前体小鼠膈肌三方突触细胞特异性钙信号的影像学研究

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以图像钙信号在个别细胞类型的人群在小鼠神经肌肉连接。

摘要

细胞在组织中的电活动可以通过电生理技术进行监测, 但通常仅限于对单个细胞的分析。由于细胞质中的细胞内钙 (Ca^{2 +}) 的增加往往是由于电活动, 或对无数其他刺激的反应, 这一过程可以监测的影像, 加载与荧光钙敏感染料。 然而, 由于这些染料被组织内的所有细胞类型占去, 很难在整个组织内的单个细胞类型中想象这种反应。相比之下, 基因编码的钙指标 (GECIs) 可以用单个细胞类型和荧光来表达, 以响应胞内 ca^{2 +}的增加, 从而允许在整个人群中的 ca^{2 +}信号的成像单个单元格类型。在这里, 我们应用 GECIs GCaMP3/6 的小鼠神经肌肉连接, 一个三方突触之间的运动神经元, 骨骼肌, 和终端/perisynaptic 雪旺细胞。我们展示了这种技术在经典的活体组织制剂中的效用。使用光学分光器, 我们执行动态 Ca^{2 +}信号的双波长成像和神经肌肉连接的静态标签 (NMJ) 的方法, 可以很容易地适应监测两个细胞特定的 GECI 或基因编码的电压指标 (GEVI) 同时进行。最后, 我们讨论了用于捕捉荧光强度空间图的例程。这些光学、转基因和分析技术可以用来研究 NMJ 中不同细胞亚群在多种环境下的生物活性。

引言

NMJ 像所有的突触一样, 由三元素组成: 一个突触前终端, 从神经元, 突触后神经元/效应细胞, perisynaptic 胶质细胞^1,2。虽然突触传输的基本方面在这个突触³首先被证明, 这个过程的许多方面仍然不明, 部分由于这个突触的不同的细胞元素表达相同的分子。例如, 由脊椎动物 NMJ 的运动神经元共同释放的嘌呤腺嘌呤核苷酸 ATP 和乙酰胆碱的受体, 由肌肉、雪旺细胞和运动神经元表达, 从而使任何这些物质施加的功能效应 (例如, 发射机释放或反应, 肌肉力量世代)⁴。此外, 虽然 NMJ 的三方成分比较简单, 例如, 中枢神经系统中的神经元通常呈现多个突触输入, 无论是运动神经元、肌细胞还是雪旺细胞因刺激而变化关于它们的内在异质性 (如胚胎衍生、纤维亚型、形态学) 尚不清楚。为了解决这些问题, 在一个突触元素中同时跟踪许多细胞的反应, 以及在其他任何一个单独的元素中同时跟踪这种反应是有利的。使用化学染料来测量钙信号的常规策略不能达到这两个目标, 因为沐浴应用染料在应用到组织后被多种细胞类型所占, intracellularly 载染料只能用于可视化单个或小的细胞群。在这里, 利用转基因小鼠表达 GECIs 设计来测量细胞特定的钙信号, 连同具体的成像和软件工具⁵, 我们展示了这两个总体目标的第一个, 并讨论如何添加新的转基因工具将有助于实现第二个目标。这项技术将是有用的任何人感兴趣的跟踪钙动力学或其他细胞信号事件可观测到通过基因编码的光学传感器在多个细胞群体的同时。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

畜牧和实验是按照国家卫生研究院的指导, 为实验室动物的护理和使用和 IACUC 在内华达大学。

1. 转基因小鼠横膈膜和膈神经的制备

1. 购买转基因小鼠和寡核苷酸引物对这些小鼠进行基因型。
   注: 这些小鼠的 "信息" 页面上都列出了引物。
   1. 饲养一只3至6月大的老鼠, 表达一份适当的转基因/敲入的GCaMP3/6等位基因的副本, 并与同一年龄的第二只老鼠表达条件 GCaMP3/的一或两份副本. 6个等位基因和零拷贝的综合动力基因。
   2. 基因型的幼崽和标记的那些有创有和条件 GCaMP3/6 等位基因-这些将从此被称为双转基因小鼠 (例如, Myf5-Cre,条件 GCaMP3)⁶。
      注意: 这样, 所有的数据都将从老鼠身上得到, 这些小鼠表达了一份有条件的 GCaMP3/6 等位基因。这是特别重要的, 当添加其他突变小鼠 (如, 挖空) 这些十字架。
2. 当双转基因小鼠是适当年龄 (如产后0或 5 [P0 或 P5] 或成人), 弄死小鼠斩首他们与剪刀 (对小鼠比 P10) 或放置在异氟醚吸入室-当他们是不再用一把钳子捏尾巴, 他们已经准备好牺牲了。
3. 用剪刀把动物斩首。
4. 横断面横跨整个动物刚好在肝脏之下和在心脏和肺之上与虹膜剪刀。
5. 解剖远离肝脏, 心脏和肺部, 小心保持一个长度的膈神经, 足够长的时间被吸引到吸入电极 (即, 1-2 厘米)。
   注意: 左膈神经可以被识别为一个白色的组织, 进入左膈内侧部分。在取出肺部时不能剪掉。右膈神经在一条筋膜内运行, 也含有上腔静脉, 比腔静脉更薄、更白。在一起, 他们都穿透右内侧隔膜。
6. 进一步去除胸腔和脊椎柱, 除了在隔膜周围的薄脊。
7. 将隔膜和膈神经样本放置在离心管中, 克雷布斯1µg/毫升 594-αBTX, 在黑暗中10分钟。
   注: 这种浓度的 594-αBTX 标签乙酰胆碱受体 (AChRs) 不阻断其功能 (个人观察)。

2. 肌肉动作电位的刺激和记录

1. 使用 minutien 针, 固定膜片, 固定在一个6厘米的盘子涂上硅胶介电凝胶, 并填补了〜8毫升的含氧克雷布斯溶液, 并把它放到显微镜阶段。灌注膜片与更多克雷布斯-响铃解答 (8 毫升/分钟) 为30分钟。
   注: 这冲洗未绑定的594αBTX, 以及 equilibrates 后, 解剖组织。
2. 根据所建立的方法制作吸电极⁷。
   1. 在4X 放大倍数, 使用机器人, 移动吸入电极在左膈神经和应用吸入通过拉出5毫升注射器的枪管连接到连接到吸入电极的导管。
      注: 当成功地吸入电极时, 膈神经绷紧。打开刺激器, 通过翻转手动开关1x 来刺激膈神经。
   2. 确保膜片与1赫兹刺激的合同, 通过视觉检查它与 brightfield 照明。如果没有, 调整电压旋钮, 逐步实现 supramaximal 脉冲, 这可以通过视觉检查肌肉收缩。如果仍然不可见, 用注射器吹出神经, 并尝试通过吸入来再次吸引它。
3. 关闭灌注和添加肌肉特异的肌球蛋白抑制剂 BHC⁶或电压门控钠通道拮抗剂µ-芋螺毒素⁸最终浓度100µM。
   1. 为使100µM BHC, 吸管4µL 200 毫米股票在亚砜和 predilute 它在1毫升克雷布斯响铃解答。
   2. 从盘子中取出1毫升的克雷布斯溶液。
   3. 添加 prediluted BHC, 到菜。
      注: 此 predilution 有助于防止未经稀释的亚砜在 GCaMP3-expressing 细胞中的非瞬态荧光反应诱导。
   4. 等待30分钟, 然后, 打开新的克雷布斯解决方案的灌注另一个 20-30 分钟。
4. 准备录音电极。
   1. 戴着手套, 将一个直径 (外径) 为1毫米的硼硅酸盐 filamented 玻璃和 0.4 mm 的内径 (ID) 放入微拉拔器中, 并拧紧刻度盘以将其夹紧到位。关上拉拔门。
   2. 使用 P-97 拉出器, 程序如下设置: 热 900, 拉 120, 速度在 75, 时间在 250, 压力在 500, 并没有额外的循环。
      注意: 电阻 (R) 是使用放大器的软件控制来测量的: 数据采集软件通过解决公式 V = IR 来确认电阻。软件控制器通过电极传递已知电流 (I) (通常为 1 nA), 并测量电压 (V) 的变化, 从而使我们能够解决 R。
   3. 对于胚胎隔膜, 确保阻力接近 60 MΩ, 并为较旧的隔膜, 10-20 MΩ。加载记录电极与3米氯化钾。
5. 在10X 的放大倍数下, 将电极降低为肌肉, 使用第二机器人在舞台的另一侧作为刺激电极。
6. 使用电生理数据采集软件, 等到静止膜电位从0到-65 mV 或以下的变化。
7. 刺激1赫兹和验证肌肉动作电位的存在, 检查一个巨大的潜力, 显示适度超调 (电位上升超过 0 mv, 当它开始在-65 mv 或以下)。不要把刺激工件与动作电位混淆。
   注: 在持续时间 (~ 5 毫秒) 中, 电位明显长于刺激工件。

3. 样品的荧光成像

1. 在20X 放大, 找到在肌肉中心的终板带, 寻找 594-αBTX–labeled NMJs 下绿色/黄色光激发 (550 nm)。切换到蓝光激发 (470 nm) 到图像 Ca^{2 +}反应的肌肉, 运动神经元, 或雪旺细胞。
2. 如果需要, 设置带通滤波器的图像分配器和双波长成像的分色单刃滤波器。
3. 为了计算 GCaMP3/6-expressing 组织所展示的最大荧光 (Fmax), 将12µL 3 米氯化钾 (氯化钾) 添加到隔膜制剂⁶中。
   1. 在查阅表格栏上的亮度条上进行实验, 将其设置为 GCaMP3/6-expressing 组织以20X 倍的比例显示饱和度的 110%, 而不 binning 以应对氯化钾。
4. 每秒记录20帧, 以不错过任何快速事件。
5. 刺激与1四十五年代 20-40 赫兹神经刺激通过提供一列冲动使用吸入电极或增加药理激动剂由巴恩应用或通过灌注和收集动态荧光 Ca^{2 +}反应在一个细胞子类型连同静态的594αBTX NMJ 信号。
   注: 如果组织特异性的红或远红色 GECI 或 GEVI 小鼠可在 NMJ 使用, 它们可以用来收集两个动态信号, 反映两个不同的细胞元素在 NMJ。
6. 当成像或电生理实验完成, 因为预期的结果已经达到, 灌注水通过灌注线和吸水 2x-3x 通过吸入电极, 以确保盐不建立起来。

4. 通过荧光强度标准偏差图 (SD_iu16) 对数据进行出口和分析

1. 记录作为16位 TIFF 栈记录的图像序列, 并将其加载到所需的图像数据分析系统中进行分析。
2. 在软件的8d 文件菜单中, 选择感兴趣的图像堆栈, 然后单击加载。
   1. 一旦视频加载, 扫描通过时间来识别一个没有细胞荧光活动的部分。
      注意: 此区域将用于创建背景示例。
   2. 按住Shift并单击以在标识为背景示例区域的区域中绘制 "感兴趣区域" (ROI) 框。
   3. 创建框后, 按空格键生成背景活动更改的情节。
   4. 右键单击跟踪并选择 "分类 " 选项以显示将ROI 转储为文本的选项, 以便将跟踪作为 xy 坐标文本文件。
3. 向后移动到感兴趣的视频, 再次扫描以确定感兴趣活动发生的时间区域。
   1. 使用鼠标中键, 在黄色时间框中选择此时间区域。
   2. 右键单击视频并选择堆栈 OPS , 然后统计映射选项5。
      注意: 这将在左窗口中生成标准偏差映射 (SD 映射)。
   3. 点击 SD 地图, 然后按下]键19x 应用适当的颜色热图。
   4. 右键单击 SD 地图, 然后选择STM 加载和保存, 这将显示将stm 保存为 tiff的选项以保存 sd 映射。
   5. 然后, 按[键19x 以返回灰度色图。
   6. 按C , 然后D来提出密度映射工具。使用鼠标左键和鼠标中心键, 调整阈值, 包括 SD 图中显示的所有荧光活动。
   7. 按C键关闭密度工具, 同时保持阈值设置。
   8. 右键单击 SD 地图, 然后选择STM 粒子, 然后找到 PTCLS。
      注意: 这将识别单个细胞表达荧光活动。
   9. 再次右键单击 SD 映射, 然后选择 "创建粒子 ROIs"。
      注意: 这将叠加所选单元格的原始视频感兴趣。
   10. 在按住Shift的同时, 右键单击原始视频中任何一个已识别的粒子 ROIs。
   11. 选择 roi标记并在 ROI 中度量 Int。
       注意: 这将为感兴趣的视频中每个确定的 ROI 生成单个荧光活动图。通过右键单击其中任一项并选择 "分类", 然后将ROI 作为文本转储, 可以节省这些内容。
4. 有关这些操作基础的详细逻辑, 请参阅源代码文件⁹。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

一些荧光强度变化的例子, 介导的增加细胞内钙^{2 +}在定义的细胞类型的 NMJ, 显示了这种方法的效用。这些结果显示为空间荧光强度图, 它提供了响应细胞的位置, 以及它们的响应强度, 从而使人们能够评估多少细胞反应, 以及每个细胞对特定刺激。例如, 如图 1所示, 我们在 P7 Wnt1-Cre的膜片 NMJs 上拍摄了一个终端/perisynaptic 许旺细胞 (TPSCs) ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

在这里, 我们提供了一些例子, 以测量 GECI 表达小鼠完整的神经肌肉组织中的特定细胞的 Ca^{2 +}反应。为了成功地进行这些实验, 在解剖过程中不应损伤膈神经。要在雪旺细胞中以低功率或大功率 (即20X 或 60X) 图像 Ca^{2 +}响应, 必须使用 BHC 或µ-芋螺毒素来阻止移动。对于在肌肉细胞中的 Ca^{2 +}反应的低功率成像, 有可能在没有这些药物的情况下测量它们, 从而允许同时获得?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data