利用病毒衍生系统在大肠杆菌中大规模生产圆形脚手架上的重组 rna

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 通过共同表达一个嵌合 rna, 其中包含对病毒性支架和植物 trna 连接酶感兴趣的 rna, 在大肠杆菌中产生大量的重组 rna。主要产品是一个圆形分子, 有利于纯化到均匀性。

摘要

随着人们对 rna 生物学的兴趣越来越大, 以及 rna 分子在复杂的生物技术应用中的应用, 产生大量重组 rna 的方法是有限的。在这里, 我们描述了一种在大肠杆菌中产生大量重组 rna 的协议, 该协议基于嵌合分子的共表达, 其中含有病毒性支架和植物 trna 连接酶中感兴趣的 rna。病毒是相对较小的, 非编码, 高度基成的圆形 rna, 具有传染性较高的植物。宿主植物 trna 连接酶是一种由属于avsunviroidae 家族的病毒体 (如茄子潜伏性病毒体 (elvd)) 所吸收的酶, 用于在病毒复制过程中介导 rna 循环。虽然 elvd 不在大肠杆菌中复制, 但 elvd 前体被大肠杆菌rna 聚合酶有效转录, 并由细菌细胞中嵌入的锤头核酶进行处理, 由此产生的单体由共表达的 trna 连接酶达到显著浓度。将感兴趣的 rna 插入 elvd 支架, 可在常规实验室条件下每升细菌培养产生数十毫克的重组 rna。rna 产物的一个主要部分是圆形的, 这一特性有助于将重组 rna 纯化到虚拟同质性。在该协议中 , 与感兴趣的 rna 相对应的互补 dna ( cdna ) 入到 elvd cdna 的特定位置 , 在表达质粒中被用来 , 沿着质粒共同表达茄子 trna 连接酶 , 来转化大肠杆菌。在强本构启动子的控制下, 这两种分子的共表达导致大量重组 rna 的产生。重组 rna 可以从细菌细胞中提取, 并利用其循环性从大量细菌 rna 中分离出来。

引言

与 dna 和蛋白质相比, 用于轻松、高效且经济高效地生产大量 rna 的协议并不丰富。然而, 研究和工业对这些生物分子的需求越来越大, 以研究其独特的生物特性¹, 或用于复杂的生物技术应用, 包括将其用作高度特异性的²、治疗剂³种, 或选择性农药⁴种。体外转录和化学合成是研究的常用, 以产生 rna。然而, 当需要大量产品时, 这些方法会带来重要的限制。合理的选择是使用活细胞的内源性转录机制, 然后是一个纯化过程, 将感兴趣的 rna 与细胞同伴分开。根据这一策略, 已经开发出在细菌细胞中产生重组 rna 的方法, 如实验室友好的大肠杆菌⁵或海洋紫色光养的α-α-天菌⁶. 在细菌中产生重组 rRNA 的大多数方法依赖于本地高度稳定的 rRNA 支架的表达, 如 rrna 或 rrna, 其中插入了^感兴趣的 rRNA 7。这就要求有必要释放嵌合分子感兴趣的 rna, 如果额外的 rna 的存在是下游应用的一个问题⁸。重组 rna 生物技术的另一个概念是生产重组核糖核酸蛋白复合物, 这些复合物本身可能是所需的产物,也可能被用作保护策略, 以提高感兴趣的 rna 的稳定性^{9, 10个}。同样, 还建议将生产圆形区域协定作为生产更稳定产品^{的战略 11}。

我们最近开发了一种新的方法来产生大肠杆菌中的大量重组 rna , 该方法参与了上述三个概念: 将感兴趣的 rna 插入一个高度稳定的圆形 rna 支架, 以及重组 rna 与相互作用的蛋白质, 很可能产生一个稳定的核糖核酸蛋白复合物, 积累在显着的数量在细菌细胞¹²。与之前的发展不同的是, 我们使用了一个与大肠杆菌完全陌生的 rna 支架, 即病毒。病毒是一种非常特殊类型的高等植物的传染因子, 完全由相对较小 (246-401 nt) 高度基对圆形 rna¹³组成。有趣的是, 病毒是非编码的 rna, 在没有自己蛋白质帮助的情况下, 它们能够在受感染的宿主^{14 中}完成复杂的感染周期。这些周期包括 rna-rna 在细胞核或叶绿体中的复制, 这取决于病毒科--分别是松足动物科或阿夫松弧虫科--通过受感染的植物移动和躲避宿主的防御反应。病毒必须被列为自然界中最稳定的 rna 之一, 因为它是一个赤裸的圆形 rna, 必须在植物感染细胞的恶劣环境中生存。这种特性可能使病毒体特别适合作为支架, 在生物技术方法中稳定重组 rna。此外, 新方法还基于病毒性支架与相互作用的植物蛋白的共表达。病毒通过滚动圈机制复制, 在这个机制中, 寄主酶被招募来催化这个过程的不同步骤。值得注意的是, 一些病毒, 更具体地说, 属于avsunviroidae 15家族的病毒体含有也参与复制的核酶。根据病毒种的不同, 病毒性 rna 的转录是由宿主 rna 聚合酶 ii 或氯塑核编码 rna 聚合酶 (nep) 介导的。病毒 rna 的处理似乎是由宿主 iii 型 rnase 催化的, 尽管在具有核酶寡聚 rna 的病毒中, 在复制过程中, 病毒的染色体是自裂的。最后, 所产生的病毒物单体是循环的, 这取决于病毒族, 由宿主 dna 连接酶1或氯乙烯基等形态的 trna 连接^{酶 16,17}。这最后一种酶参与了黄曲霉家族中病毒体单体形式的结扎, 如茄子潜伏性病毒(elvd)¹⁸。

在分析茄子 (solanum melongena l.) trna 连接酶识别的 elvd 序列和结构要求的过程中, 我们建立了一个基于大肠杆菌中两种分子共表达的实验系统¹⁹. 我们注意到, 在大肠杆菌细胞中, 通过嵌入的锤头核酶有效地自我裂解, 由此产生的病毒性单体具有 5 '-羟基和 2 ', 3 '-磷酸二酯末端。通过共表达的茄子 trna 连接酶有效地循环。更重要的是, 产生的圆形病毒 rna 在大肠杆菌中达到了意想不到的高浓度, 超过了内源性 rnas¹²。复制中间体的缺乏表明这些细菌细胞中缺乏 elvd rna-rna 扩增。有趣的是, 在病毒分子的特定位置插入异源 rna 对圆形病毒性 rna rna 12 的积累有一定的影响.这些观察使我们设想了一种在细菌中产生大量重组 rna 的方法。在这种方法中 , 与感兴趣的 rna 相对应的 cDNAs 入 elvd cDNAs 中 , 由此产生的嵌合 rna 通过一个强大的本构启动子在大肠杆菌中表达。为了使系统发挥作用,大肠杆菌必须与质粒共同转化, 以表达茄子 trna 连接酶。elv 衍生的比单位长的转录是由嵌入锤头核酶处理的, 所产生的具有适当终点的单体由共同表达的 trna 连接酶识别和循环。这样 , 感兴趣的 rna 入到一个非常稳定的圆形支架组成的病毒性圆形分子。这种重组嵌合 rna 很可能通过与 trna 连接酶的相互作用而形成核糖核酸蛋白复合物, 从而在大肠杆菌细胞内进一步稳定。使用这种方法 (见下面的协议), rna 适配体, 发夹 rna 和其他结构性 rna 已很容易地产生的数量达几十毫克每升大肠杆菌培养在正常的实验室条件下, 并纯化到同质化采取循环12的优点^.

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研究方案

1. 质粒结构

1. 通过 pcr (如果从 rna 模板开始, 通过逆转录酶 pcr) 放大与感兴趣的 rna 相对应的 cdna, 使用具有 5 ' 延伸的引物, 允许组装到表达质粒中。为避免不需要的突变, 请使用高保真 dna 聚合酶。
   1. 要在 gibson 组装20的表达质粒中插入cdna, 请在 pcr 引物中添加以下5个扩展: 前进, 5 '-tccccccccccccccctcctccttxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx3 ';反转, 5 '-cctcctaggacatgcctgxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 3 ';x 表示与感兴趣的 rna 末端同源的核苷酸。
   2. 在98°c 下孵化 30秒, 在98°c 时进行30次循环, 在98°c 时进行 30秒, 在55°c 时进行 30秒, 在72°c 下再孵化 30秒, 最后延长10分钟。
2. 在缓冲液 g (10 mm tris-hcl, ph 7.5, 10 mm 2, 50 mm mmmgcl 2, 50 mm nicl) 中, 在37°c 时, 在0.5μl 管中进行20μl 反应, 消化 100 ng plevd-bzb 型 iis限制酶bpi i 的 10 u, 时间为1小时, 0.1 mg/ml bsa)。
   请注意:所有质粒均可应要求提供给相应的作者。bpi我相当于bbs i。
3. 在 tae 缓冲液 (40 mm tis, 20 mm 乙酸, 1 mm edta, ph 7.2) 中, 用1% 琼脂糖凝胶电泳分离 pcr 和消化产物。在0.5μgml 溴化物的200毫升中晃动, 使凝胶染色15分钟。使用紫外线透射光点可视化 dna, 并使用手术刀切割与扩增 cdna 和bp i 消化质粒 (2046 bp) 相对应的带。
   请注意:bpi我消化的 plevd-bzb 也发布了 528 bp 产品对应的 lacz 蓝白记者。
4. 使用硅胶柱 (材料表中的凝胶 dna 回收试剂盒) 从凝胶片段中提取 dna 片段, 并通过分光光度法分析量化 dna 浓度。
5. 利用扩增的 cdna 和消化的质粒建立吉布森组装反应。使用3倍摩尔多余的插入与矢量²⁰. 在50°c 下孵化 1小时, 并使用硅胶柱 (材料表中的 dna 清洁和选矿器试剂盒) 对反应产物进行纯化。
6. 使用吉布森组装反应的纯化产物电孔合格大肠杆菌 dh5α 细胞。使用1毫米电穿孔试剂盒, 应用以下设置: 1, 500 v 和 5 ms. 在37°c 孵育1小时的超优化肉汤与分解石抑制 (soc; 20 g\ l 色氨酸, 5 g\ l 酵母提取物, 0.5 g\ l ncl, 2.5 mm kcl, 10 mm mgcl 2, 20 mm 葡萄糖, ph 7.0) 液体介质, 然后扩散到 luria-bertani (lb; 10 gl 色氨酸提取物, 5 g/l 酵母提取物, 10 g/l 氯化钠) 琼脂 (1.5%) 含有50μml 氨匹西林的板。
   1. 要筛选与可能含有插入物的转化大肠杆菌克隆相对应的菌落, 在电镀电穿孔细胞前 15分钟, 在电镀电穿孔细胞之前, 在中传播30μl 的 5-溴-4-氯-4-氯-β--d-半乳糖苷 (x-gal)。二甲基甲酰胺。在37°c 下连夜孵化板材。
7. 选择几个白色菌落, 在液体 lb 介质中在37°c 下生长过夜。使用迷你制备试剂盒 (见材料表) 纯化质粒, 并在 tae 缓冲液中使用1% 琼脂糖凝胶进行电泳分析其大小。
8. 选择最可能的重组质粒基于电泳迁移相比, 解与彼得拉维-bzb 控制。使用引物 5 '-cctttttattttatattatataga-3 ' 和 5 '-gatgggggggggggggggggggg-3 ', 在 pLELVd-BZB 中侧置表达盒, 通过测序确认选定质粒的序列。
   请注意:请记住, 这个质粒包含一个 528 bp 聚链接器与 lacz 标记, 被替换为 cdna 的利益。限制映射可能有助于选择正确的重组质粒。

2. rna 表达

1. 在一起电穿孔 (见条件 1.6) 所选择的大肠杆菌菌株 (大肠杆菌bl21 或 bl21 衍生物) 与 plevd-bzb 衍生物, 其中包含与感兴趣的 rna 和质粒 pLELVd-BZB-derivative 相对应的 cdna, 以共同表达茄子 trna 连接酶。使用缺乏 rnase iii 21 的大肠杆菌HT115(DE3) 来表示具有长双链区域的 rna。
   注: 感兴趣的 rna 和 trna 链附酶 mrna 均由大肠杆菌rna 聚合酶转录。大肠杆菌菌株不需要 de3 溶酶原来表达 t7 rna 聚合酶, 尽管这种溶菌素的存在不会产生有害影响。
2. 在 soc 液体培养基37°c 孵育1小时后, 板电穿孔细菌在 lb 固体培养基中含有50μgml 氨匹西林和34μgml 氯霉素。在37°c 下过夜。
3. 选择一个菌落, 用250毫升的液体非常强的干胶 (tb) 培养基 (12 gl 色氨酸) 接种1升的令人困惑的 erlenmeyer 烧瓶, 24 gl 酵母提取物, 0.4% 甘油, 0.17 m kh kh₂po 4, 0.17 m k2 hpo₄), 含有50μgml 安匹西林和34μgml 氯霉素。在37°c 下孵化, 以每分钟180转 (rpm) 的速度剧烈晃动。培养接种后收集12至16小时的细菌。

3. rna 的提取和纯化

1. 为便于分析, 在所需时间点取2毫升培养物, 在 14, 000 x克处离心机 2分钟, 将上清液丢弃, 并通过涡流将细胞重新悬浮在 50μl te 缓冲液中 (10 mm tris-hcl、ph 8.0 和 1 mL edta) 中。
   1. 加入 1: 1 (vv) 的一容量 (50μl) 的苯酚混合物 (加水饱和, 在 ph 值8.0 时与 Tris-HCl、ph 8.0 平衡) 和氯仿。通过剧烈的涡旋打破细胞, 并在 14, 000 x 克离心5分钟分离水和有机相.
   2. 仔细恢复含有总细菌 rna 的水相 (上部)。
      注意: 制剂可存放在-20°c, 以便随后进行分析。
2. 为制备目的, 将培养物倒入250毫升离心机瓶中, 以 14, 000 x克的速度将细胞旋转 10分钟, 去除上清液。在30毫升的水中重新悬浮, 清洗细胞。在相同的条件下, 转移到离心管并再次旋转细胞。
3. 通过涡流丢弃上清液, 并在色谱缓冲液的10毫升中重新悬浮细胞 (50 mm tris-hcl, ph 值 6.5, 150 mm 氯化钠, 0.2 mm edta)。
   请注意:此时, 细胞可以在-20°c 下冷冻, 以便在任何其他时刻进行纯化。
4. 使用新鲜或解冻的细菌制剂, 通过添加1体积 (10 毫升) 的苯酚来打破细胞: 氯仿 (见步骤 3.2) 和剧烈涡旋。
5. 在 12, 000 x 克的情况下离心 10分钟, 恢复水相, 并在相同条件下用1体积 (10 毫升) 的氯仿重新提取。
   请注意:此时 rna 制剂可储存在-20°c。
6. 进一步纯化细菌总 rna 的阴离子交换色谱法。通过45μm 注射器过滤器过滤 rna 制剂, 并在1毫升二乙基乙醇胺 (deae) 柱上加载。
   1. 对于色谱纯化, 请使用流量为 1 ml/min 的液相色谱系统。在样品加载之前, 用10毫升的色谱缓冲液对色谱柱进行平衡 (组合物见步骤 3.3)。
   2. 用10毫升的色谱缓冲液对样品进行加载和清洗。用20毫升洗脱缓冲液 (50 mm tris-hcl, ph 6.5, 1 m 氯化碳, 0.2 mm edta) 的洗脱 rna, 并收集1毫升的脂肪。
      注: rna 在初始分数中迅速磨损。该列可重复使用以进行进一步的纯化。为此, 用10毫升的水清洗柱, 并在20°c 的乙醇中储存。
7. 由于重组 rna 的主要部分以圆形形式在大肠杆菌中积累, 因此可以利用这种特性进行纯化, 使其达到均匀性¹²。通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2d page) 将非变性和变性 (8m 尿素) 条件^12、22分离圆形 rna。

4. rna 分析

1. 在 tbe 缓冲液 (89 mm tris, 89 mm 硼酸,2 mmedta) 中制备5% 聚丙烯酰胺凝胶 (37.1 丙烯酰胺: n, n '-甲基-甲基双酰丙烯酰胺, 质量比), 其中含有 8 m 尿素。
2. 将20μl 的 rna 制剂与1体积 (20μl) 的负载缓冲液 (98% 甲酰胺, 10 mm tris-hcl, ph 8.0, 1 mm edta, 0.0025% 溴酚蓝, 0.0025% 二甲苯氰醇), 在95°c 的加热块中孵育1.5 分, 并在冰上冷却。
3. 在聚丙烯酰胺凝胶中加载样品, 并根据凝胶尺寸在适当条件下运行电泳 (例如, 在 200 v 时运行 140 x 130 x 2 毫米凝胶2.5 小时)。在0.5μgml 溴化物中涂上15分钟的凝胶, 用水清洗, 并在紫外光下显示 rna。

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结果

为了利用 elvd 衍生系统12在大肠杆菌^中产生重组 rna, 将感兴趣的 rna 嫁接到 elvd rna 支架中。这种嵌合 rna 沿着大肠杆菌中的茄子 trna 连接酶共同表达。一旦加工、裂解和循环, 感兴趣的 rna 从其中突出的嵌合性圆形 rna, 很可能与共表达的茄子酶形成核糖核酸蛋白复合物, 在细菌细胞中达到显著的浓度 (图 1)。因此, 使用该?...

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讨论

在研究茄子 trna 连接酶识别所涉及的 elvd 序列和结构要求时, 我们注意到, 这两种分子在非宿主大肠杆菌中的共同表达导致了病毒性循环的意外大量积累在细菌细胞¹⁹形成。据我们了解,大肠杆菌中病毒性 rna 的大量积累很可能是共同表达高度稳定的 rna 分子的结果, 例如相对较小 (333 nt)、高度基成对的圆形病毒, 以及一种蛋白质。特定的病毒性表现出很高的亲和力。elvd...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Acetic acid	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Ethidium bromide	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel DNA Recovery	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Tryptone	Intron Biotechnology	Ba2014
Yeast extract	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Boric acid	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamide	PanReac AppliChem	A0937,2500
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine	Sigma-Aldrich	A4929-5G