发展中雏鸡光学顶盖中切向细胞迁移的可视化

摘要

我们描述了通过电穿孔荧光标记切向迁移细胞的方法, 以及在扁平支架培养中标记细胞运动的延时成像, 以可视化发展中的小鸡光学顶盖的迁移细胞行为。.

摘要

延时成像是分析迁移细胞行为的有力方法。荧光细胞标记后, 可在影像显微镜下记录培养中标记细胞的运动。为了分析发育中大脑中的细胞迁移, 切片培养通常用于观察与切片部分平行的细胞迁移, 如径向细胞迁移。但是, 可以从切片区域性方法获得有限信息, 以分析垂直于切片部分的单元迁移, 如切线单元迁移。在这里, 我们提出了延时成像的协议, 用于可视化发展中的小鸡光学顶盖中的切向细胞迁移。通过电穿孔蛋细胞标记的组合以及细胞培养插入物上的随后的扁平安装培养, 可以检测水平平面中的迁移细胞运动。此外, 我们的方法有助于检测单个细胞的行为和一组细胞在长期的集体行动。该方法可用于检测荧光标记微结构的序列变化, 包括非神经组织中神经组织或细胞移位的轴突伸长。

引言

随着实时成像技术的进步, 细胞迁移研究也在不断发展。荧光细胞标记后, 在培养皿或体内标记细胞的时间运动可以记录在视频显微镜下。在神经发育研究中, 采用时移成像技术分析了移植细胞或伸长轴突的形态学变化。为了有效的成像, 在实验和分析的目的基础上, 应用合适的荧光细胞标记和组织制备方法是非常必要的。为了分析发育中大脑中的细胞迁移, 切片培养通常用于观察与切片部分平行的细胞迁移, 如径向细胞迁移^1、2、3。切片培养系统也用于检测切向细胞迁移^4,5, 但它不适合定向分析的情况下, 细胞分散垂直于切片部分。

光学顶盖由在胚胎发育过程中由径向和切向细胞迁移形成的多层结构组成。顶盖层的形成主要依赖于心室区分裂后神经元前体细胞的径向迁移, 其最终终点与心室区⁶的出生日期相关。对于切向迁移, 我们以前报告了发展中的小鸡光学顶盖中和表层的两个迁移流。在 E6-E8 期间的中层层中, 具有长前导过程和薄尾随过程的双极性细胞迁移背或腹侧沿顶盖传出轴突束运行手背-腹侧⁷。在 axophilic 迁移后, 细胞分化为位于深层的多极神经元。在 E7-E14 的表层层中, 迁移细胞通过重整分枝前导过程并分散到多个方向⁸, 水平离散。在分散迁移后, 后体细胞最终分化为各种形态的表面神经元。在这两种情况下, 平板式培养都能有效观察与软脑膜表面平行的细胞运动。

在这里, 我们提出了一个延时成像协议, 用于可视化发展中的小鸡光学顶盖^7,8中的切向细胞迁移。在蛋中通过电穿孔将细胞标记结合在一起, 然后在细胞培养插入物上进行扁平安装培养, 可以检测迁移的细胞移动和迁移方向。该方法的目的是促进检测在长期的单个细胞行为和一组细胞在水平平面的集体行动。

研究方案

1。蛋电穿孔

1. 制备高浓度荧光标记的表达质粒 DNA。根据制造商的协议 (材料表), 使用阴离子交换柱的碱性裂解法分离200毫升细菌培养物中的 DNA。混合 pCAGGS-EGFP 和 pCAGGS-mCherryNuc 在最终浓度为4µg/µL 每个。
   注: 无内毒素质粒 DNA 纯化可能是电穿孔的首选。
2. 在70% 相对湿度下, 在38摄氏度水平下孵化出肥沃的鸡卵。
3. 2.5 天后, 使用20毫升注射器与18针, 并用胶带密封针头孔, 从卵子的尖头上消除5毫升蛋白 (蛋清)。
4. 用弯曲的剪刀切开蛋壳的顶端, 开一个直径2厘米的洞, 检查体视显微镜下胚胎的发育阶段 (汉堡包和汉密尔顿⁹的阶段 17)。用胶带封住孔。
   注意: 此步骤可在 E2.5 E3.0 期间的任何时间执行。步骤1.3 和1.4 降低卵子中胚胎的水平, 以避免将生长的胚胎和血管紧密附着到顶部壳体上。
5. 继续孵育直到 E5.5。
6. 在电穿孔前, 准备10µL 所述质粒 DNA 染色与0.5 µL 的快速绿色 (25 毫克/毫升), 10 毫升蒸压磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 含有青霉素 (100 单位/毫升) 和链霉素 (100 微克/毫升), 和微由使用微量吸管处理器的玻璃毛细管管。切断微量吸管的远端尖端, 根据注射的 DNA 量, 使合适的孔隙大小。
7. 用剪刀切开密封的顶壳, 重新打开直径2.5 厘米的孔, 并在立体显微镜下稳定地设置鸡蛋。在鸡蛋中加入几滴 PBS。用两个细钳剥离尿囊膜覆盖胚胎而不出血。从胚胎的头部取出羊膜。
8. 在用 microspatula 转动头部时, 用微量吸管连接到吸入管, 将彩色 DNA 的 0.1-1 微升注入左侧光学顶盖的心室腔内。
   注: 注射的 DNA 量取决于实验的目的。浓缩 DNA 溶液应沿着心室壁下沉和附着。
9. 放置一对 forcep 型电极 (3 mm 方形电极, 距离为 7 mm), 使光学 tectumis 的目标区域介于 (图 1、步骤 1) 之间。
   注意: DNA 转到阳极侧。
10. 使用脉冲发生器将 30 V、1 ms 的预脉冲充电为 5 ms 间隔, 四个后续脉冲为 6 V、5 ms 和 10 ms 间隔。
    注: 电子条件取决于电极的尺寸和距离。它应该足够强大, 以实现有效的转染, 但它必须足够谦虚, 以确保目标组织的正常发展。
11. 用胶带封住孔, 继续孵育。在 PBS 中浸泡电极, 用塑料碟中的齿间刷去除蛋白。每个鸡蛋重复 1.7-1.11。

2. 单元格插入上的扁平安装培养

1. 在平贴培养前的某一天, 准备涂覆细胞培养刀片。在10厘米细胞培养皿中, 在蒸压蒸馏水上漂浮一些细胞培养液。加载8µg/毫升层粘连蛋白和80µg/毫升聚 l-赖氨酸的溶液, 以覆盖插入物, 并将漂浮的插入在细胞培养 CO₂孵化器在37摄氏度过夜。
   注意: 在第二天, 涂层刀片可以存储在4摄氏度。
2. 在 E7.0 的文化之日, 从插入物中除去层粘连蛋白-聚 l-赖氨酸溶液, 将刀片放入玻璃底盘 (图 1、步骤 2), 填充1.1 毫升培养基 (60% 减少血清培养基、20% F12、10% 胎牛血清、10% 小鸡血清, 50 单位/毫升青霉素, 50 微克/毫升链霉素)。保持皿在细胞培养 CO₂孵化器在37摄氏度。
   注: 培养基可在整个文化期内使用三天, 无变化。
3. 准备区域性设置。在 40% O₂和 5% CO₂ (气体控制器) 的气体流量在38摄氏度 (温度控制器) 的倒置共聚焦显微镜上设置湿润室单位。
4. 用剪刀砍掉胚胎的头部。用镊子将头夹在6厘米细胞培养皿中, 放入冰冷的汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 中。
5. 使用两个细镊子隔离转光学顶盖。将顶盖与塑料滴管转移到另一盘充满冰冷 HBSS 的盘子里。使用以黑色硅为凹的玻璃盘作为切碟。
6. 检查荧光立体显微镜下标签的位置。用显微外科刀切开周围贴标区域的顶盖组织。确保顶盖 (前后方, 背腹) 组织的方向。
7. 将带有塑料滴管的标记组织转移到刀片上, 使 pia 侧附着在刀片上。将顶盖组织放置在所需的方向, 并去除多余的 HBSS (图 1, 步骤 2)。
8. 重复 2.4-2.7 为了准备在同一插入的其他组织。将盘子放在预热室中的倒置共聚焦显微镜中 (图 1, 步骤 3)。

3. 延时成像

1. 检查荧光标记, 并将显微镜聚焦在倒置共聚焦显微镜中。启动激光共聚焦单元, 并尝试采样共焦扫描, 以调整沿 X 和 Y 轴的组织方向和位置。使用10X 或20X 物镜, 无需浸泡油。
2. 选择扫描大小 (例如512x512 dpi)。确定沿 z 轴的共焦扫描的间隔和总范围。为100µm 范围采取5或10µm 间隔。确定共聚焦成像的时间间隔和总成像持续时间 (例如, 10 分钟间隔超过48小时)。
   注意: 为了避免激光光毒性, 请禁止在高扫描尺寸下扫描, 在长 z 范围内使用短 z 间隔, 或在长成像持续时间内缩短时间间隔。例如, 在应用高扫描大小 (例如1024x1024 dpi) 时, 减少沿 z 轴的扫描次数。
3. 设置3.2 中描述的共焦运行程序的参数并开始成像。
4. 成像后, 在不同的 z 轴上组合共焦图像, 在每个时间点提供 z 栈图像, 并进行精细焦距调整。
5. 在不同的时间点追加 z 堆栈图像, 并以 AVI 格式构建延时电影。

结果

图 2显示了在记录开始后, 在经过一段时间 (0、9、18、27 h) 的平面安装培养中可视化的表面切向偏移。电影1是一段10分钟的延时电影, 间隔时间为28小时和50分钟。选择该框架的目的是聚焦从帧的左下角到未标记空间的迁移单元格 (图 3A)。迁移细胞 (GFP; 左上面板,电影 1) 及其原子?...

讨论

上述协议针对浅层^6、8中的细胞迁移进行了优化。它适用于检测中间层迁移流 (电影 5)^6,7, 只是通过改变电穿孔的时间 (E5.5 到 E4.5) 和文化和成像的起始 (E7.0 到 E6.0)。

所提出的程序由蛋、扁平安装培养和时移共聚焦成像 (图 1)中的电穿?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe	TERUMO	SS-20ESZ
18 gauge needle	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
glass capillary tube	Narishige	G-1
cell culture insert	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	coating of culture insert
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	coating of culture insert
glass bottom dish	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	culture medium
F12	Gibco	11765-054	culture medium
fetal bovine serum	Gibco	12483	culture medium
chick serum	Gibco	16110082	culture medium
10xHBSS	Gibco	14065-056
microsurgical knife	Surgical specialties cooperation	72-1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
curved scissors	AS ONE	No.11
micropipette processor	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
forceps-type electrode	BEX	LF646P3x3
pulse generator	BEX	CUY21EX	electroporator
fluorescence stereoscopic microscope	Leica	MZ16F
inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
gas controller	Tokken	MIGM/OL-2
temperature controller	Tokai Hit	MI-IBC
laser confocal unit	Olympus	FV300