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摘要

本研究描述了一种斑马鱼胚胎模型, 用于基于荧光显微镜的生物物质相关感染的体内可视化和体内分析。该模型是一个很有前途的系统, 补充哺乳动物动物模型, 如研究体内生物材料相关感染的小鼠模型。

摘要

生物材料相关感染 (bai) 是生物技术/医疗器械失效的主要原因。金黄色葡萄球菌是 bai 的主要病原菌之一。目前实验的 bai 哺乳动物动物模型, 如小鼠模型, 成本昂贵, 耗时, 因此不适合高吞吐量分析。因此, 需要新的动物模型作为体内调查 bai 的补充系统。在本研究中, 我们的目标是开发一个斑马鱼胚胎模型, 用于基于荧光显微镜的生物材料存在下细菌感染的体内可视化和体内分析。此外, 还研究了引发的巨噬细胞反应。为此, 我们使用荧光蛋白表达金黄色葡萄球菌和转基因斑马鱼胚胎, 在巨噬细胞中表达荧光蛋白, 并开发了一种单独或与微球一起向肌肉注射细菌的程序胚胎组织。为了监测细菌感染的进展, 随着时间的推移, 我们设计了一个简单而可靠的方法, 显微镜评分荧光细菌。显微镜评分结果表明, 所有具有20多个菌落形成单位 (cfu) 细菌的胚胎都能产生细菌的阳性荧光信号。为了研究生物材料对感染的潜在影响, 我们确定了具有和不具有10μm 聚苯乙烯微球 (ps10) 的金黄色葡萄球菌的 cfu 数, 作为胚胎中的生物材料模型. 此外, 我们使用在 imagej 中运行的 objectj 项目文件 "zbrafan-vapoest" 来量化随着时间的推移有和没有 ps10 的金黄色葡萄球菌感染的荧光强度。这两种方法的结果表明, 在微球感染的胚胎中, 金黄色葡萄球菌的数量高于在没有微球的胚胎中, 这表明在生物材料存在的情况下, 感染易感性增加。因此, 本研究表明斑马鱼胚胎模型在研究 bai 方面具有应用本文所开发的方法的潜力。

引言

各种医疗设备 (称为 "生物材料") 越来越多地用于现代医学, 以恢复或取代人体部位 1.然而, 生物材料的植入使患者容易感染, 称为生物材料相关感染 (bai), 这是手术中植入物的主要并发症。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是两个最常见的细菌物种, 负责 bai2,3,4,5,6。植入的生物材料形成了一个表面容易受到细菌生物膜形成的影响。此外, 植入的生物材料可能会使局部免疫反应出轨, 导致细菌清除效果降低。感染细菌的初始清除主要是通过浸润中性粒细胞进行的, 中性粒细胞在植入或植入的生物材料7的存在下, 这些中性粒细胞的杀菌能力大大降低。此外, 巨噬细胞在中性粒细胞最初的涌入后渗入组织, 会吞噬剩余的细菌, 但不能有效地杀死它们的内部, 由于疯狂的免疫信号, 这是一个综合存在的结果生物材料和细菌8。因此, 生物材料的存在可以促进细菌在细胞内生存 9,10,11,12,13和生物膜形成的植入物生物材料4,14。因此, bai 可能导致无法和需要更换植入的生物材料, 导致发病率和死亡率上升, 住院时间延长, 额外费用2,15.

目前正在制定越来越多的反审调处战略 2、16、17。在体内评估这些策略在相关动物模型中的有效性是必不可少的。然而, 传统的实验 bai 动物模型 (例如,小鼠模型) 通常成本高昂、耗时长, 因此不适合多种策略的高吞吐量测试18。基于生物光学的生物光学成像技术的最新发展--宿主细胞和细菌荧光标记可能使单个小动物能够持续监测 bai 进展和宿主-病原体-材料相互作用例如小鼠18、19、20、21.然而, 这种技术相对复杂, 尚处于起步阶段, 对 bai18 进行定量分析必须解决几个问题。例如, 需要高挑战剂量来显示细菌的定植。此外, 还必须解决在哺乳动物试验动物组织中的光散射和生物发光荧光信号的吸附问题.因此, 新的、经济高效的动物模型, 允许随着时间的推移进行体内可视化和定量分析, 是在体内研究 bai 的宝贵补充系统。

斑马鱼 (胚胎) 已被用作一种多功能的体内工具, 用于解剖宿主-病原体相互作用和几种细菌的感染发病机制, 如22分枝杆菌,铜绿假单胞菌23, 大肠杆菌24例,粪便肠球菌25例, 葡萄球菌26、27例。斑马鱼胚胎具有许多优点, 如光学透明度、相对较低的维护成本以及拥有与哺乳动物高度相似的免疫系统 28, 29.这使得斑马鱼胚胎成为一个高度经济、有生命的生物, 用于对感染进展和相关宿主反应进行体内可视化和分析 28,29.为了使细胞在体内的行为可视化, 转基因斑马鱼系具有不同类型的免疫细胞 (如巨噬细胞和中性粒细胞), 甚至具有荧光标记的亚细胞结构. ,29。此外, 斑马鱼的高繁殖率提供了开发高吞吐量测试系统的可能性, 该系统具有自动机器人注射、自动荧光定量和 rna 序列分析27的特点,30岁.

在本研究中, 我们的目标是开发一个斑马鱼胚胎模型的生物材料相关感染使用荧光成像技术。为此, 我们开发了一种在生物材料微球存在的情况下将细菌 (金黄色葡萄球菌) 注入斑马鱼胚胎肌肉组织的程序。我们使用金黄色葡萄球菌rn4220 表达 mcherry 荧光蛋白 (s. aureus-mcherry), 如其他地方所描述的另一种金黄色葡萄球菌菌株10,31。采用转基因斑马鱼系 (mpeg1:uas变为 kaede), 在巨噬细胞32和蓝色荧光聚苯乙烯微球中表达了 kaede 绿色荧光蛋白。在之前的一项研究中, 我们已经证明, 肌肉注射微球到斑马鱼胚胎, 以模仿生物材料植入是可行的33。为了定量分析 bai 的进展和相关细胞浸润在单个胚胎随着时间的推移, 我们使用了 "zobravies-vantest" 项目文件, 该文件在 "objectj" (imagej 的插件) 中操作, 以量化的荧光强度细菌居住和巨噬细胞浸润在微球注射部位附近 33.此外, 我们还确定了胚胎中存在和不存在微球的菌落形成单位 (cfu) 的数量, 以研究生物材料对感染的潜在影响。我们目前的研究表明, 随着这里开发的方法, 斑马鱼胚胎是一个有前途的, 新的脊椎动物模型, 用于研究体内生物技术相关感染。

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研究方案

在该议定书中, 维持成年斑马鱼符合当地动物福利委员会批准的当地动物福利条例。胚胎实验是根据 201/63/欧盟指令进行的。

1. "仅细菌" 和细菌微球悬浮液的制备

请注意:采用表达mcherry荧光蛋白 (金黄色葡萄球菌-mcherry) 的金黄色葡萄球菌 rn4220 菌株。金黄色葡萄球菌rn4220 菌株在毒力调节剂基因agra (辅助基因调节剂 a)中发生突变, 因此在斑马鱼胚胎模型中可能具有相对较低的毒力。其他金黄色葡萄球菌菌株或其他细菌物种的 bai 可以使用。

  1. 取色氨酸大豆琼脂培养板中的4 至5个金黄色葡萄球菌 rn4220 菌, 辅以10μgml 氯霉素, 并在10毫升的色氏豆芽中培养细菌到中对数生长阶段, 辅以10μg/ml氯霉素在37°c 晃动下。
    1. 在培养过程中, 将细菌悬浮液在900μl 的无菌磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中稀释, 在 620 nm (od 620)下进行光学密度测量 (od)。培养细菌, 直到 od620达到0.4-0.8。
      请注意:od620 的0.1 一般相当于 3.0 x 10 7 chuml s .aureus. 在对数中期生长阶段接种细菌的 od 620 在 0.4-0.8 之间。其他种类和菌株可能需要不同的培养时间。
  2. 以 3, 500 x克离心细菌 10分钟, 并在1毫升无菌 pbs 中重新悬浮颗粒细菌。随后用无菌 pbs 清洗细菌 2次, 最后在 pbs 中的 4% (w/v) 聚乙烯醇吡咯烷酮 40 (pvp40) 溶液中重新悬浮细菌。
  3. 涡旋这种细菌悬浮液, 并在900μl 无菌 pbs 中稀释100μl 的悬浮液, 用于 od620测量。用 pvp40溶液调整细菌悬浮液的浓度。这是 "只细菌" 的悬架。
  4. 生物材料可以自由选择与细菌悬浮液混合。在本研究中, 使用了商用聚苯乙烯 (ps) 微球 (蓝色荧光, 10μm)。为了产生细菌微球悬浮液, 在 1 , 000 x 克的室温下离心微球 1分钟, 丢弃上清液, 并在 "仅细菌" 悬浮液中重新悬浮微球 (在 pvp40 溶液中)。
  5. 为了在微球的存在和不存在下注入大约相等剂量的细菌, 细菌微球悬浮液的浓度需要是 "仅细菌" 悬浮液浓度的三分之二 (不含微球)。这是通过稀释细菌微球悬浮液 0.5体积的 pvp 40 溶液来实现的。将悬浮液混合在涡旋上。值得注意的是, 对这一比率 (三分之二) 进行了金黄色葡萄球菌评估。它也适用于表皮葡萄球菌, 但建议检查这一比例是否也适用于其他细菌物种和其他大小 (超过 10μm) 或形状的生物材料 (而不是微球) 注射。
  6. 通过将10倍系列稀释剂的定量培养, 检查 "仅细菌" 和细菌微球悬浮液的浓度, 如下所示: 将100μl 悬浮液转移到96孔板上, 并通过转移10μl 脂肪来连续稀释。悬浮到90μl 的无菌 pbs 中。板材在琼脂糖板上复制未稀释和稀释悬浮液的10μl 等位, 在37°c 下孵育板, 计数菌落并计算细菌数量 (菌落形成单位)。cfu)。

2. 斑马鱼胚胎的繁殖、收获和维持

  1. 遵循前面第35、36段所述的一般程序来繁殖、捕捞和维护斑马鱼胚胎, 并进行如下说明的修改。在一个加网的水箱中, 穿过野生类型 Tupfel 长鳍 (tl) 斑马鱼或斑马鱼的选择转基因线 (这里, mpeg1:kaede) 的一个水箱, 添加一个网, 以诱导成年雌性在灯光打开后产生卵, 然后将成虫与生产的鸡蛋分开。
  2. 第二天收集胚胎, 丢弃不可行的不透明胚胎。将每个培养皿中的大约60个胚胎 (直径100毫米) 保存在 e3 培养基37中, 在28°c 孵育。去除死亡和异常的胚胎, 每天刷新 e3 培养基。

3. 注射针的制备

  1. 使用微移液器拉拔仪准备用于注射的玻璃微细管针。使用以下设置: 热量: 772, 拉: 100, 奇迹: 200, 时间:40, 气体:75。
  2. 在针头外径约为 20μm (适用于10μm 微球) 的位置用钳子将针尖弄断, 使用光学显微镜, 并在眼睛中使用刻度条。避免针头与一个非常大的开放大小, 因为他们会损害胚胎的生存。
    请注意:根据要注入的生物材料的大小和形状, 可以选择较小或更大的开口。在文献中, 使用开孔约50微米的针头进行的注射导致胚胎存活率显著下降 38.

4. 注射 "仅细菌" 或细菌微球悬浮在斑马鱼胚胎中

  1. 热琼脂糖溶液 (1–1.5% (wt) 在脱水) 使用微波炉, 并倒进一个100毫米的 petri 培养皿。在培养皿中的琼脂糖溶液的顶部放置一个塑料模具模板, 在琼脂糖中产生凹痕, 以便将胚胎放置在适当的位置, 从而促进注射。在室温下孵化, 并在琼脂糖溶液凝固时取出模具。
  2. 在受精后3d 时, 将胚胎放入含有 0.02% (w/v) 的100毫米 petri 培养皿中, 对其进行麻醉。5分钟后, 将胚胎转移到含有 0.02% (w v) 的 e3 培养基覆盖的琼脂糖板上, 并将其对齐一个方向进行注射。对于 mpeg1:kaede 转基因线, 首先在 e3 培养基中麻醉含有 0.02% (w/v) 旋塞因的胚胎。然后使用立体荧光显微镜选择表达绿色荧光蛋白的胚胎。
  3. 用微型装载机的移液器尖端将针头装入大约10μl 的 "仅细菌" 或细菌微球悬浮液。将针头安装到连接到微型喷射器的微机械手上。对于此处使用的注射器 (请参阅材料表), 使用以下设置进行注射 2-3 nl: 压力: 300–350, 背压: 0, 时间: 2 毫秒。
    请注意:微型喷射器的设置取决于所使用的喷油器。注射剂设置可能需要调整为注射细菌与生物材料与其他形状或大小混合。
    1. 使用具有相同开口的针头注射 "仅细菌" 悬浮液和细菌微球悬浮液。如果针头断了或堵塞, 总是换一个新的针进一步注射。
  4. 在光显微镜下将针头插入胚胎的肌肉组织 (图 1), 在针头和胚胎体之间的角度为45-60°。通过轻轻地来回移动针头, 调整针头在组织中的位置。使用连接到微型喷射器的脚踏踏板注入胚胎。
  5. 注射荧光细菌后, 在立体荧光显微镜下对胚胎进行分级, 以成功感染。丢弃胚胎的评分为阴性 (没有可见荧光细菌或没有可见荧光微球)。在48个孔板的 e3 培养基中单独维护胚胎。每日刷新介质。

5. 胚胎粉碎、显微评分和细菌的定量培养

  1. 使用立体荧光显微镜对所有胚胎进行显微镜下评分, 以确定是否存在荧光细菌, 从注射后立即开始, 直到随后的每一天随机选择胚胎进行定量培养。
  2. 在注射后不久随机选择几个受感染的活胚胎 (本研究为5至 6), 并将它们单独转移, 使用无菌尖端分离2毫升微管。取出培养基, 用无菌 pbs 轻轻清洗胚胎一次, 加入100μl 无菌 pbs。
  3. 在每个小瓶中加入2-3 个无菌氧化锆珠 (直径2毫米), 并以 3, 500 转/分3分的速度将胚胎压碎, 时间为 3, 500 转, 定量培养步骤1.3 所述的均质体。
    请注意:其他均质机可能需要不同的设置。
  4. 根据步骤 5.3, 在注射后几天随机选择多个胚胎进行定量培养。

6. 斑马鱼胚胎感染进展和引发细胞浸润的荧光显微镜

  1. 如步骤4.2 所述, 对胚胎进行麻醉。将 pbs-2% (wt) 甲基纤维素溶液的移液器500μl 放入含有 e3 培养基和 0.02% (wt v) 的培养皿中。将胚胎放入甲基纤维素溶液中, 使其保持直线和水平。
    请注意:甲基纤维素溶液被用作 "胶水", 由于其粘度, 可以暂时固定胚胎在最佳方向的成像。
  2. 使用配备明亮场、mcherry、绿色荧光蛋白 (gfp) 和紫外线滤光片的立体荧光显微镜, 在相同的优化设置 (例如强度、增益和曝光时间) 下, 以160倍的放大倍率对单个胚胎进行成像.设置焦平面, 使注射引起的组织损伤成为焦点, 使用明亮的场滤波器。将 z-堆栈深度设置为 10μm, 将步长设置为 5μm, 从而可以记录3个连续图像。
  3. 每天一次, 从注射后5小时到注射后 2天, 图像单个胚胎。排除死胚胎 (没有心跳或胚胎部分退化) 进行进一步的成像和分析。在48个孔板的 e3 培养基中单独维护胚胎。每日刷新介质。

7. 利用对象 j 项目文件 "斑马鱼免疫仪" 定量分析感染进展的荧光强度和引发细胞浸润

  1. 下载 "zebrafices-vavotest" 和详细手册的链接: < http://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL >, 如以前的研究33所述。总之, 开放的图像与 "斑马鱼-免疫" 进行分析, 在免费软件程序图像 j 下操作。在每个加载的图像中, 根据观察到的胚胎组织损伤手动标记注射部位。
    请注意:标记的位点被 "斑马鱼免疫仪" 作为中心点, 在50微米的距离内检测荧光峰。然后将检测到的荧光峰值用作用于荧光测量的标准化区域 (直径为 100μm) 的中心。
  2. 单击 "对象 j" 菜单中的 "计算", 对所有图像自动运行多个通道的荧光测量 (如果适用)。导出数据, 并通过适当的统计测试方法进行分析。

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结果

本研究评估了斑马鱼胚胎作为一种新的脊椎动物动物模型在研究生物材料相关感染方面的适用性。微注射技术常用于向斑马鱼胚胎中注入不同的细菌种类, 从而引起 22、26、27、30、36种感染。利用图 1所示的步骤,将金黄色葡萄...

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讨论

生物材料相关感染 (bai) 是一种严重的临床并发症。更好地了解 bai 在体内的发病机制, 将为改进 bai 的预防和治疗提供新的见解。然而, 目前实验的 bai 动物模型, 如小鼠模型是昂贵的, 劳动密集型的, 需要受过复杂手术技术培训的专业人员。因此, 这些模型不适合高吞吐量分析。由于对斑马鱼胚胎模型的要求不那么复杂, 一般费用低于小鼠模型, 本研究评估了斑马鱼胚胎是否可以作为一种新的脊椎动?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项研究得到了 bifas 生物医疗材料方案国际金融和药物治疗项目的财政支持, 并得到了荷兰经济事务部的共同资助。作者要感谢澳大利亚莫纳什大学的 graham lieschke 教授提供斑马鱼转基因线 (mpeg1: galni-uas:kaede)。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Tryptic soya agarBD Difco236950Media preparation unit at AMC
Tryptic soya brothBD Difco211825
Polyvinylpyrrolidone40ApplichemA2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)Life technology/ThemoFisherF8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)Harvard Apparatus30-0038
Micropipette puller instrumentSutter Instrument IncFlaming p-97
Light microscope LM 20LeicaMDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine)Sigma-AldrichE10521-50G
Agarose MPRoche11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80LeicaMDG3610450126
Microloader pipette tipsEppendorf5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 standWorld Precision Instruments00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injectorEppendorf5248ZO100329
Microtrube 2 mL ppSarstedt72.693.005
Zirconia beadsBio-connect11079124ZX
MagNA lyserRoche41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)Biomerieux43671Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cpSigma-AldrichMO512-250G
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth)New Brunswick ScientificG10
Zebrafish incubatorVWRIncu-line
CuvettesBRAND759015
CentrifugeHettich-ZentrifugenROTANTA 460R
SpectrometerPharmacia biotechUltrospec®2000
ForcepsSigma-AldrichF6521-1EA
48 well-platesGreiner bio-one677180
96 well-platesGreiner bio-one655161
Petri dishFalcon353003
Petri dishBiomerieuxNL-132
ImageJNot applicableNot applicablelink: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0PrismNot applicable

参考文献

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