一种微琼脂盐桥电极分析重组膜蛋白质子周转率

摘要

在电生理测量中, 扩散电位的存在通过改变电极电位来干扰反向电位的精确测量。使用微琼脂盐桥, 扩散电位的影响最小化, 从而可以更精确地测量重组重组膜蛋白的基板周转数。

摘要

到目前为止, 50% 以上的药理药物以膜蛋白的迁移动力学为目标。脂质双层膜重组膜载体蛋白的电生理特性是评估其理化和药理特性的一种强有力但微妙的方法。基板周转数是一个独特的参数, 可以比较不同的膜蛋白的活性。在基因运输中, 移位基板的梯度产生膜电位, 与蛋白质的底物转化率直接相关。通过使用氯化银电极, 产生了一种扩散电位, 也称为液体结电位, 从而改变了电极电位并显著干扰了精确的膜电位测量。盐桥可以最大限度地减小扩散电位, 从而平衡电极电位。本文设计了一种微琼脂盐桥, 以改善电生理设置, 利用微移液器进行膜的形成。盐溶液被填充到微毛细管移液器尖端, 通过添加琼脂糖来稳定, 并可以很容易地安装在标准电极上。与标准电极相比, 微盐桥电极的电极电位更稳定。该系统的实施稳定了电极电位, 并可以更精确地测量 ph 梯度产生的膜电位。利用该系统, 对线粒体载体 ucp1 和 ucp3 的质子周转率进行了重新研究, 并与早期测量结果进行了比较。

引言

在所有已知的药物中, 多达60% 的药物^{针对膜蛋白 1}。膜蛋白的电生理测量是分析膜载体蛋白介导的底物电移的有力而微妙的工具。通过施加恒定电压或电压坡道来调节跨膜电流, 可以评估载体的药理和物理性质, 例如, 基板或运输的活化和抑制动力学。特别感兴趣的是底物周转数量, 它显示了每个时间单位由膜蛋白转移的底物量。它是比较各种膜蛋白动力学的一个主要参数。建立带电基板在膜上的浓度梯度会产生电动势, 从中推导出基板的周转次数。

使用 agcl 电极, 无氯缓冲器的存在会产生一个扩散电位, 从而改变电极电位, 并导致电流电压测量^的转移2。虽然总是存在, 但对于标准电导率和容量测量来说, 它是可以忽略不计的, 因为这些参数要么取决于电流电压记录 (电导) 的斜率, 要么是单个记录 (容量) 的差异, 这取消了潜力。然而, 由于基板的传输而产生的反向电位的记录, 扩散势会受到极大的干扰。因此, 为了精确测量反向电位, 电极电位必须保持不变。

扩散电位可以通过两种方法最小化: (i) 在有双层膜的情况下, 必须在膜^3、4的一侧增加基板浓度, 或者 (ii) 盐桥平衡电极^电位5. 第一种方法在很大程度上取决于测量的稳定性。膜必须存活几分钟, 从在搅拌下添加基板, 直到基板在溶液中几乎均匀分布。如果膜之间破裂, 基板梯度会被带电分子的自由交换所改变, 测量结果就会变得不准确。后一种方法平衡了扩散势, 但受到设置大小的限制。在一个微范围内实施一个小但功能正常的盐桥到电生理设置是具有挑战性^{的 6}。对于后一种方法, 盐溶液被填充到微毛细管尖端, 并通过添加琼脂糖来稳定, 以防止盐溶液扩散到缓冲液中。

在该协议中, 描述了一个简单的生产微琼脂盐桥和实现到一个电生理设置^的基础上的移液器设置7。对微毛细管尖端进行调整, 使其包含含有1摩尔% (w v) 琼脂糖的 3m kcl 溶液, 并连接 agcl 电极和缓冲液。微盐桥的优点表现在电极电位偏移的时间记录和在各种 ph 梯度下更精确地测量膜电位。在重组蛋白重组为脂质体的模型体系中, 对类似条件下产生的线粒体载体 ucp1 和 ucp3 的转化率进行了重新研究, 并与之前的结果^3,8进行了比较。

研究方案

1. 重组解偶联蛋白 (ucp) 的产生和平面准聚膜的形成

1. 如 rupprecht 等人所述, 生产重组 ucp1 和 ucp3 .⁹和 hilse等人¹⁰
2. 在传统可有可无的塑料移液器的尖端上形成平面双层膜, 由 beck等人描述.^7.

2. 微琼脂盐桥电极的制备

1. 将微毛细管移液器尖端 (见材料表) 调整到适当的长度。
   1. 在包含缓冲区的尖端将连接到的空尖端上标记位置, 并使用滑动卡尺测量微琼脂盐桥电极的长度。
      注意: 微细管尖端必须足够长, 才能进入用于测量的缓冲液。
   2. 用锋利的刀或刀片切割微毛细管尖端, 并用乙醇和水清洁切割表面。
2. 准备琼脂涂层电极。
   1. 切断长约8厘米的银线, 用乙醇和水清洗。
   2. 取一张砂纸, 在电线末端光滑1厘米长的表面, 这应该与盐溶液接触。
   3. 将平滑端浸入 3m kcl 溶液中, 并使用 1.5 v 的直流电源将其与氯化物进行电化学处理。
   4. 用水清洁电极, 将其干燥, 并从未涂布的一侧调整 agcl 电极的长度, 使其尽可能深入微毛细管尖端。
      注意: 协议可以在此处暂停。
3. 用1% 琼脂糖制备 3m kcl 盐溶液。
   1. 称量4.47 克的 kcl, 并将其溶解在20毫升的水中, 搅拌在烧瓶中。
   2. 取下搅拌器, 称重0.2 克琼脂糖, 然后将其添加到烧瓶中。
   3. 将溶液加热到 100°c, 将琼脂糖熔化, 防止其凝结。
      注意: 烧瓶会很热。不要赤手空拳碰它。使用手套进行处理。
4. 用琼脂糖盐溶液填充微毛细管尖端。
   注意: 解决方案是热的。保护双手, 小心工作, 避免飞溅。
   1. 如果琼脂糖开始凝血, 加热盐溶液, 使琼脂糖再次完全融化。
   2. 将琼脂盐溶液的10μl 浸泡到微毛细管尖端。慢慢地、小心地浸泡, 以避免尖端有气泡。
   3. 从移液器上取下尖端, 并从尖端的更宽一侧在 agcl 电极中推入。确保电极穿透盐溶液。
   4. 将电极冷却至室温, 并将其插入放大器。
5. 准备用于测量的缓冲区。
   1. 称量 0. 710 克的 na2 so4, 0.195 g 的 mes, 0.121 克的 tris, 0.023 克的 egta, 然后加入100毫升的蒸馏水到烧杯, 搅拌溶液。
   2. 使用 ph 电极检查缓冲液的 ph 值, 并将 ph 值调整为7.32。
   3. 检查参考电极和琼脂盐桥电极是否与电接触。
      1. 在塑料容器中添加1毫升的缓冲液。
      2. 在参考电极和琼脂盐桥电极中浸渍, 检查信号响应。如果信号响应正确, 请继续执行步骤2.7。
6. 如果存在错误的信号响应或根本没有电气接触, 请执行以下故障排除。
   1. 检查电极是否与盐溶液接触, 并将电极推入溶液中。
      注意: 如果溶液已经太粘, 取下微琼脂盐桥, 准备一个新的微毛细管尖端。
   2. 检查盐溶液中是否有气泡。如果是, 准备一个新的微毛细管尖端。
   3. 检查盐溶液是否与缓冲液接触。如果没有, 则切断另一个1毫米的管端的尖端。
      注意: 请确保提示的长度仍然足以穿透包含缓冲区的提示。如果仍然没有接触, 准备一个新的微毛细管尖端。
   4. 如果这些步骤都没有帮助, 准备一个新的微毛细管尖端。
7. 为了储存, 将琼脂盐桥电极浸入 3m kcl 溶液中。
   注意: 该协议可以在此处停止。对于一夜的停顿, 请将电极存放在4°c 的 3m kcl 盐溶液中。
8. 准备含有缓冲的塑料尖端。
   注意: 如果电极隔夜存放, 将其取出, 让其加热至室温 3 0分钟。
   1. 取一个微毛细管尖端, 弯曲管, 2 厘米, 从边缘的狭窄部分, 约90度使用加热线。
   2. 使用非常锋利的刀或刀片, 并切断从弯道约5毫米的管。
   3. 用乙醇和水清洁最后的表面, 测量尖端孔的直径。由此, 计算表面面积。
   4. 将尖端表面涂上 85:15 (v: v) 已烷: 已烷。
      1. 将溶剂的液相 3μl, 并将其从尖端中取出。
      2. 等待 1分钟, 使尖端中的所有剩余溶剂都蒸发。
   5. 用3μl 的缓冲液填充测量尖端, 并将其插入盐桥电极上。
      注: 通过执行步骤 2.5.3, 再次检查盐桥电极和参考电极是否处于电接触中。
   6. 如果没有电气接触, 请检查以下各项:
      1. 检查盐桥电极是否与缓冲液接触。如果没有, 则增加尖端的缓冲液体积或准备更长的微毛细管尖端。
      2. 如果有气泡, 请从微盐桥电极上取下尖端, 将尖端中的缓冲液重新填充, 然后再次将其插入电极。

3. 重组蛋白膜再生电参数的测量

1. 应用具有最大电压 u_最大值 = 50 mv 和 t 坡道 = 50 毫秒的三角交流电压信号, 从而产生矩形交流电响应。从正负电流 (i₊和 i_-)的平均值中, 根据以下公式计算膜的容量:
   
2. 应用-50 mv 至 + 50 mv 的电压坡道并记录电流。将线性函数拟合到数据中--斜率是电导率--并计算拟合的 x 轴交点。
3. 在塑料尖端排放溶液, 并在新的溶液中填充含有增加基板浓度的缓冲液。
   1. 如果在前20-30秒内没有形成膜, 则释放体积并填充。这保证了膜的浓度梯度在膜形成过程中不会发生显著变化。
   2. 形成膜后, 再次执行步骤3.1 和 3.2, 以验证正确的膜形成, 并获得 x 轴交点。

4. 基板周转率的计算

注: 有关详细信息^{3、7, 请}参阅以前的工作。

1. 从脂质和蛋白质 (m_脂类和 m_蛋白)的分子质量、膜面积和一个脂头群 (a_膜和_{a 脂质}) 以及蛋白质的质量比等方面估计膜中的蛋白质含量。脂质 (r)。
   
2. 计算所运输的基板的 nernst 电位。r 是气体常数, t 是温度, z 被运输的基板的电荷, f 法拉第的常数, c₁和 c₂是膜两侧基板的浓度。
   
3. 从电流电压记录, 采取反向电位计算的差 x 轴交点与线性配合在存在和不存在的基板梯度。
4. 计算基板电导率的比例, g_基板, 与总膜电导率的比例, g_总, 由反向电位与 nernst 电位的比率¹¹。
   
5. 从基板电导 (g_基板)、应用的电压 u_和基板z 的电荷计算基板的周转数 n 基板每时间单位 t:
   
6. 从每次运输底物与蛋白质数量的比率, 计算出的转化率。
   

结果

为了验证扩散势的最小化, 测量了完整膜的电流电压测量的稳定性。在图 2a 中, 在 ph 梯度存在 (白点) 和不存在 (黑点) 的情况下, 描述了代表性电流电压记录。根据 nernst 方程, ph 梯度会引起电压的变化。从线性拟合的 x 轴交点计算出潜在的偏移。为了测试这两个电极, 分析了标准 agcl 电极 (图2 b; 白点) 和微琼脂盐桥 (图 2b; 黑点) 在 x 轴交点上的位移.电压坡道连续记录 10次, x 轴的平均位移与时间相比较。虽然琼脂盐桥电极的最大移动小于 5 mv, 即使在300秒的测量, 标准电极变化高达 30 mv 的不可预测的, 随机的, 行为。

接下来, 两个电极都在不同的 ph 梯度下进行了测试 (图 3a)。对于标准电极, ph 梯度为0.35 和 1.0 (白点);琼脂盐桥电极, ph 梯度为0.35、0.7 和 1.0 (黑点)。在三个独立的测量中分析了电位的变化。与0.35 的梯度相比, 在没有微琼脂盐桥的情况下, 测量的偏移变化仅略有变化, 在 ph 梯度为1.0 时, 电压变化会显著改变。从与数据的线性拟合中, 标准电极的函数斜率为 26.4±2.3 mv ph 值, 微琼脂盐桥电极的斜率为 50.1±4.6 mv ph 值。根据 nernst 方程, 计算出的电位偏移在 t = 32°c 时为 60.7 mv ph 值。

利用微琼脂盐桥测量了线粒体 ucp1 和 ucp3 的质子周转量, 并与以往的测量结果进行了比较 (图 3b)。与图 3a 类似, 生成了 ph = 1.0, 并测量了反向电位。根据该协议第4节提供的公式估计膜中的蛋白质含量, 蛋白质与脂质的比率为 4μgg/mg (mg), 分子质量为 33, 000, 蛋白质和脂质为 750 da, 膜表面积为 3.53 x 10^-4厘米², 每脂量 7.8 x 10-15 厘米 2 .ucp1 和 ucp3 分别为5.56±0.38 秒和4.10 ±0.71 秒-¹ (图 3b).

图 1: 微琼脂盐桥的电生理设置.(a) 此面板显示设置的草图。含有琼脂盐溶液的微毛细管尖端 (用橙色描绘) 被放置在电极 (黑色) 和含缓冲区尖端 (蓝色) 之间。膜在含有缓冲区的尖端的表面形成 (由箭头表示)。(b) 该面板显示了实施微琼脂盐桥的电生理设置图像。箭头指向电极、微琼脂盐桥、参考电极和带有缓冲液的容器。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 微琼脂盐桥与标准 agcl 电极的比较.(a) 该面板显示了具有代表性的电流电压测量, 在 ph 梯度为1的情况下 (灰点) 和不存在 (白点)。这些线表示与数据的线性拟合, 从该线中获得电导率和 x 轴交点值。电压偏移是由两个记录的交点值的差异来评估的。(b) 该面板显示标准 agcl 电极 (白点) 的膜电位及时转移到微琼脂盐桥电极 (黑点)。连续记录了10次电流电压测量, 并根据时间绘制了扩散电位的平均电压偏移。在所有实验中, 该膜由 45:45:10 mol% dopc:dooe/cl 重组为 15 mol% 花生四烯酸, 浓度为 1.5 mg/ml。该缓冲液在 ph = 7.34 和 t = 32°c 时含有 50 mm na 2 so₄、10 mm mes、10 mm tris 和 0.6 mm egta.请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 在 ph 梯度存在的情况下, 从反向电位计算出 ucp1 和 ucp3 的质子周转数.(a) 该面板显示了标准 agcl 电极 (白点) 和微琼脂盐桥电极 (黑点) 的各种 ph 梯度的含有 ucp1 的膜的电位变化。这些线表示与数据的线性拟合。(b) 此面板显示 ucp1 (第一套数据集) 和 ucp3 (第二数据集) 的质子周转数, 根据协议第4节的公式, 从电压转移与 nernst 电位的比率计算。每套的第一个柱代表用微琼脂盐桥测量的周转率。每个数据集的第二个柱表示以前使用标准 agcl 电极进行的测量。ucp1 和 ucp3 的值取自 urbankova等人.³和 macher等人⁸. 在所有测量中, 膜均由 45:45l 10 mol% dopc:dooe/cl 重组为 15 mol% aa 和 ucpuuc3。脂质和蛋白质的浓度分别为 1.5 mgml 和4μgmg 脂质。该缓冲液在 ph = 7.34 和 t = 32°c 时含有 50 mm na 2 so₄、10 mm mes、10 mm tris 和 0.6 mm egta.通过添加 tris, 将梯度测量缓冲区的 ph 值提高到7.66、8.00 或 8.00, 并在含有溶液的移液器中进行了更改。这些值是三个独立测量值的平均±标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

使用电极的微琼脂盐桥的实施最大限度地减少了其扩散电位, 并可以更精确地测量 ph 梯度产生的膜电位。在存在各种跨膜 ph 梯度的情况下, 与 nernst 平衡电位的理论值 (_nernst = 23.8 mv 表示 ph = 0.4) 相比, 两个电极的电位偏移在 nernst 平衡电位的理论值下是可以接受的。然而, 在更多的生理 ph 梯度, 例如在线粒体之间的基质和膜间空间, 标准的 agcl 电极未能精确地测量电位转移在 ph = 1 (图 3a)。与微琼脂盐桥接的电极提供的值与理论的可比性要高得多。

如果在实验过程中改变了缓冲液, agcl 参考电极上也可能出现扩散电位。实验中采用了无氯缓冲液, 建议分离蛋白质来运输氯离子, 并使用 tris 或 mes 对 ph 值进行调整。在没有大量氯化物浓度的情况下, 电极电位主要取决于缓冲液中的氯化物杂质。由于它的组成在实验过程中没有变化, 它只会产生一个恒定的偏移电位。然而, 为了测量两个电极之间的绝对电位差, 一个简单的琼脂盐桥系统 (ag/agcl 3 m kcl) 也可用于参考电极。

微琼脂盐桥通过平衡电极电位来平衡扩散电位。为了稳定盐溶液, 添加了1% 琼脂糖, 以防止盐溶液与缓冲液混合。盐离子^{k +}和 cl^在液体中具有相似的流动性, 平衡电极电位。为了正确安装盐桥, 琼脂盐溶液必须充分加热, 以填补微毛细管尖端, 没有任何气泡, 并覆盖 agcl 电极。在进一步使用之前, 必须检查盐桥电极与参考电极之间的电接触。根据盐桥的使用时间, 盐液必须有足够的胶凝, 以防止盐液与缓冲液混合。如果对 k⁺或 cl^-运输机进行调查, 这一点尤其关键。盐桥使用时间很短, 在这个时间范围内, 琼脂糖的洗脱量可以忽略不计。琼脂糖浓度较高, 最高为 5%, 或琼脂浓度 (3%-5%), 允许使用盐桥更长的时间^6,12。

该方法可以确定膜转运体 (i) 的传输动力学 (i) 和 (ii) 内膜线粒体蛋白的迁移动力学, 这在标准的膜片钳设置¹³中很难被研究。其精度主要取决于反向电位测量, 在低全膜电导率和小浓度梯度下, 精度降低, 从而使膜电位低于记录噪声。

利用这种设置, 测量了在相同条件下生产的 ucp1 和 ucp3 的周转率。由于 ph 梯度较高, 获得的速率似乎更精确, 不受电极电位偏移引起的文物的干扰。它可用于进一步分析和比较在类似条件下产生的线粒体膜转运体。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microloader tips	Eppendorf	5242956.003	Microcapillary pipette tip
Ethanol 99%	AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H	AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid	Carl Roth GmbH + Co. Kg	6781.3
DC supply	Voltcraft	V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard	Carl Roth GmbH + Co. Kg	3810.2
Patch Clamp Amplifier	Heka
Sample tube	Carl Roth GmbH + Co. Kg	5863.1
Na2SO4	Carl Roth GmbH + Co. Kg	8560.3
MES	Carl Roth GmbH + Co. Kg	4256.2
TRIS	Carl Roth GmbH + Co. Kg	AE15.2
EGTA	Carl Roth GmbH + Co. Kg	3054.1
Hexane	Sigma-Aldrich	296090-100ML
Hexadecane	Sigma-Aldrich	296317-100ML
Heating wire	Voltcraft	USPS-2250