌合体指南 RNA (gRNA), 它引导 Cas9 到一个特定的基因组站点目标争端⁴。这些细胞包含用不同途径修复争端的机器。非同源端连接 (NHEJ) 导致小的插入或删除, 以扰乱基因功能, 而同源定向修复 (hdr) 引入一个定义的定向/理想的基因组敲/敲出使用外源 HDR 捐赠者作为模板。基于 HDR 的替换策略可以有效地用于生成一个高度可靠的组织特定的二进制表达式系统, 它可以克服传统增强器陷阱方法的所有局限性。我们描述了一个循序渐进的过程, 利用 CRISPR/Cas9-based HDR 修复生成一个二进制转录驱动程序线的控制下表达的内源转录和转录后调节的果蝇基因。在本协议中, 我们演示了一个特定于branchless (bnl) 基因编码的驱动程序线的生成, 用于调节气管道上皮⁵的分支形态发生。在这个例子中, bnl基因的第一个编码外显子被细菌莱克萨transactivator 序列的序列所取代, 而不改变bnl基因的任何内源cis调节序列。我们表明, 该策略产生了一个bnl 莱克萨驱动程序线, spatiotemporally 控制在LexAoperator (LexAop或LexO) 下游的记者基因的表达, 完全在bnl-表达上皮细胞/间充质/神经细胞。

研究方案

1. gRNA 表达载体的设计与构造

1. 要精确替换外显子的长定义区域, 请使用双 gRNA 方法⁶, 其中每个 gRNA 可以专门针对所选区域的两端。为了获得一个精确的基因特定的时空表达的驱动程序, 选择两个 gRNA 目标网站内的第一编码外显子的基因。
2. 对于果蝇, 使用 flyCRISPR 最佳目标查找工具 (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/) 选择 gRNA 目标站点。其他可用的 CRISPR 设计工具也可以使用 , 包括优化的 CRISPR 设计工具 ( http : / / crispr . mit . edu ) , FlyCas9 ( https : / / shigen . . ac . jp / fly / nigfly / cas9 ) 和电子脆 ( www . e - crisp . org / E - CRISP ) 。
   注意: gRNA 设计和克隆的以下协议是从先前描述的^6、7的方法中采用的。
   1. 将实际序列复制到联机工具中提供的框中。选择最近发布的果蝇基因组注释版本 "r_6", 在 "选择基因组" 下拉菜单中。在 "选择指南长度 (nt)" 字段中, 输入 "20"。选择以查找 "所有 CRISPR 目标", 然后单击 "查找 CRISPR 目标"。
   2. 通过为 "PAM" 设置 "严格" 和 "仅 NGG" 的 "最大值" 来评估所有候选 gRNA 目标。尝试选择没有任何潜在的非目标的 gRNA 站点, 或尽可能少的离目标数。使用 Doench等2014 ⁸中描述的 web 工具选择具有潜在 "良好" 活动分数的 gRNAs。
   3. 同时, 确保选择注射的父飞线基因组中的 gRNA 目标中没有单核苷酸多态性 (如 X 染色体上的nos-Cas9 , BL 54591)。按照尤金·格拉茨等2015⁷中描述的协议, 从母飞线提取基因组 DNA。PCR 放大, 大约, 500–1,000 nt 地区使用引物, 侧面的利益序列和高保真 DNA 聚合酶;序列-验证 PCR 放大产品。
3. 为了生成串联 gRNA 表达式向量, 请遵循结扎无关的克隆协议⁶将两个 protospacer 序列引入 pCFD4 RNA 表达式向量中。请注意, 现在可以使用改进的多 gRNA 表达式向量 (pCFD5), 在这两种 sgRNAs 都是由强 U6:3 启动子⁹ (https://www.crisprflydesign.org) 表示的。使用 DNA 组装方法将 gRNAs 克隆到 pCFD4 向量中。
   1. 设计并订购用于将两个 protospacer 序列引入 RNA 表达式向量 pCFD4 (表 1A) 的正向和反向引物。如前所述⁶, 正向底漆包含在 pCFD4 中对应于 U6-1 启动子和 gRNA 芯的区域两侧的第一 protospacer 序列;反向底漆包含在 pCDF4 中对应于 gRNA 核和 U6-3 启动子的区域两侧的第二 protospacer 的反向补充序列。
   2. 并用重悬底漆到100微米与 DNase 和 RNase 无二蒸馏水 (ddH₂O)。制作10微米工作浓度底漆。使用 pCFD4 质粒作为模板, 并建立 pcr 反应使用高保真聚合酶和推荐设置 pcr 反应⁶。
   3. 将放大后的产品复制到 pCFD4 中, 通过建立 BbsI 酶 pCFD4 质粒, 通过以下反应: pCFD4 质粒2–5微克, 5 ul 10x 消化缓冲液, BbsI 酶 1 ul, ddH₂O 使最终体积达到 50 ul。通过轻轻地敲击管子, 将管子壁上的所有分散的水滴收集到底部, 通过简单的旋转来混合反应内容。在37摄氏度的2小时内孵化反应混合物。
   4. 在1% 琼脂糖凝胶上, 从步骤2和消化后的产品中运行 PCR 产品。进行电泳有足够的时间完全分离的 DNA 带。在 UV 反辐射灯下切割正确尺寸的 DNA 带, 然后使用制造商的指示 (见材料表), 用凝胶洗脱柱纯化预期的产品。PCR 产物应为 600 bp, 线性化 pCFD4 质粒应为 6.4 kb ⁶。
   5. 根据制造商的指示, 在 PCR 管中设置 DNA 组装反应 (见材料表)。
   6. 将组装产品的 2 ul 转换成合格的细菌 (DH5α或类似的菌株与δrecA1, δendA1), 在氨苄西林 (100 微克/毫升) 板上含有 lb (磅/安培) 琼脂板, 并孵化在37°c 过夜。请注意, DNA 组合组合可能对某些细菌菌株有毒, 但稀释组装组合可降低毒性。
   7. 从隔夜孵化的盘子中挑选3–4氨苄西林抗性的菌落, 在3毫升磅含有100微克/毫升氨苄西林的蚁群中接种疫苗, 并在一夜之间在37摄氏度的振动筛中生长接种细菌。在制造商的指导下, 用质粒迷你预备试剂盒从夜间培养的细菌中提取质粒 (见材料表)。
   8. 序列的质粒与 T3 普遍底漆, 以筛选正确的克隆包含串联 gRNA 插入。建立一个甘油库存的细菌转化为经过序列验证的 pCFD4-gRNA 在20% 甘油和存储在一个-80 °c 冷藏库供将来使用。

2. 设计和建造 HDR 捐助者

1. 对于Gal4或莱克萨序列的基因组撞击, 设计一个双绞合的 HDR 供体, 其中包含 transactivator 序列, 两侧有两个同源臂。
   1. 使用 > 1.5 kb 左右同源臂侧翼的 gRNA 目标站点。扩展同源武器在修复过程中提高了 HDR 的效率¹⁰。
   2. PCR 放大从选择注射的母飞线提取的基因组 DNA (gDNA) 的同源臂 (例如, nos-Cas9 (X 染色体), BL 54591)。使用证明阅读热启动 Taq DNA 聚合酶酵素适合长时间 PCR 延长 (参见材料表)。序列验证。
2. 为了避免重定向的 gRNA 到工程的轨迹, 设计的替代捐赠者, 这样的方式, gRNA 识别网站被引入外源序列中断。
   注意: 为了避免改变假定的 cis 管理元素, 请始终选择编码外显子区域内的 gRNA 识别站点。
3. 为生成替换卡带, 计划将 DNA 组装策略加入四段: 5 ' 和 3 ' 同源臂, 中间外源 transactivator DNA 序列, 以及线性化克隆载体主干 (例如, pUC19 或其他通常使用的克隆载体)。按照制造商的 DNA 组装指南 (见材料表), 设计合适的引物进行 PCR 扩增和组装的每个环节。并用重悬底漆到100微米与 ddH₂o 制造一个10微米工作浓度底漆。使用高保真聚合酶的所有 PCR 反应。遵循以下协议:
   1. PCR 放大一个Gal4或莱克萨表达盒从一个可用的载体 (如, nls-LexA:p65; 理想的Gal4/LexA/QF2表达质粒可以找到, 并获得从 Addgene 等公共资源) 使用引物列于表 1B。
      1. 为了保留被替换的外显子的所有原始的转录和后转录章程在 transactivator 脱氧核糖核酸序列的表示, 设计盒式磁带用被编辑的基因组等位基因将表达的嵌合体 mRNAtransactivator 和基因。保留目标外显子的 5 ' 和 3 ' 末端, 以保留任何拼接信号。
      2. 在剩余 5 ' 编码外显子和 transactivator 序列之间加入一个 T2A 自裂解肽序列, 以防止翻译成嵌合蛋白。添加一个翻译停止密码子后, 外源 transactivator 序列 (图 5)。
   2. PCR 放大从选择注射的母飞线 (例如, nos-Cas9 (X 染色体), 54591 号 gDNA) 提取的基因组 DNA 中的同源臂, 使用表 1B中列出的引物。使用高保真聚合酶的所有 PCR 反应使用的系统如下: 5 ul 5x 反应缓冲器, 0.5 ul 10 毫米 dNTPs, 1.25 ul 的10微米前底漆, 1.25 微米的反向底漆, 10 ul 的模板 DNA, 0.5 ul 高保真 DNA 聚合酶, 16.25 ul ddH₂O。
   3. 使用线性化克隆向量, 如 pUC19。现在有许多捐助者的载体。请参阅以下网站的综合列表-http://flycrispr.molbio.wisc.edu。
   4. 在1% 琼脂糖凝胶上运行 PCR 产品。进行电泳有足够的时间, 以确保明确分离所需的带与不希望的非特定频段 (如果有)。凝胶-净化预期的 DNA 片段。使用分光光度计测量每个纯化 DNA 片段的浓度。
   5. 根据制造商的指示建立 DNA 装配反应。将线性克隆向量和目标片段从步骤3和步骤4混合在下面的反应中: 1 个 ul 的线性克隆向量 (50 ng/ul), 2–3折叠超过每个目标片段, 10 ul 2x DNA 组装主混合, 带来最终反应体积到 20 ul 与 ddHc21>2o 在50摄氏度孵育1小时的反应混合物。
   6. 将组装产品的 2 ul 转换成合格的细菌, 在含有100微克/毫升氨苄西林的 LB/安培琼脂板上板。另外, 在板上添加 X-Gal + IPTG 以进行蓝/白筛选。
   7. 从隔夜孵化的盘子中摘下3–4白色的菌落, 在3毫升磅的100微克/毫升氨苄西林中接种蚁群, 并在一整夜的振动筛中生长37摄氏度。根据制造商手册 (见材料表), 用质粒迷你预备试剂盒从夜间培养的细菌中提取质粒。
   8. 通过 PCR 或限制消化筛选阳性菌落。
   9. 序列验证最终质粒的 HDR 捐赠区域。保存与正确的克隆在20% 甘油在-80 °c 转化为未来接种的细菌存量。

3. 胚胎注射、飞行遗传学和基因组编辑的筛选

1. 用质粒 maxiprep 试剂盒制备高纯度无内毒素 gRNA 表达载体以及 HDR 供体质粒 (见材料表)。
2. 共注入 gRNA 表达质粒 (100 ng/ul) 和替代捐助者 (500 ng/ul) 到nos-Cas9胚胎的生殖⁶。注: 我们使用的是一个商业服务的注射, 但这个程序可以在实验室进行。
3. 飞行遗传学和筛选 (图 2和图 3):
   1. 当注入的胚胎发育成成人, 交叉每一个 G₀飞到平衡器苍蝇。为含有目标等位基因的染色体选择合适的平衡器。
   2. 麻醉 F1 的后代从每个 G0 十字在一个 CO₂垫和随机挑选10-20 男性在显微镜下。将它们单独交叉到平衡器雌性, 如图 3所示。
   3. 当 F2 幼虫孵化时, 从每一个十字架上挑选一个 F1 的父亲, 用单飞基因组 DNA 准备协议提取 gDNA:
      1. 制备 gDNA 萃取缓冲器:10 毫米三氯 pH 8.2, 1 毫米 EDTA, 25 毫米氯化钠, 常温贮存。准备20毫克/毫升蛋白酶 K 库存解决方案, 并储存在冰箱。
      2. 将每只苍蝇放入一个1.5 毫升的微离心管中, 并给管子贴上标签。在-80 摄氏度冷藏库过夜。
      3. gDNA 提取缓冲液的新工作容积, 含200µg/毫升的蛋白酶 K 的最终浓度。
         注意: 不要为此步骤使用旧缓冲区。
      4. 每飞行 10–15 s 与一个吸管尖端含有 50 ul 的挤压缓冲器不配药的液体。把剩余的缓冲器放进管子里, 混合好。孵育在37°c 为20–30分钟。
      5. 把管子放在95摄氏度的热量块中, 以使其不灭蛋白酶 K。
      6. 在 1万 x g处旋转5分钟。将制剂贮存在4摄氏度, 进行进一步的 PCR 分析。
4. 使用相同的方法来准备 gDNA 从nos-Cas9飞, 这是一个负控制。执行三步 PCR 为基础的屏幕, 以确定正确的 "结束" HDR (图 2,图 5) 使用 gDNA 的每个 F1 男性作为模板⁵。使用 1 ul 的 DNA 准备在以下 pcr 反应系统:10 ul 的 2x pcr 大师混合染料, 1 ul 的每一个底漆 (10 微米), 1 ul 的 dna 模板, 7 ul ddH₂O。
5. 如图 5A所示, 使用引物 fwd1 和 rev1 进行 PCR, 以筛查是否存在插入或替换;使用 fwd2 和 rev2 引物进行 PCR, 验证 3 ' 地区的插入或替换;使用引物 M13F 和 rev3 进行 PCR 检查 "端入" HDR (表 1C)。
6. 保持飞行线与确认结束的 HDR 和建立平衡的股票从 F2 一代。Outcross 的平衡器再次飞行, 以消除任何意外突变的其他染色体。
7. 从已建立的股票中制备高质量的 gDNA, 用于扩增长 PCR (> 800–1,000 nt) 扩增子, 高保真 Taq 聚合酶和完全序列验证从工程基因组区域获得的 amplicons。或者, 使用先前描述的粗 gDNA 提取物放大较短的 (< 800 nt), 重叠的 PCR 产品序列验证编辑的基因组。使用以下协议准备好质量果蝇基因组 DNA:
   1. 在一个1.5 毫升的离心管中放置大约25只成年苍蝇, 并在-20 摄氏度或-80 °c 冷藏库中冷冻至少1小时。
   2. 添加 250 ul 溶液 A (pH 9.0 三盐酸0.1 米, EDTA 0.1 米, SDS 1%)。
   3. 用离心管中的均质杵融汇苍蝇, 把管子放在冰上。
   4. 孵育70°c 30 分钟。
   5. 添加 35 ul 的 KOAc (5 M), 摇动, 并混合好, 但不漩涡。
   6. 在冰上孵育30分钟。
   7. 旋转 1.2万 x g 15 分钟。
   8. 用1毫升的微, 小心地将清清上移到新管上, 留下任何沉淀或相间。
   9. 添加 150 ul 的异丙醇到上清。通过反转轻轻混合。
   10. 旋转 1万 x g 5 分钟。
   11. 小心取出上清液, 把球团留在管子里。
   12. 用1毫升70% 乙醇清洗颗粒。
   13. 旋转 1.2万 x g 5 分钟。
   14. 移除上清。空气干燥颗粒15至20分钟。不要过度干燥颗粒。
   15. 在 ddH₂O 的 100 ul 中溶解颗粒。
   16. 使用高保真 DNA 聚合酶适合长扩增子 (> 800 bp) 放大完整的编辑区域。理想情况下, 将两个引物放在插入的卡带外以放大基因组区域。凝胶纯化 PCR 产品, 如前所述, 序列验证产品与多个重叠底漆。
8. 验证工程飞行线解剖组织/胚胎的正确时空表达模式:
   1. 从总 RNA 中进行 rt-pcr 检测, 以验证杂交 mRNA 产品的表达 (表 1D)。
   2. 进行原位杂交的 mRNA 产品的兴趣在幼虫组织/胚胎, 以验证表达。
   3. 要在序列验证结束线之间筛选精确的组织特定时空表达式模式, 请将为二进制表达式驱动程序获得的每条经过编辑的行与LexOGFP 或LexO-RFP 进行交叉 (用于莱克萨驱动) 线 (从布卢明顿股票中心提供) 和观察莱克萨或Gal4驱动的报告基因在胚胎, 幼虫和成人组织在荧光显微镜下的表达。

结果

该协议成功地用于生成一个特定于bnl表达单元⁵的目标二进制表达式报告器系统。控制复杂时空bnl表达的cis调控元素 (重新审查) 没有特征。因此, 为了在内源bnl调控序列的控制下实现时空表达, 只有bnl的第一编码外显子被设计为以细菌莱克萨transactivator 序列取代。一个改进的 nls-莱克萨::p 65盒已知提供最佳的?...

讨论

传统上,果蝇增强器陷阱是由两种不同的方法产生的。其中一个方法包括随机插入一个驱动程序 (例如, Gal4) 序列在基因组中通过移位 (e., P 元素移位)¹ 。或者, 驱动程序序列可以放置在一个假定的增强/启动子区域的转录控制的质粒结构, 然后将集成到基因组^3,11的异位点。虽然这些方法已经产生了大量的Gal4或

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	cloning
LB-Agar	BD Difco	BD 244520	cloning
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
10% SDS	Sigma Aldrich	71736	Molecular Biology
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Molecular Biology
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Molecular Biology
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Restriction enzyme
Primers	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		DNA template and vector for gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-high fidelity Taq	NEB	NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	DNA assembly
pBPnlsLexA:p65Uw	Addgene		DNA template for LexA amplification
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
Gel elution kit	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	Molecular Biology
TRI reagent	Sigma-Aldrich		Molecular Biology
Direct-zol RNA purification kits	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit	NEB	E5315S	Molecular Biology
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Fly line
UAS-CD8:GFP	Kornberg lab		Fly line
btl-Gal4	Kornberg lab		Fly line
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
Confocal Microscope SP5X	Leica		Imaging expression pattern
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation
NanoDrop spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-1000	DNA quantification