电子顺磁共振在生物样品环境温度和 77 k 的应用

摘要

电子顺磁共振 (epr) 光谱是一种明确的方法来测量自由基。使用选择性自旋探针可以检测不同细胞隔间中的自由基。我们提出了一个实用、有效的方法来收集生物样本, 方便处理、储存和转移用于 epr 测量的样品。

摘要

准确、特异地检测不同细胞和组织间的活性氧 (ros) 是研究生物环境中氧化还原调节信号的关键。电子顺磁共振波谱 (epr) 是唯一明确评估自由基的直接方法。它的优点是, 它检测特定物种的生理水平具有较高的特异性, 但它确实需要专门的技术, 仔细的样品制备, 并适当的控制, 以确保准确的解释数据。循环羟胺自旋探针与超氧化物或其他自由基选择性地反应, 产生可通过 epr 光谱学量化的亚氧化物信号。细胞渗透性自旋探针和自旋探针设计在线粒体中快速积累允许测定不同细胞隔间中的超氧化物浓度。

在培养的细胞中, 使用细胞渗透性 1-羟基-3-甲氧基碳酸-2, 2, 5, 5-四甲基吡咯烷酮 (cmh) 以及和不具有细胞不透水超氧化物歧化酶 (sod) 预处理, 或使用细胞渗透性 peg-sod, 允许细胞外与细胞质超氧化物的分化。线粒体 1-羟基-4-[2-三苯基磷酰磷)-乙酰胺多]-2, 2, 6, 6-四甲基-哌啶, 1-羟基 2, 2, 6, 6-四甲基-4-[2-(三苯基磷磷) 乙酰胺]线粒体 ros (主要是超氧化物)。

自旋探针和 epr 光谱也可应用于体内模型。超氧化物可以检测到细胞外液体, 如血液和肺泡液, 以及组织, 如肺组织。提出了几种处理和储存组织进行 epr 测量的方法, 并在体内提供静脉注射 1-羟基-3-羧基 2, 2, 5, 5-四甲基吡咯烷酮 (cph) 自旋探针。虽然测量可以在室温下进行, 但从体外和体内模型中获得的样品也可以储存在-80°c, 并由 epr 在 77 k 进行分析。样品可以存储在稳定在-80°c 的专用管材中, 并在 77 k 下运行, 以实现实用、高效和可重复的方法, 从而便于存储和转移样品。

引言

虽然氧化应激和活性氧物种的测量对所有器官系统的各种疾病的研究都很重要, 但由于半衰期短、反应性高, 活性氧物种的检测具有挑战性。电子顺磁共振 (epr) 技术是检测自由基最明确的方法。与较常用的荧光探针相比, 旋转探针具有优势。虽然荧光探针相对便宜, 易于使用, 并提供快速, 灵敏的检测 ros, 他们确实有严重的局限性, 由于人工信号, 无法计算 ros 浓度, 以及普遍缺乏特异性 1.

为了便于 epr 用于生物研究, 合成了各种自旋探针, 可以测量一系列与生物相关的自由基物种以及_po2、ph 值和氧化还原状态^{2,3, 4,5,6,7}。自旋陷阱也被开发来捕获短命基和形成长寿的加合物, 这有利于检测 epr⁸。这两类 (自旋探针和自旋陷阱) 都有优点和局限性。一类常用的自旋探针是环状羟基胺, 它们是 epr 静音的, 与短命基反应, 形成稳定的亚硝基氧化物。环羟基胺与超氧化物的反应速度是自旋陷阱的 100倍, 使它们能够与细胞抗氧化剂竞争, 但它们缺乏特异性, 需要使用适当的控制和抑制剂来识别自由基的种类或来源负责亚硝基氧化物信号。虽然自旋陷阱表现出特异性, 根据被困物种的不同, 它们具有明显的光谱模式, 但它们具有超氧化物自旋诱捕的缓慢动力学, 并且容易对自由基加合物进行生物降解。自旋诱捕的应用在生物医学研究^中有据可查^,9、10、11^、12、13.

该项目的目的是演示设计实验和准备样品的实用 epr 方法, 以便在不同的细胞隔间和体内不同的组织隔间中使用自旋探针检测超氧化物。一些手稿公布了与这些目标相关的协议, 使用细胞渗透性、细胞不渗透和线粒体靶向自旋探针, 针对不同的细胞隔间进行体外观察, 并处理组织, 以便在小鼠模型中进行分析^14,15. 我们在这一文献的基础上, 验证了一种方法, 利用 1-羟基-3-甲氧基碳基 2, 2, 5, 5-四甲基吡咯烷酮 (cmh) 自旋探针在不同的细胞隔间在体外测量超氧化物, 以确保准确测量, 突出可能会扭曲结果的潜在技术问题。我们还提供了使用 cmh 自旋探针在血液、支气管肺泡灌洗液和肺组织中进行 epr 测量的方法。这些研究比较了处理组织的不同方法, 并提出了一种在收获组织之前将另一个自旋探针 cph 注入小鼠体内的方法。最后, 我们开发了一种实用的方法来储存样品在聚四氟乙烯 (ptfe) 油管, 允许存储和转移样品之前 epr 测量在 77 k。

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研究方案

所有动物研究都得到了科罗拉多大学丹佛机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 试剂的制备

1. 二乙基氨基苯乙酸 (dtpa) 库存 (150 mm)
   1. 在去离子水中加入2.95 克 dtpa (393.35 g/mol)。
   2. 要溶解 dtpa, 滴注添加 1 m naoh, 并使 ph 值为7.0。
   3. 将体积带至50毫升, 水最终 dtpa 浓度为 150 mm, 并存放在4°c。
2. 磷酸盐缓冲碱 (pbs) (50 mm, ph 7.4)
   1. 制备 5 m 氯化钠 (氯化钠) (58.44 g/mol; 29.22 g/100 ml)。
   2. 制备 1 m 磷酸二钾二基 hk 2 po₄ (174.18 g/mol; 17.42 g/100 毫升)
   3. 制备 1 m 磷酸钾单氮 kh 2 po₄ (136.1 g/mol; 13.61 g/100 ml).将5m 氯化钠与 1 m 磷酸二钾的 4.24 ml 和 1 m 磷酸钾的 0.760 ml 混合。检查 ph 值。
   4. 用去离子水将体积提高到100毫升。
   5. 在室温 (rt) 下短期 (天) 和4°c 下存放, 进行长期 (周) 储存。
3. 含有 100μm dtpa 的 krebs-henseleit 缓冲液 (khb)
   1. 在50毫升锥形离心管中, 加入33.3 微米的 150 mm dtpa 库存溶液。
   2. 使用克瑞克-亨塞利特缓冲 (khb) 将交易量增加到50毫升。
   3. 每天用 dtpa 准备新鲜的缓冲液, 并将其保存在 rt。
4. 含有蔗糖的 tris-edta 缓冲液
   1. 制备 0.5 m tris 库存: 在150毫升的去离子水中溶解 15.14 g tris 基座 (121.14 g/mol)。使用 hcl, 将 ph 值调整到 7.8, 并使最终体积达到250毫升。
   2. 在150毫升去离子水中溶解21.4 克蔗糖 (342.29 g/mol; 最终浓度 = 0.25 mm)。
   3. 添加5毫升的 tris 股票蔗糖, 以实现 10 mm 的最终 tris 浓度。
   4. 在酸蔗糖中加入 0.5 medta 股票 0.5 ml, 以达到 1 mm 的最终浓度。
   5. 检查 ph 值并将其调整为7.4。
   6. 使用去离子水将最终体积达到250毫升, 并在4°c 下储存。
5. 牛红细胞铜锌超氧化物歧化酶 (sod) 库存 (30, 000 u ml)
   1. 在 pbs 的1毫升中重新构建 30, 000 u 的 sod (约5.7 毫克, 取决于 sod 批次的活性)。
   2. 混合良好, 脂肪, 并存储在-20°c 短期 (6-12) 和-80°c 长期存储。
6. sod 工作解决方案 (1000 uml)
   1. 将 30, 000 uml sod 库存的 30μl aliquot 转移到870μl 无菌 pbs 中。
   2. 将溶液放在冰上, 并使用新鲜。
7. phorbol 12-myristate 13-乙酸 (pma) 库存 (5 mm)
   1. 在325μl 的 dmso (最终浓度 = 5 mm) 中溶解1毫克 pma (616.83 g/mol)。
   2. 倾斜一个 5 mm pma 溶液, 并将其存储在-20°c。
8. pma 工作解决方案 (125μm)
   1. 将 5mm pma 库存的 10μl aliquot 稀释为39μl 无菌 pbs。
   2. 将溶液放在冰上, 并使用新鲜。
   3. 对于 pma 的车辆控制, 请在390μl 的 pbs 中使用10μl 的 dmso。
9. 二苯二氧基氯化物 (dip) (2.5 mm)
   1. 在4毫升中溶解3.2 毫克 dip (166.57 g/mol), 以获得 2.5 mm 的库存。
   2. 准备解决方案, 并使用它新鲜。
10. 甲磺酸脱沙胺盐 (dfo) (20 mm)
    1. 在340μl 中溶解4.5 毫克 dfo (656.79 g/mol), 得到 20 mm 的库存。
    2. 准备解决方案, 并使用它新鲜。
11. 抗霉素 a (aa) 库存的制备 (5 mm)
    1. 在乙醇2毫升 (最终浓度 = 5 mm) 中溶解5.4 毫克 aa (532 g/mol)。
    2. 将库存用玻璃瓶中, 存放在-20°c。
12. 自旋探针的制备
    1. 用氮气泡含有 100μm dtpa 的 50 mm 磷酸盐缓冲液 30分钟, 从缓冲液中去除溶解氧。
    2. 从-20°c 的冰柜中取出旋转探头, 并允许容器进入 rt (10-15)。
    3. 称重2.4 毫克的 1-羟基-3-甲氧基碳基 2, 2, 5, 5-四甲基吡咯烷酮·hcl (cmh) (237.8 g/mol)
    4. 将 cmh 溶解到脱氧磷酸盐缓冲液的1毫升中, 最终浓度为 10 mm。
    5. 称重5毫克的 1-羟基-4-[2-三苯基磷磷)-乙酰胺多]-2, 2, 6, 6-四甲基哌啶, 1-羟基 2, 2, 6, 6-四甲基-4-[2-(三苯基磷磷) 乙酰胺] 二氯吡啶 (mito-tempo-h) (529.1 g/mol)。
    6. 将线粒体-tempo-h 溶解到脱氧磷酸盐缓冲液的1毫升中, 最终浓度为 9.5 mm。
    7. 重量4.9 毫克的 1-羟基-3-羧 2, 2, 5, 5-四甲基吡咯烷酮·hcl (cph) (223.7 g/mol)。
    8. 将 cph 溶解到脱氧磷酸盐缓冲液的1毫升中, 最终浓度为 22 mm。
    9. 在-80°c 下进行倾斜和储存 (不建议采用冻融)。

2. 超氧化物的体外检测

1. rt pma 刺激的 raw 264.7 细胞中总超氧化物的检测
   1. 遵循适当的无菌技术, 在二氧化碳孵化器中, 用10% 的 fbs (低内毒素) 和1% 的抗甲肽/安匹西林在37°c 的情况下将其解冻, 并在_dmem培养基中通过。
   2. 在治疗前一天将种子 raw 264.7 细胞在 1 x¹⁰ 6 细胞/中, 进入6孔板。
   3. 轻轻去除培养基, 用1毫升的 khb 缓冲液清洗一次细胞。
   4. 在每口井中加入含有 100μm dtpa 的 khb, 并以下列方法处理总体积为 500μl:
   5. 对于经 sod 预处理的井, 加入15μl/井的 sod 工作溶液 (1000 uml; 最终浓度的 sod = 30 u/ml), 在37°c 孵育10分钟后加入 cmh 和 pma。
   6. 加入 12.5μl/井 10 mm cmh 库存 (最终浓度 = 0.25 mm)。
   7. 加入 40μm pma 工作溶液 (最终浓度 = 10μm) 或40μl 车 (库存 10μl dmso 在390微米 pbs 中)。
   8. 在37°c 下, 在 co2 孵化器中孵育 50分钟 。
   9. 从孵化器中取出这些盘子, 并立即将其放置在冰上。
   10. 收集缓冲从每个井在单独的, 1.5 ml, 标记管。一直在冰上。
   11. 加入含有 100μm dtpa 的100微米新鲜 khb 缓冲液, 轻轻刮刮细胞, 并通过多次上下移液重新悬浮。在整个细胞再悬浮过程中保持在冰上。
   12. 按步骤加载收集的样品 2.1.10, 并在每个毛细管中 2.1.11 (50μl)。密封两端并运行 epr。
       注: 始终测试在缓冲液中含有探针的管或井 (无细胞) (相同浓度 = 0.25 mm), 在与对照相同的条件下处理 (相同的培养时间和温度), 因为探针的背景强度是温度的。和时间相关。
   13. 将 epr 采集参数设置为以下内容: 微波频率 = 9.65 ghz;中心场 = 3432 g;调制幅度 = 2.0 g;扫描宽度 = 80 g;微波功率 = 19.9 mw;扫描总数 = 10;扫描时间 = 12.11秒;时间常数 = 20.48 毫秒。
2. 原264.7 细胞线粒体超氧化物的检测
   1. 在实验前一天按照步骤2.1.1 和2.1.2 将 raw 264.7 细胞播种。
   2. 取出培养基, 用1毫升的 khb 缓冲液清洗细胞一次。
   3. 在每口井加入含有 100μm dtpa 的 200μl khb。
   4. 加入5.3μl/井 9.5 mm-tempo-h 库存 (最终浓度 = 0.25 mm)
   5. 在 rt 孵化10分钟。
   6. 在乙醇中加入1μl/井, 在乙醇中加入5mm 的库存溶液 (最终浓度 = 25μm)。
   7. 在37°c 下, 在 co2 孵化器中孵育 50分钟 。
   8. 从孵化器中取出这些盘子, 并立即将其放置在冰上。
   9. 轻轻刮细胞, 通过上下移液重新暂停。继续冰上。
   10. 将样品装入毛细管。密封两端。
   11. 有关 epr 设置, 请参阅上一节。
3. 在 77 k 的 raw 264.7 细胞中检测超氧化物
   1. 将1.1.10 的步骤中收集的缓冲液放入事先准备好的 ptfe 管材中1-2 英寸长 ("od x" id)。确保 ptfe 管材是直的, 以便它可以很容易地插入和从手指脱手。使用橡胶塞子关闭 ptfe 管的一端, 将缓冲器或电池悬架 (100 至 150μl) 移液器插入 ptfe 管材, 并用第二塞子密封管。
   2. 闪存将样品冻结在液氮中。样品可以转移到贴有标签的冷冻保存管, 在-80°c 下储存或立即运行。
   3. 用液氮填充手指, 并将含有样品的 ptfe 管插入手指除战中。确保样品以谐振器的活动空间为中心, 并以 77 k 的速度运行 epr。
      注: 在测量前15-30 启动氮气流向光谱仪, 并在整个测量过程中继续这种流动, 以防止谐振器中的水凝结。
   4. 将 epr 采集参数设置为以下内容: 微波频率 = 9.65 ghz;中心场 = 3438 g;调制幅度 = 4.0 g;扫描宽度 = 150 g;微波功率 = 0.316 mw;扫描总数 = 10;扫描时间 = 60秒;和时间常数 = 1.28 ms。

3. 流体中的 epr 测量

1. 全血
   1. 治疗小鼠 (8-12) 的单剂量气管内白霉素 (bleo; 100μl 在 1 uml) 溶解在 pbs 或 pbs 单独如^{前面所述的 16,17}。
   2. 通过吸入异氟醚 (1.5-4%) 使小鼠安乐死, 然后进行失血过多和宫颈脱位。将血液通过右心室吸入涂有肝素 (1000 usp/ml) 的注射器, 其中含有 100μm dtpa, 并转移到 1.5 ml 管中。
   3. 在单独的 1.5 ml 管中, 将含有 100μm dtpa 和 3μl cmh (10 mm) 的 pbs 添加到132μl 血液中, 总体积为 150μl, 最终 cmh 浓度为 0.2 mm。
   4. 在37°c 的水浴中培养血液10分钟。
   5. 从水浴中取出管子。
   6. 在毛细管中加血, 并在 rt 运行 epr, 并具有以下 epr 采集参数: 微波频率 = 9.65 ghz;中心场 = 3432 g;调制幅度 = 1.0 g;扫描宽度 = 80 g;微波功率 = 19.9 mw;扫描总数 = 3;扫描时间 = 12.11秒;或者, 对于 77 k. epr 采集参数的测量, 可以按照步骤2.3 所述的方法对样品进行闪光冻结: 微波频率 = 9.65 ghz;中心场 = 3438 g;调制幅度 = 4.0 g;扫描宽度 = 150 g;微波功率 = 0.316 mw;扫描总数 = 2;扫描时间 = 60秒;和时间常数 = 1.28 ms。
2. 支气管肺泡灌洗液 (balf)
   1. 安乐死后 (见步骤 3.1.2),通过放置在气管中的插管, 在注射器中三次在注射器中缓慢注入和取出含有 100μm dtpa 的1毫升 pbs, 以收集 balf。
   2. 在 1.5 ml 管中, 用4μl 的 cmh (10 mm) 处理200μl 的 balf, 以获得 0.2 mm 的最终浓度。
   3. 在37°c 的水浴中培养 balf 50分钟。
   4. 把管子从水浴中取出, 放在冰上。
   5. 将 balf 装入毛细管, 并在 rt 运行 epr, 其 epr 设置与步骤1.1.13 中使用的 epr 相同, 或如步骤2.3 中所述的液氮闪存。
3. 血液和 balf 中的 epr 测量值为 77 k
   1. 按照上面的协议收集血液 (步骤 3.1.1 3.1.4) 和 balf (步骤 3.2.1 3.2.4)。
   2. 将经过治疗的血液或 balf 的150μl 放入 ptfe 导管 (1-2 英寸) 中。在添加样品之前, 使用橡胶塞子关闭 ptfe 管材的一端, 并使用另一个塞子密封管材。
   3. 闪存将样品冻结在液氮中。
   4. 有关在滤过聚四氟乙烯管材中使用手指 dewar 在 77-k. run 冷冻 cmh 处理血液样品的情况, 请参见第2.3 节。

4. 肺组织 epr 测量

1. 闪光冷冻肺组织
   1. 在3.2.1 步步收集了 balf 后, 胸部被打开, 肺部通过右心室用10毫升的冷 pbs 冲洗, 以去除血液。闪光冻结液氮中的肺组织。冷冻肺组织可在-80°c 下保存长达 6个月, 直到用于 epr 测量。
   2. 用推拿器稳定干冰上的肺组织, 用单刃刀片切割多个小块 (5-15 毫克) 的肺组织。
   3. 在 1.5 ml 管中称量组织, 将管放在刻度上并调整刻度, 然后添加组织块并记录重量。
   4. 在 1.5 ml 管的组织中, 加入196μl 含有 dtpa 的 khb 和4μl 的 cmh (0.2 mm), 以达到200μl 的总体积。
   5. 在37°c 的水浴中孵化1小时。
   6. 在 3, 884 x g 的微型离心机中向下旋转 (几秒钟)。
   7. 按照第2.3 节所述, 将上清液的顶纳剂放置在冰上和移液器 150μl, 并冻结 77 k 测量。
      注: 对于这种方法, 需要考虑损伤的异质性。对于博莱霉素引起的肺损伤, 考虑到这是一种高度异质性的损伤, 建议从每只小鼠身上从肺的不同部位切割几个组织块。或者, 可以在含有 100μm dtpa 的 khb 缓冲液中, 以1:6 的重量与体积比 (mgμμl) 同质化较大的组织, 如下所述。
2. 蔗糖缓冲液中保存的新鲜肺组织
   1. 用冷 pbs 冲洗灌洗的肺部, 以去除3.1.2 步调一致的血液。
   2. 使用带有玻璃或 ptfe 针的 d脾脏组织磨床, 将含有 0.25 m 蔗糖的 Tris-EDTA 缓冲液中的新鲜肺组织与 1:1 lug/p驻地 (mg/μl) 的比率进行同质化。
   3. 将50μl 的肺均质添加到含有 100μm dtpa 的 khb 的450μl 中。
   4. 在 1.5 ml 管 (总体积为 100μl) 中, 在 khb 中加入98μl 的肺均质, 加入10mm 库存的 2μl cmh, 最终浓度为 0.2 mm。
   5. 在水浴中沐浴 20分钟37°c。
   6. 将样品放在冰上, 装入毛细管。在 rt 运行 epr (步骤2.1.13 中使用的设置)。
   7. 为了测试使用不同抑制剂的特定种类和来源的贡献, 预处理88μl 的肺均质 +/抑制剂, 用 khb 进行调整, 以达到98μl 的最终体积。在本实验中, 抑制剂包括10μl 的 sod (100 u/ml)、4μl 的去氧胺 (dfo; 最终浓度 = 800μm) 或4μl 的氯化二苯并溴二苯二酮 (dip; 最终浓度 = 100μm)。在37°c 的水浴中孵化20分钟。
   8. 加入2μl 的 cmh, 在37°c 下再孵育 20分钟, 然后进行上述 epr 测量。包括一次性匹配的空白样品与 cmh khb 含有蔗糖缓冲液。或者, 将剩余的肺均质 (步骤 3.1.2) 的等价物存储在-80°c, 以便将来测量。
      注: 总体积可根据需要缩放。
3. 体内注射自旋探针小鼠肺组织的epr 测量 (在 rt 使用组织细胞)
   1. 在过滤脱氧的 50 mm 磷酸盐缓冲液中溶解4.9 毫克的 cph, 制备 cph 库存溶液。
   2. 用吸入异氟醚 (1.5-4%) 对小鼠进行20-30 的麻醉, 直到对脚趾夹紧没有反应。用100μl 的 cph 自旋探针通过后轨道路线注入小鼠25克小鼠体重 (最终剂量 = 20mg/2 kg), 并允许探针立即循环 1小时. 在眼眶注射后, 在眼睛区域上加入0.5% 的丙拉卡因 hcl, 以准备不是眼睛疼痛和干燥。监测小鼠 1小时, 并进行组织采集。
   3. 如上面所述, 采集肺组织, 并使肺部出现闪光冻结。
   4. 在干冰上切20-30 毫克的冷冻组织, 并记录确切的重量。
   5. 用清洁湿巾轻轻擦拭纸巾, 以吸收任何地表水。
   6. 将组织放置在组织细胞的窗口内 (附件允许组织样本的 epr 测量), 并运行 epr 以确定总旋转。这些数据可以表示为每毫克组织的总旋转。

5. 数据分析

1. 使用在台式 emxnano epr 光谱仪的 xenon 软件中集成的 spinfit 模块模拟 epr 光谱。通过自旋计数模块确定硝基苯的浓度。或者, 可以制作稳定的亚氮氧化物的校准曲线, 如 4-羟基 tempo 或 tempol, 并通过将信号强度与样品和标准进行比较来获得浓度。
2. 对于在 77 k 处收集的数据, 请使用双积分, 然后使用 spincount。

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结果

利用 x/xo 超氧化物生成系统验证了 cmh 的超氧化物检测, 证明 sod 完全抑制了亚氧化物(cm) 信号, 而过氧化氢酶无效应 (图 1a)。然后用细胞渗透 cmh 自旋探针 +/-sod 预处理培养细胞, 在 raw 264.7 细胞中对细胞外超氧化物进行评价。在细胞悬浮液和缓冲液中都测定了硝基氧化物浓度, 这表明由于自旋探针的渗透性和快速平衡性, 这两种样品类型的值相?...

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讨论

对生物环境中自由基产生的评估对于了解氧化还原调节的健康和疾病信号很重要, 但由于自由基物种和技术物种的半衰期很短, 这些物种的测量极具挑战性常用方法的限制。epr 是氧化还原生物学中一个有价值和强大的工具, 因为它是检测自由基的唯一明确的方法。在本项目中, 我们演示了设计实验和准备样品的实际 epr 方法, 以便在不同的细胞隔间和体内不同的组织隔间中使用自旋探针检?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	LifeTech	10566-016	cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)	Sigma Aldrich	D6518-5G
sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212	used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )	Fisher Scientific	BP363-500	used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )	Sigma Aldrich	P-5379	used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish
Krebs-Henseleit buffer (KHB)	(Alfa Aesar, Hill)	J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)	Sigma Aldrich	S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich	P1585-1MG	Dissolve in DMSO
Antimycin A (AA)	Sigma Aldrich	A8674-25MG	Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)	Enzo Life Sciences	ALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)	Enzo Life Sciences	ALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)	Enzo Life Sciences	ALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)	Enzo Life Sciences	ALX-430-131-M250
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride	Sigma Aldrich	43088
Deferoxamin mesylate salt	Sigma Aldrich	D9533-1G
Critoseal	Leica	39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark	Sigma Aldrich	708733	Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID	NORELL	1598774A	Teflon tubing
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR	NORELL	94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer	Bruker BioSpin GmbH	E7004002
EMX NANO TISSUE CELL	Bruker BioSpin GmbH	E7004542