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摘要

本文介绍了两种方法, 可以单独使用, 也可以结合使用, 分析β-淀粉样蛋白对纤维蛋白凝块结构的影响。其中包括一种用于创建体外纤维蛋白凝块的协议, 其次是血栓浊度和扫描电子显微镜方法。

摘要

本文介绍了用光谱法和扫描电镜 (sem) 法生成β-淀粉样蛋白 (aβ) 蛋白对凝块形成和结构的影响的体外纤维蛋白凝块的制备方法。aβ在阿尔茨海默氏症 (ad) 中形成神经毒性淀粉样聚集体, 已被证明与纤维蛋白原相互作用。这种 aβ-纤维蛋白原相互作用使纤维蛋白凝块结构异常, 对纤溶具有抵抗力。β诱导的纤维蛋白凝血异常也可能导致脑血管方面的 ad 病理, 如微梗塞, 炎症, 以及脑淀粉样血管病变 (caa)。鉴于神经血管缺陷在 ad 病理中的潜在关键作用, 开发能够抑制或减少 aca-纤维蛋白原相互作用的化合物具有很好的治疗价值。在体外的方法,其中纤维蛋白凝块的形成可以很容易和系统地评估是潜在的有用的工具, 开发治疗化合物。本文介绍了一种纤维蛋白凝块体外生成的优化方案, 以及 aβ和β-纤维蛋白原相互作用抑制剂的影响分析。凝块浊度检测快速、重现性高, 可用于同时检测多种条件, 从而可以筛选出大量的β纤维蛋白原抑制剂。可以进一步评估这种筛选产生的命中化合物是否能够使用 sem 改善光纤纤维蛋白凝块结构异常。使用 tdi-2760 (一种最近发现的抗逆转录酶原相互作用抑制剂) 在这里演示了这些优化方案的有效性。

引言

阿尔茨海默病 (ad) 是一种导致老年患者认知能力下降的神经退行性疾病, 主要源于β-淀粉样蛋白 (aβ) 的异常表达、聚集和清除障碍, 导致神经毒性1,2. 尽管 aβ集合体与 ad3之间存在良好的联系, 但疾病病理的确切机制尚不清楚4。越来越多的证据表明, 神经血管缺陷在 ad5的进展和严重程度中起着一定的作用, 因为 aβ与循环系统的组成部分直接相互作用。aβ与纤维蛋白原7,8有高亲和力的相互作用, 在 ad 患者和小鼠模型9,10,11中也定位到 aβ沉积。此外, β-纤维蛋白原相互作用诱导异常的纤维蛋白凝块形成和结构, 以及对纤维蛋白溶解的抵抗力9,12。治疗 ad 的一种治疗方法是通过抑制 aβ和纤维蛋白原13, 14 之间的相互作用来缓解循环缺陷。因此, 我们通过高通量筛选和药物化学方法 13, 14, 发现了几种抑制β纤维蛋白原相互作用的小化合物。为了测试光纤 b 系与原相互作用抑制剂的有效性, 我们优化了两种体外纤维蛋白凝块形成的分析方法: 凝块浊度分析和扫描电镜 (sem)14。

凝乳浊度测定是利用紫外可见光谱监测纤维蛋白凝块形成的一种直接快速的方法。随着纤维蛋白凝块的形成, 光线越来越分散, 溶液的浊度也在增加。相反, 当 aβ存在时, 纤维蛋白凝块的结构会改变, 混合物的浊度会降低 (图 1)。抑制化合物的效果可以评估的可能性, 以恢复凝块浊度从β诱导的异常。虽然浊度分析可以快速分析多种条件, 但它提供的关于凝块形状和结构的信息有限。sem, 其中固体物体的地形是由电子探针揭示, 允许分析的三维结构的凝块15,16, 17,18, 并评估如何存在的 aβ和/或抑制化合物改变结构9,14。光谱法和扫描电镜都是经典的实验室技术, 已被用于各种目的, 例如, 分光光度法用于监测淀粉样蛋白聚集19,20。同样, sem 也被用来分析由阿尔茨海默氏症、帕金森病和血栓栓塞中风 21、22、23 例患者的血浆形成的纤维蛋白凝块。这里介绍的协议是优化评估纤维蛋白凝块形成的重现性和快速的方式。

下面的协议提供了在有和没有 aβ的体外纤维蛋白凝块的制备说明。详细介绍了 aβ对纤维蛋白凝块形成和结构影响的分析方法。这两种方法测量抗β纤维蛋白原相互作用的有效性已证明使用 tdi-2760, 一种小型抑制化合物 14.这些方法, 无论是单独和共同, 允许快速和直接的分析体外纤维蛋白凝块的形成。

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研究方案

1. 用于分析的 aβ42和纤维蛋白原的制备

  1. 从冻干粉制备单分子 aβ42
    1. 将 aβ42粉末加热至室温, 并在 1500 x 克的温度下旋转30秒。
    2. 每0.5 毫克 aβ42粉末加入100μl 冰凉六氟异丙醇 (hfip), 并在冰上孵育30分钟。
      注意: 在处理 hfip 时要小心, 并在化学罩中执行所有步骤。
    3. 准备20μl 的等价物, 让薄膜在化学罩中干燥 2-3小时, 薄膜可以储存在-20°c。
    4. 在10μl 新鲜二甲基亚硫酸 (dmso) 中, 在浴洗器中搅拌 10分钟, 在室温下重新制备单基因 aβ42膜。
    5. 加入190μl 的 50 mm tris (羟基甲基) 氨基甲烷 (tris) 缓冲液 (ph 7.4), 并轻轻向上和向下移液器。
    6. 在20°c 时离心 20分钟, 以 20 817 x 克的速度去除蛋白质集合体。
    7. 在4°c 下, 在4°c 下将上清液中培养一夜, 并在4°c 下离心溶液, 时间为 20 817 x 克, 20分钟, 以丢弃任何进一步的蛋白质集合体。
    8. 用双氯酸 (bca) 法测定 aβ42浓度。从 1 mgl 到 0.0625 mg/ml 连续稀释纯化牛血清白蛋白 (bsa), 以产生蛋白质标准, 在多井板的井中加入 10μl, 一式三份。稀释 aβ样品 1:4, 并在井中加入10μl 一式三份。混合 bca 溶液 a 和 b, 并在每口井中添加200μl。在37°c 下孵化 30分钟, 在 562 nm 的板读取器上阅读。将剩余的 aβ溶液保存在冰上, 并使用该制剂进行浊度测定和扫描电镜分析。
  2. 制备纤维蛋白原溶液
    1. 测量20毫克冻干纤维蛋白原粉末到15毫升管, 并与预热2毫升 20 mm 羟基乙基哌嗪乙烷磺酸 (hepes) 缓冲液 (ph 7.4) 重新悬浮。
    2. 在37°c 的水浴中沐浴10分钟。
    3. 通过0.2μm 注射器过滤器过滤溶液, 并在4°c 下存储30分钟。从4°c 取出溶液, 然后通过0.1μm 注射器过滤器再次过滤, 以去除纤维蛋白原集体或已有的纤维蛋白。
    4. 用 bca 法测定纤维蛋白原浓度。按照步骤1.1.8 中的说明进行操作。将剩余的纤维蛋白原溶液保持在 4°c, 并使用这种制剂进行浊度分析和扫描电镜。

2. clot 浊度检测

  1. 在96孔板的每个实验井上, 从步进1.1.8 加入 20μl 30μm aβ42溶液, 使其最终浓度在200μl 的缓冲液中达到3.0μm。在 50 mm tris 缓冲液 (ph 7.4) 中添加相同体积的 5% dmso, 以缓冲96孔板中的控制井。
    注: 此步骤中 aβ42的确切体积并不重要。对于低浓度制剂, 可以使用较高的体积, 也可以调整凝块形成缓冲液的体积。最终体积应保持200μl。
  2. 如果测试抑制化合物, 将该化合物稀释为 dmso 的工作浓度。单独加入化合物或 dmso, 以便在 aβ42的井中进行控制, 并充分混合。
    注: aβ42溶液应在井底形成一个离散的液滴, 化合物或 dmso 应直接移入液滴的中心。
  3. 将纤溶剂从步骤1.2.4 在凝块形成缓冲液 (20 mm hepes 缓冲液 (ph 7.4)、5 mm cacl2和 137 mm nacl) 中稀释纤维蛋白原库存溶液, 并将其添加到包含和控制96孔板井的 aβ42中。调整纤维蛋白原溶液的体积, 使其最终浓度在总200μl 反应体积中变为1.5μm。缓慢地移液, 避免形成气泡。在室温下在旋转平台上将板材孵化30分钟晃动。
    注: 纤维蛋白原溶液的体积可能因其库存浓度而异, 但在孵育过程中, 每口井的总体积应为170μl。
  4. 通过将商业纯化的凝血酶溶解在 ddh2o中制备凝血酶溶液, 制成 50 u/ml 的库存溶液。在使用前, 直接在 20 mm hepes 缓冲液 (ph 7.4) 中稀释到 5 uml 工作溶液中。
  5. 孵育30分钟后, 使用多通道移液器, 在步骤2.3 的96孔板的纤维蛋白原溶液中同时加入30μl 凝血酶溶液 (5 ucyml)。添加凝血酶将立即启动凝块形成。因此, 请小心地将凝血酶直接添加到纤维蛋白原溶液的中心, 以避免形成气泡。
    注: 凝血酶的活性可能因实验条件以及凝血酶批次而异。坚固生产凝块所需的正确浓度可能需要根据经验来确定。
  6. 在凝血酶添加后立即阅读板阅读器上体外凝块的吸收率。在10分钟的时间内测量350纳米的吸收率, 每30-60 次. 在室温下进行整个测定。
    注: 某些抑制剂化合物可能会在 350 nm 时改变溶液吸收率, 在这种情况下, 浊度可以测量到 405 nm。

3. 扫描电子显微镜

  1. 凝块的制备、固定和洗涤
    1. 使用钳子将干净的硅化玻璃圆盖块 (12 毫米) 放入12孔或24孔板。
    2. 在凝块形成缓冲液中制备纤维蛋白原。有关详细信息, 请参阅协议步骤1.2。
    3. 为了评价 aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂对纤维蛋白凝块结构的影响, 请按照浊度测定 (步骤 2) 所述的孵育说明进行。在没有β和抑制剂的情况下, 始终包括含有纤维蛋白原的控制井。
    4. 移液器80μl 的纤维蛋白原混合从步骤3.1.3 在盖板上。轻轻地分布解决方案, 使其均匀地分布在封面幻灯片上。
    5. 将凝血酶库存 (50 u/ml) 稀释成 20 mm hepes 缓冲盐水, 最终浓度为 2.5 u/ml, 并在不混合的情况下直接向纤维蛋白原溶液的中心添加20μl。
      注: 如有需要, 可使用较高的凝血酶工作浓度 (5 u\ ml)。
    6. 用塑料盖覆盖12孔板, 并在室温下放置30-60。
    7. 凝血反应正在进行时, 准备脱水和固定溶液。制备仙人掌酸钠缓冲液 (0.1 m, ph 7.4)。在仙人掌酸钠缓冲液 (0.1 m, ph 7.4) 中稀释10% 的戊二醛库存溶液, 使2% 的工作溶液戊二醛。把所有这些解决方案都放在冰上。新鲜稀释的戊二醛 (2%) 应在1周内使用, 如果在4°c 的冰箱中适当储存。
    8. 在双蒸馏水中稀释绝对乙醇 (100%) (80%、50% 和20% 乙醇)。将这些乙醇溶液和绝对乙醇 (100%) 放在冰上。
      注意: 在处理仙人掌酸钠和戊二醛时, 请小心, 在化学罩中执行这些步骤。
    9. 30分钟后, 用冰凉的仙人掌酸钠缓冲液 (0.1 m) 轻轻清洗两次凝块。在每个井中添加2毫升的缓冲液, 使凝块完全淹没。盖上盖子, 在室温下放置2分钟。2分钟后, 使用1毫升移液器或窄阀杆转移移液器轻轻取出缓冲液。重复一次。
    10. 用冰凉戊二醛 (2%) 固定凝块。将井板放在冰上, 在每口井中加入约2-3 毫升的2% 戊二醛。确保凝块完全被淹没。盖上盖子, 把盘子放在冰上30分钟。
    11. 30分钟后, 轻轻地从每口井中取出戊二醛, 并使用上面所述的仙人掌酸钠缓冲液 (0.1 m) 清洗凝块 (2分钟, 两次)。把井盘放在冰上。
  2. 凝块的连续脱水与临界点干燥
    1. 在步骤 3.1.8 (20%、50%、80%、100% 和再 100%) 中制备的一系列分级冷乙醇洗涤中, 将凝块脱水5分钟。对于每个乙醇系列, 加入2-3 毫升, 确保凝块被淹没。覆盖并在冰上孵育。
    2. 每次乙醇步骤后, 使用1毫升移液器或一次性滴管器去除乙醇溶液。不要完全去除乙醇。确保血块表面不暴露在空气中。
      注: 绝对乙醇脱水 (100%) 应进行两次。
    3. 在将样品淹没在最终100% 乙醇中的同时, 转移到关键点干燥机 (cpd)。使用带垫圈的 cpd 样品支架或盖滑架将滑块转移到 cpd 室。在每张幻灯片之间放置至少一个垫圈。
    4. 从 cpd 室取出盖板, 并使用碳带将其安装在 sem 存根上。
  3. 喷射器涂层和成像
    1. 将所有样品与 sem 存根转移到溅射涂层室。
    2. 溅射涂层小于20纳米的金/钯或其他导电材料, 如碳, 使用真空溅射涂布机。
      注: 我们已经使用了18纳米的金/钯涂层。溅射涂层进行了 45秒, 涂层速度为 4/s, 溅射涂层样品在室温干燥的环境中适当保存几个星期, 是稳定的。sem 分析可随时进行。
    3. 在配备 se2 探测器的扫描电子显微镜上获取图像, 时间为4kv。
      请注意:此图像集中的图像像素大小范围为 13 nm-nm。

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结果

在体外凝血 (浊度) 检测中, 酶凝血酶裂解纤维蛋白原, 导致纤维蛋白网络24的形成。这种纤维蛋白凝块的形成会导致通过溶液的光的散射, 导致浊度增加 (图 1), 在读数周期结束前形成 (图 2, 绿色)。当纤维蛋白原在 aβ42存在下孵育时, 溶液的浊度下降, 曲线的最大高度约为纤维蛋白原的一半 (

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讨论

这里描述的方法为纤维蛋白凝块体外形成的评估提供了一种可重复和快速的方法。此外, 该系统的简单性使得对 aβ如何影响纤维蛋白凝块形成和结构的解释相对直接。在本实验室的前一份出版物中, 证明了这些检测方法可用于测试化合物抑制 ab-纤维蛋白原相互作用的能力 13,14。利用这两种方法, 分析了一系列合成化合物抑制β纤维蛋白原相互作用?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者感谢纽约三机构治疗发现研究所 (tdi) 的川崎正森、麻岛一郎和迈克尔·福利合成了 acam 纤维蛋白原相互作用抑制剂及其宝贵的建议。作者还感谢斯特里克兰德实验室的成员进行了有益的讨论。这项工作得到了国家卫生研究院批准 ns104386, 阿尔茨海默氏药物发现基金会和罗伯逊治疗发展基金 h. a., nih 授予 ns50537, 三机构治疗发现研究所, 阿尔茨海默氏症药物发现基金会,rudin 家庭基金会和 john a. herrmann 为 s. s。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Fibriogen, Plasminogen-Depleted, PlasmaEMD Millipore341578keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture
Beta-Amyloid (1-42), HumanAnaspecAS-20276
Thrombin from human plasmaSigma-AldrichT7009
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%Sigma-Aldrich105228
DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTEREDSigma-AldrichD2438
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Tris BaseFischer ScientificBP152
HEPESFischer ScientificBP310
NaClFischer ScientificS271
CaCl2Fischer ScientificC70
Filter Syringe, 0.2µM, 25mmPall4612
Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.MilliporeSLVV033RS
Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat BottomFischer Scientific21377203
Spectramax Plus384Molecular Devices89212-396
Centrifuge, 5417REppendorf5417R
Branson 200 Ultrasonic CleanerFischer Scientific15-337-22
Lab RotatorThermo Scientific2314-1CEQ
Spare washers for cover slip holderTousimis8766-01
Narrow Stem Pipets - Sedi-PetElectron Microscopy Sciences (EMS)70967-13
Sample holder for CPD (Cover slip holder)Tousimis8766
Mount Holder Box, Pin TypeElectron Microscopy Sciences (EMS)76610
Round glass cover slides (12 mm)Hampton ResearchHR3-277
10% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences (EMS)16120
EthanolDecon Labs11652
24 well plateFalcon3047
Na CacodylateElectron Microscopy Sciences (EMS)11652
SEM Stubs, Tapered end pin.Electron Microscopy Sciences (EMS)75192
PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm ODTed Pella16084-1
Autosamdri-815 Critical Point DryerTousimis
Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium targetDenton Vacuum
Leo 1550 FE-SEMCarl Zeiss
Smart SEM SoftwareCarl Zeiss

参考文献

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