高频超声在胎儿和胎盘发育分析中的影响

摘要

本文介绍了高频超声对小鼠胎儿体内分析的技术。这种方法允许胎儿的随访和胎盘参数的分析, 以及整个怀孕期间的产妇和胎儿血液流动。

摘要

超声成像是一种广泛用于检测人体和动物组织器官异常和肿瘤的方法。该方法无创、无害、无痛, 应用简单、快速, 即使使用移动设备, 也可以在任何地方完成。在怀孕期间, 超声成像被用来密切监测胎儿的发育。该技术是重要的评估宫内生长限制 (iugr), 妊娠并发症, 对母亲和胎儿的短期和长期健康的影响。了解 iugr 的过程对于制定有效的治疗策略是不可或缺的。

本手稿中使用的超声波系统是为分析小动物而产生的一种超声波装置, 可用于包括怀孕研究在内的各种研究领域。在这里, 我们描述了系统的使用, 在体内分析胎儿的自然杀手 (nk) 细胞肥大细胞 (mc) 缺乏的母亲, 生的生长限制的幼崽。该协议包括系统的准备、测量前和测量过程中小鼠的处理, 以及 b 模式、彩色多普勒模式和脉冲波多普勒模式的使用。分析了胎儿的大小、胎盘大小和胎儿的血液供应情况。我们发现, 从妊娠中期开始, 缺乏 nkcc 的小鼠的植入面积和胎盘变小。此外, mc/nk 缺乏与胎儿脐叶(uma) 中无端舒张流和反转端舒张流和阻力指数升高有关。协议中描述的方法可以很容易地用于相关和非相关的研究主题。

引言

超声波是高于人耳听觉范围的声波, 高于约20千赫 1.像蝙蝠、威尔士、海豚²、3、老鼠4、老鼠⁵和老鼠狐^{猴 6}这样的动物都使用超声波进行定向或交流。人类利用超声波进行多种技术和医疗应用。超声波装置能够产生声波, 并传播和表示信号。如果超声波遇到障碍, 声音会被反射、吸收或通过。超声作为一种成像方法的应用, 称为超声, 用于分析人体或兽医的有机组织, 如心脏 (超声心动图)^7,8, 肺 9, 甲状腺¹⁰, 肾脏¹¹, 和尿和生殖道^12,13;检测胆结石¹⁴和肿瘤¹⁵;并评估血管或器官的灌注^16,17。超声是怀孕期间产前护理的标准方法, 胎儿发育障碍或损伤可以及早识别。具体而言, 定期密切监测胎儿的生长情况, 以识别可能的 iugr。最后, 可以监测胎儿的血液流动情况, 因为这可以指出生长限制^{18、19、20、21.}

与其他方法 (如放射学) 相比, 超声成像的一个主要优点是要分析的组织的声音无害性。这种简单快捷的方法是无创、无痛的, 可以多次使用。超声波设备的初始支出昂贵;然而, 所需的消耗品是便宜的。本手稿中使用的超声波系统适用于一系列动物模型(即小鼠和鱼类), 而对于人类而言, 超声波设备需要 3-15 mhz 的频率, 小鼠需要 15-70 mhz 的频率。

本文介绍了一种使用 b 模式、彩色多普勒模式和脉冲波多普勒模式的协议。描述包括小鼠的准备以及性能、数据采集和存储。该方法已成功地应用于不同的小鼠菌株在所有妊娠期, 可用于调查胎儿和胎盘发育以及母亲和胎儿的血液参数。在这里, 所有的应用都解释了基于我们的研究使用怀孕的 mc nk 缺乏和控制小鼠。

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研究方案

这里描述的所有方法都已得到 "landesverwaltungsamt sachsen anstel:42502-2-1296unimd" 的批准。

1. 实验程序

1. 将6至8周龄女性 mc 缺乏 c57bl/6j-cpa3^cre/+ (cpa3^cre/+) 小鼠和 mcc-充足的 c57bl/6j-cpa3^{++ (}菌落对照;cpa3^+/+) 与 balb1 男性。
2. 定义妊娠日 (gestation) 0 后确认阴道塞和治疗女性后立即塞确认。
   注: 塞子是女性阴道口中男性的精子。
   1. 在控制 cpa3 ++ 女性中, 在腹腔内注入 250μl^的 pbs。
   2. 在缺乏 mc 的 cpa3 cre/+ 女性中, 腹腔内注入 250μl^{抗 cd122} (0.25 毫克)。
      注: 如前^22篇所述, 注射0.25 毫克的抗 cd122 会耗尽缺乏 mc 的 cpa3^cre/+雌性中的外围 nk 和 unk。
3. 等到 gd5。
   注: 在 gd5, 有植入分析的最早可能性。
   1. 继续进行超声分析的步骤2-5。
4. 在 gd5、8、10、12和14处执行超声成像。

2. 超声系统的准备

1. 打开系统 (图 1B; 背面的主电源和左侧位置的计算机待机电源)、加热平台 (图 1 b; 控制垫) 和凝胶加热器 (图 1B)。
   注: 超声凝胶需要预热约0.5 小时。
2. 确保异氟醚装置充满充分 (图 1d)。
3. 在浏览器中的现有研究中打开新研究或新系列。在"学习信息"窗口中填写所有必需的信息 (所有者、研究名称、系列名称、动物数据)。单击 "确定"。
4. 单击 "确定"后, 确保显示 b 模式映像窗口, 并自动开始 b 模式下的映像。

3. 鼠标处理

1. 鼠标的反化
   1. 将鼠标放入击倒盒 (图 1e) 中, 关闭包装盒, 打开被击倒盒的异氟烷管, 然后打开异氟烷 (浓度 3.5%)。
   2. 当鼠标被麻醉时, 通过在加热平台的方向打开管道并关闭向下敲模箱, 降低 (浓度为 1.5%) 并重定向异氟烷流。
      注: 要达到足够的麻醉, 请在鼠标不再移动后再等待10秒。
   3. 将鼠标快速从敲除箱转移到加热平台 (图 1f) 的背侧位置, 并轻轻地将鼻子放置在位于平台顶部的麻醉鼻管中。
2. 用于测量的鼠标固定、脱毛和准备
   1. 将眼睛保护霜放在老鼠的每一只眼睛里, 以防止眼睛干燥。
   2. 在加热平台上的四个铜区域中的每一个区域放置一滴电极凝胶 (图 1f)。
   3. 在加热平台的电极凝胶涂层区域上, 用手术胶带轻触爪子。
   4. 检查心电图 [最佳值 = 450-550 比茨/min (bpm)] 和呼吸生理学在任何时候。
      注: 通过使用直肠探头, 可以测量体温, 但不是必需的。
   5. 将脱毛霜放在老鼠腹部, 用棉签擦奶油, 等1分钟左右, 用水浸透的压缩器取下乳膏。如果不是所有的头发都消失了, 请重复此步骤。
   6. 将预热的超声波凝胶涂在脱毛的皮肤上。

4. 图像和视频的测量和获取

1. 将传感器 (图 1g) 按住手或将其夹在固定装置中 (图 1G; 建议按住装置)。
2. 用换能器识别膀胱, 并将其作为参考点。将换能器移动到腹部的左右部位, 以追踪植入物。
3. 用于二维灰度图像解剖结构可视化的 b 模式
   1. 移动传感器或加热平台表, 在其中鼠标固定, 直到第一次植入在屏幕上以最大尺寸可见。
      1. 选择"图像标签"并输入名称, 或输入 "帧存储" (不存储名称) 以存储单个帧, 或选择 cine store来存储用于整个植入测量的 cineloop。
   2. 移动传感器或桌子, 使胎盘到达 uma 中血液流动可见的位置。存储一个单一的框架或电影 (见步骤 4.3.1.1) 的胎盘测量。
      注: 从 gd10 开始, 可以进行胎盘测量。
   3. 继续使用相同的方法进行所有植入。
4. 彩色多普勒模式, 用于可视化和确定血流方向
   1. 按"颜色" 按钮。
   2. 使用轨迹球将 "色盒" (在此区域中, 信号可见) 移动到所需位置。如有必要, 通过按"更新"并移动轨迹球 (向右/向上 = 较大; 向左向下 = 更小) 更改框的大小。当框具有正确的大小时, 按"选择"。
   3. 按照步骤4.3.1.1 中的说明存储单个帧或煤炉。
5. 脉冲波 (pw) 多普勒模式, 以量化血液通过血管在子宫 (子宫动脉, ua) 和 uma
   1. 找到颜色多普勒采集中感兴趣的区域。
      注: ua 位于膀胱的尾端, 和 uma 位于胎儿和胎盘之间。
   2. 按pw, 将出现虚线。将这条线移动到感兴趣的血管, 并使用 "多普勒角" 旋钮调整线的角度, 与血液流动一致。按更新。
      注: 血液流动方向与换能器之间的角度必须在所有动物中保持一致, 特别是在使用大于60°的角度时 (此处, 使用的是 uas 70°, 离场使用了 45°)。
   3. 将出现的多普勒线的煤渣存储在 pw 多普勒采集窗口中。

5. 审查和完成数据采集和保存系列

1. 要查看数据, 请按研究管理.滚动到感兴趣的缩略图, 然后双击"更新"。
2. 先按 "学习管理" , 然后在浏览器窗口中关闭, 以完成数据采集并保存录制的系列。
   注: 关闭系列后, 无法再存储此系列中的帧或煤店。

6. 采集数据后鼠标处理

1. 在干燥的压缩机的帮助下, 从麻醉动物身上取下凝胶。
2. 小心地从爪子上取下手术胶带。
3. 关闭异氟醚管 (浓度为 0%)。
4. 在 gd5、8、10和12处进行以下超声波分析。
   1. 将动物单独放在笼子里至少 5分钟, 这样它就有时间醒来和定位。
   2. 将鼠标放回原来的笼子中。
      注: 在取下凝胶和手术胶带之前, 不要关闭异氟醚, 因为老鼠在关闭异氟烷后很快 (约 20秒) 醒来。
5. 在 gd14 进行以下超声分析。
   1. 在女性醒来之前, 通过颈椎脱位来牺牲它。打开动物, 取出子宫, 分离胎儿和胎盘, 测量胎儿和胎盘重量。

7. 复制和导入数据

1. 通过单击 "导出到" 标记一个或多个系列, 然后选择要将数据复制到硬盘上的存储空间。
2. 在计算机上打开软件, 然后单击 "复制来源" , 然后从硬盘中选择 "研究" 系列, 将 "研究" 系列导入到软件中。
3. 使用软件分析数据。

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结果

本手稿中使用的超声波系统的各个组成部分如图 1所示。图 2显示了在 gd5、8、10和 12 (b)和相应的植入面积测量结果(a)以 b 模式获得的代表性超声图像, 显示植入面积显著减少。从 gd10 开始, 抗 gd10 治疗的 cpa3^cre/+小鼠。

图 3显示?...

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讨论

利用我们的超声系统, 我们展示了从 gd10 开始缺乏 mcw 的母亲胎儿生长的限制。此外, 在 gd10 和 12, 我们观察到胎盘尺寸减少, 在 gd10 中, 一些缺乏 umcm函的小鼠在 uma 中没有或逆转端部舒张流。这种血管化不良的迹象与动脉的显著阻力指数有关。结果证实了 uMCs 和 uMCs 在妊娠和胎儿健康以及了解 iugr 过程中的重要作用。

该协议适用于从 gd5 开始 (植入后) 的每一个妊娠日。议定书?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb)	BioLegend	123204	Klon TM-β1; 500 µg
Vevo 2100 System	FujiFilm VisualSonics Inc.		Transducer MS550D-0421
Vevo LAB Software	FujiFilm VisualSonics Inc.
Isoflurane	Baxter	PZN: 6497131
Electrode gel	Parker	12_8
Surgical tape	3M Transpore	1527-1
Eye cream	Bayer	PZN: 1578675
Cotton tipped applicators	Raucotupf	11969	100 pieces
Depilatory cream	Reckitt Benckiser	2077626
Compresses	Nobamed Paul Danz AG	856110	10 x 10 cm
Ultrasound gel	Gello GmbH	246000