基于 crispr-cas9 的竞争检测对遗传依赖性的调查

摘要

这份手稿描述了一种基于群集的规则间的短半突 (crispr) crispr-cas9 方法, 用于简单而快速地调查多个候选基因在急性髓样白血病 (aml) 细胞增殖中的作用。并行。这种技术是可扩展的, 也可以应用于其他癌症细胞系。

摘要

基因摄动研究已被广泛用于研究单个基因在 aml 发病机制中的作用。为了实现完全的基因破坏, 这些研究中的许多都利用了复杂的基因敲除模型。虽然这些针对敲除小鼠的研究为研究基因组学与表型的关系提供了一个优雅且久经考验的系统, 但这是一种快速且可扩展的方法, 用于评估在 aml 模型中发挥 aml 细胞增殖或存活作用的候选基因将有助于加速对多个候选基因的平行审讯。最近在基因组编辑技术方面取得的进展大大提高了我们以前所未有的规模执行基因扰动的能力。其中一个基因组编辑系统是基于 crispr-cas9 的方法, 可用于在目标细胞基因组中进行快速有效的改变。crisprs9 介导的基因缺失的易用性和可扩展性使其成为在表型检测中询问大量基因的最有吸引力的技术之一。在这里, 我们提出了一个简单的方法, 使用 crispr/cas9 介导的基因破坏结合高通量流-细胞仪的竞争分析, 以研究基因的作用, 可能发挥重要作用, 在人类的增殖或生存和小鼠 aml 细胞系。

引言

在过去的几十年里, 已经有了许多研究工作, 重点是确定关键分子途径在急性髓系白血病 (aml) 发病机制中的贡献。传统上, aml 细胞中的基因破坏是使用有条件的敲除小鼠或短发针 rna (shrna) 进行的。虽然敲除小鼠提供了一个复杂的系统, 用于在时空上控制基因缺失, 而产生基因敲除小鼠则是劳动密集型、耗时且昂贵的。此外, 使用重组策略的基因淘汰也不容易扩展;这些策略并不适合平行地对几个基因进行审讯。在发现 rna 干扰方法以使用小干扰 rna (sirna) 或 shrna 敲除内源性 mrna 后, 许多组开始使用 rna 干扰技术来研究特定基因在 aml 中的作用。由于使用传统的脂质转染方法很难转染小鼠和人的 aml 细胞, 因此大多数研究都使用 lentiv 或逆转录病毒编码的 shrna 来研究 aml 细胞的基因功能。最近发现的聚集定期间隔的短回文重复 (crispr) 和相关的 cas 核酸酶 (crispr-cas9) 使基因靶向技术^1、2、3发生了革命性的变化。使用 crispr-cas9, 可以删除、编辑或标记特定的基因或基因组区域, 高效和轻松。基于 crispr-cas9 的基因编辑由于该技术的简单性、有效性和广泛适用性, 目前正在成为研究不同细胞类型中基因组学到表型关系的首选方法。基于 crispr-cas9 的方法也正在成为 aml 中的首选方法, 这不仅是为了询问单个基因, 也是一种针对排列或汇集的基因屏幕中的多个基因的方法, 目的是将多个基因作为潜在的平行调查aml 依赖^{关系 4,5,6}。

在这篇手稿中, 我们描述了一个简单的竞争增长分析, 用于测量基因破坏对 aml 细胞生长的影响, 基于稳定的 crispr-cas9 介导的基因编辑, 然后是高通量流式细胞术。该方法简单、高效, 可扩展到中等吞吐量实验, 用于研究多个基因在反洗钱细胞中的并行作用。

研究方案

1. 生成具有高稳定性和活性表9表达的 aml 细胞系克隆9

1. cas9 慢病毒的生产
   1. 第0天: 在 dmem 10 毫升中的切片 4^{x 10} 6 293t 细胞, 在生物安全 2级 (bovine) 认证的细胞培养罩中, 用10% 的胎儿牛血清 (fbs) 以及10厘米组织培养盘中的青霉素和 l-谷氨酰胺。将盘子放入37°c 的孵化器中。
   2. 第1天: 在第1天, 镀金的293t 细胞应融合 70%-80%。下午使用以下协议执行转染。
   3. 将转染介质、培养基和转染试剂加热至室温。解冻转染所需的所有质粒。
   4. 将9微克 pspax2、0.9 微克的 pmd2. g 和9微克的 plete-cas9 质粒与500μl 转染介质混合在5毫升管中。
   5. 在14毫升圆底管中加入 1.7 ml 转染介质。将57μl 转染试剂直接添加到管内的转染介质中, 以避免接触管内壁。
   6. 轻轻地将整个质粒混合在转染试剂溶液中, 然后轻轻敲击侧管。在室温下将混合物生也就是120-30分钟。同时, 改变种子293t 板的介质。
   7. 将转染混合向下添加到板上, 轻轻地侧摇晃板, 以实现高效的混合。将板材放入37°c 的孵化器中。
   8. 第 2 天 : 轻轻地从转染板上吸出上清液 , 使细胞不会扰或从转染板上脱落。放弃上清液。加入10毫升新鲜的 10% dmem 介质, 轻轻从板材两侧向下滑动, 以避免脱落细胞。
   9. 第3天: 将含有上清液的病毒慢慢从转染板中收集, 将其放入10厘米的无菌注射器中。上清液收集到注射器后, 将不育的0.45μm 过滤器连接到注射器上, 并将注射器和过滤器固定在新鲜的 15 ml 聚丙烯锥形管上。轻轻地将注射器浸入 15 ml 聚丙烯锥形管中, 通过0.45μm 过滤器将含有上清液的病毒过滤。
   10. 将病毒调节培养基储存在2毫升的等价物中, 分别在-80°c 的2毫升低温中。
2. aml 细胞系的转导
   1. 第1天: 用无菌磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 将重组人纤维连接蛋白片段库稀释至10μg/ml。在 bsl2 批准的细胞培养罩中, 用10μgml 重组人纤维连接蛋白片段工作溶液的2毫升涂上非组织培养的6厚板。将盘子包裹在保鲜包装中, 以避免蒸发损失, 并在室温下存放一夜。
   2. 第0天: 解冻含有 cas9 的病毒上清液。在喷孔前完全从包膜板上吸出重组人纤维连接蛋白片段溶液。加入2毫升的病毒调理培养基与 cas9 的盘子, 并在1300xg 旋转 90分钟在35°c。这有助于病毒颗粒附着在喷水井上。
   3. 同时, 计数要被转移的细胞, 并在一个15毫升聚丙烯锥形管中旋转 2 x^{10 6}细胞。在2毫升的新鲜培养基中吸收上清液并重新悬浮颗粒。
   4. 喷药后, 将所有病毒上清液从喷药井中取出, 丢弃。来自上清液的逆转录病毒颗粒附着在喷水井的底部。在这口井中, 从上面的步骤中加入 2 x^{10 6}细胞重新悬浮在2毫升培养基中。
   5. 再次旋转板在 1, 300 x g 非常短暂 (1-2分钟) 足以让细胞在底部沉淀下来。将盘子放回孵化器, 并在井上放置一夜的转导。
   6. 第1天: 根据细胞密度, 在被转移的细胞中添加更多的培养基, 以避免过度生长。
   7. 第2天: 由于 pleti-cas9 质粒具有 blasticidin 耐药标记物, 因此在10μgml 剂量下加入 blasticidin, 以转染和未诱导 (对照) molm13 或小鼠 mll-af9 白血病细胞, 以选择 cas9 表达细胞。
      请注意:当所有未被转移的对照细胞都被消灭时, 卡西 9-转染的 molm13 或 mll-af9 白血病细胞的选择被认为是完整的。对于 molm13 和 mlal-af9 白血病以外的细胞系, 必须在本实验之前执行剂量反应曲线, 以便使用最佳剂量。在低转导率的情况下, 也可以对病毒上清液进行滴定。
3. 高卡斯9表达细胞的克隆选择。
   请注意:我们已经注意到, 在一些 aml 细胞系中, 克隆选择可能是没有必要的: 在选定的人群中, 散装 cas9-blasicidin"已经具有很高的基因组编辑效率。在这种情况下, 可以跳过步骤 1.3, 然后进入步骤1.4 来评估 cas9 在散装 cas9-blasticidin aml 细胞中的表达。在进行竞赛检测之前, 评估这些批量 cas9-aml 单元 (步骤 1.5) 的基因编辑效率仍然很重要。我们推测, 单高 cas9 克隆的选择减少了基因组编辑的可变性, 这在测试许多不同的单导轨 rna (sgrna) 时尤其重要。
   1. 使用 bsl2 批准的引擎盖中包含的 facs 分拣器, 分别对单细胞 9-blascidin 和 mll.9 白血病细胞进行选择, 称为 molm13-cas9 和 mlal-af9-cas9 细胞。分选可分为5-10 圆底组织培养, 处理了96孔板。
   2. 一旦单 molm13-cas9 和 mll-af9-cas9 克隆已被挑选并单独命名, 在培养基中用10μgml 的 blasticidin 扩大10-20 个克隆, 以确保 cas9 表达的维持。
4. 免疫印迹法检测稳定的 cas9 蛋白的表达。
   1. 根据制造商的协议, 使用核提取试剂盒, 对 molm13 和 mll-af9 白血病的所有单酸蛋白选择克隆进行核提取。检查 cas9 蛋白的表达使用抗旗 m2 抗体, 因为 cas9 在 plete-cas9 质粒是连接到 n 端旗表位。
   2. 将每个核提取物中的50微克总蛋白加载到10% 的 bis-tris 凝胶上, 并以 120 v 的速度运行凝胶, 直到上带完全分离。
   3. 用5% 的牛奶溶液在 tbst 缓冲液中阻止膜1小时。
   4. 在4°c 的最终浓度为1μgml 下, 用1:1000 稀释抗旗 m2 抗体对膜进行培养。
   5. 第二天, 用 tbst 缓冲液清洗膜, 用 hrp 共轭抗小鼠二级抗体在1:5000 的稀释 (最终浓度为 0.16μg/ml) 下孵育膜1小时。
   6. 用 tbst 彻底清洗膜, 并使用 ecl 基板开发印迹。
   7. 选择3-4 蛋白表达最高的 cas9 克隆体, 由西方印迹观察到, 用于进一步的功能分析 (图 1)。
5. 确保在选定的克隆中保持较高的 cas9 活动
   1. 按照步骤1.1 中的描述, 使用 sgrna 定位人类或小鼠 aavs1 安全港位点, 从 sgrna 编码载体中制备慢病毒上清液。
   2. 用上述 spsaprna 方法用抗 aavs1 sgrna 慢病毒上清液转移顶部的 cas9 表达 molm13 或 mll-af9 白血病克隆体。选择2.5 微克/普霉素4天。
   3. 根据制造商的指示, 在普霉素选择后, 使用基因组 dna 提取试剂盒, 从 molm13-cas9 或 mll-af9 白血病克隆中纯化基因组 dna, 并进行相应的野生类型对照。使用50纳克 dna 作为模板, 使用 taq 聚合酶的2倍主混合和表1中列出的 pcr 程序, AAVS1_test_primers 进行 pcr。
   4. 在2% 琼脂糖凝胶上运行 pcr 产品, 并根据制造商的协议使用凝胶提取试剂盒对268个基对带进行凝胶纯化。桑格使用 AAVS1_target-框架 _ f 引物对凝胶纯化的 pcr 产物进行排序。
   5. 使用基于 web 的在线工具对 aavs1 编辑的序列和野生类型序列进行比较, 评估编辑效率 (图 2)。

2. 在 aml-cas9 细胞中的 sgrna 克隆和转导

1. sgrna 的中通量克隆
   1. 使用基于 web 的 crispr 设计软件为感兴趣的基因设计 4–6 sgrna。有一些 crispr 在线设计工具, 如 http://crispr.mit.edu/根据输入 dna 序列生成 sgrna 序列。
      1. 在带有星号的字段中填写适当的信息。点击目标基因组进行 sgrna 设计。将目标序列粘贴到 "序列" 框中, 然后单击 "提交"按钮。
   2. 对于克隆在 pKLV2-pgkpuro2abfp-w sgRNA 表达质粒, 在排序前将核苷酸 "cacc" 前置入感觉寡核苷酸和 "aaac" 的反义补充。在一家寡核苷酸合成公司的96孔板上订购预混感和反义寡核苷酸, 标记为寡核苷酸混合物。
      请注意:我们已经使用了 pKLV2-pgkpuro2abfp-w 质粒, 它具有 bbsi 限制位点的 sgrna 克隆。在使用其他 sgrna 表达质粒的情况下, 用于 sgrna 寡核苷酸的悬垂需要相应地改变。
   3. 取一个单独的 u 底部96孔板标记退火板。主混合 1μl t4 pnk, 1μl 的 10倍 t4 dna 结扎缓冲液和6μl 的水, 每次退火反应。
   4. 在退火板的每口井中加入8μl 的主混合物。在主混合物中加入1μl 的 100μm, 感觉和反义寡核苷酸 (或2μl 的混合感觉反义寡核苷酸)。移液器2-3 轻轻混合好, 简单旋转板, 使混合物到井底。
   5. 在 pcr 机器上使用以下退火程序: 37°c 时 30分钟, 95°c 时 2分钟 30秒, 0.1°c 的速度缓慢冷却至22°c。退火后, 取一个新的96孔板标记稀释的 OligoMix。在这个板中, 使用多通道移液器稀释上述与水 (1: 200) 反应产生的磷酸化和退火寡核苷酸。
   6. 消化5微克的 pKLV2-pgkpuro2abfp-w 矢量与1.5 μl 的 bbsi 限制酶 (10, 000 unitss/ml) 在37°c 使用适当的缓冲液 2小时, 使其线性化, 以便以后结扎。
   7. 取一个新的96孔板标记结扎板, 并添加 20 ng 的 bbsi 消化 pKLV2-pgkpuro2abfp-w 载体到一个井每个所需的 sgrna 结扎。除此之外, 还要从稀释的低聚糖板中加入2μl 的磷酸化、退火寡核苷酸。
   8. 加入1μl 的 10倍 t4 连接酶缓冲液和1μl 的 t4 dna 连接酶。用多通道移液器轻轻移液器, 在室温下孵育结扎混合物2小时。
      请注意:结扎混合物可以存储在-20°c 的转换步骤后。
   9. 同时, 在结扎步骤结束前10分钟在冰上解冻90μl 的化学能力大肠杆菌细胞。
   10. 使用多通道移液器, 使 10μl aliquots 的主管细胞成一个单独的96井板的每口井。
   11. 将连接混合物从步进2.1.8 放入含有合格细胞的井中, 轻轻上下移液器, 在室温下孵育10分钟。
   12. 将细菌-dna 直接从上述反应混合到含有 lb-agar 的6个井板中, 并含有100μgml 氨基青霉素。对每个转换反应重复此操作。
   13. 将每个转化反应放入6孔板的单独标记的井中。在每口井中加入大约5-8 个玻璃珠, 并以圆周运动晃动整个6井板8-10 次。
   14. 用20μl 移液器尖端从每口井中选择1-2 个单一菌落, 并在10厘米的小盘上将其标记成一个精心标记的点, 配有 lb 琼脂和 100 mgml 氨基青霉素。在进入 lb 板后, 只需将用于克隆的尖端喷射到含有 lb-amicitin 的介质中的3毫升, 在一个带有相应细菌克隆编号的14毫升圆底管中。
   15. 直接发送细菌板与人类 u6 启动子前引物的桑格测序。
   16. 在克隆 sgrna 的序列确认后, 根据制造商的说明, 使用迷你制备试剂盒对相应的 14 ml 管中的 dna 进行纯化。
   17. 用分光光度计测量每个小型预浸料的浓度和质量。将每个微型准备剂归一化为 15 ngμμl 和移液器, 形成一个96孔板标记的sgrna 克隆板.
       请注意:该板可以储存在-20°c 或直接用于病毒制备。
2. sgrna 的病毒产生结构和转导
   1. 对于96孔格式的 sgrna 慢病毒颗粒的生产, 请遵循广药研究所遗传摄动平台 (gpp 门户网站) 的 "shrna\ sgrnaorf 高通量病毒生产 (96 井)" 协议 (url:http: http: http: http: http: http: http: http: http: http: http:///portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols)。
   2. 将200μl 的病毒上清液转移到无菌管中, 并立即冻结在-80°c。
   3. 第1天: 在 bsl2 细胞培养罩中, 用100μl 重组的人纤维连接蛋白片段对96孔板进行了平底非组织培养处理。用保鲜膜包裹盘子, 以避免蒸发损失, 并将其留在板凳上过夜。
   4. 第0天: 从每口井中取出重组的人纤维连接蛋白片段。在室温下解冻每个 sgrna 的病毒上清液。从每个管中加入50μl 的病毒上清液, 加入到转导板的每一包覆井中。在35°c 下将转导板旋转在 1, 300 x g处90分钟。
   5. 在喷水感染快结束时, 从培养瓶中计数 molm13-cas9 (克隆 b3) 细胞。在100μl 体积内每口使用 10, 000个细胞。计算所有转导井的细胞, 考虑到死体积。
   6. 90分钟后, 使用通过倾斜板慢慢调整为50μl 的多通道移液器从所有井中取出上清液。添加100μl 的培养的 molm13-cas9 克隆 b3 细胞到每个井慢慢从边缘滑落。
   7. 在35°c 下将板旋转在 1, 300 x g处, 5分钟, 让细胞沉淀到底部。将钢板转移到37°c 组织培养等级孵化器。
   8. 第1天: 在每口含有 sgrna 的油井中添加100μl 的新鲜培养基----molm13 或 cas9-mll-af9 白血病细胞, 使最终的培养基体积为200μl。

3. 竞争增长评估

1. 第3天: 流式细胞仪 (流式细胞仪) 检查每口井中含有 bfp 阳性细胞的 sgrna 的百分比。使用细胞活力染料标记和排除死细胞的分析。
2. 每次流式细胞仪分析后, 继续用新鲜培养基将一定比例的细胞重新植入新井中, 以避免在检测过程中出现过度生长。
3. 每2-3天重复一次流式细胞仪分析, 以检查 bfp 阳性 (bfp + ve) 细胞与 bfp 阴性 (bfp-ve) 相对细胞的相对比例 (图 3)。分析每个时间点的 bfp 阳性细胞的百分比 (使用 flowjo 或类似的 facs 分析软件)。
   1. 将每个示例的 fcs 文件拖到 flowjo 软件中。双击任何一个示例文件, 并绘制一个点印迹的正向散射 (fsc) 与侧向散射 (ssc) 与 fsc 在 x 轴和 ssc 在 y 轴上。把所有的牢房都门。
   2. 双击门控单元格, 并将其绘制在 "活力染色" (y 轴上) 与 fsc 高度 (h) 或面积 (a) 点印迹上。将活活力染色阴性 (活) 细胞门。
   3. 双击门控活单元格, 并在 x 轴上绘制 bfp (y 轴上) 与 fsc (a)。门 bfp + ve 单元。通过将所选示例拖到 "组" 选项卡下的"所有示例"中, 将所有这些门应用于所有示例。
   4. 单击"表编辑器" 以创建所有示例的分析表。将 bfp + ve计数从一个示例拖到表中, 然后单击"表编辑器" 中的"显示"按钮, 创建所有示例的批处理报告, 其中包含一个显示 bfp + ve单元格百分比的表。将表另存为 xls。
4. 计算活细胞群中 bfp 阳性细胞的比例增加或下降, 并将这一比例与对照 sgrna (如荧光素酶、拼接酶或 gfp sgrna) 中 bfp 阳性细胞的比率进行比较。
5. 绘制不同 sgrna 的 bfp 阳性细胞的比率, 包括感兴趣的基因以及以第3天为基线的对照。

结果

在我们的研究中, 我们首先转移了包含 mll-af9 病毒编码卡西-乳酸病毒质粒的 mll-af9 移位的 molm13 人 aml 细胞系。在我们手中, 散装未分类的 molm13-cas9 细胞没有显示出高水平的 cas9 表达的西方印迹, 也没有表现良好, 当检测有效的基因编辑使用上述方法⁷。因此, 我们开始建立单细胞克隆体, 只选择西方印迹所看到的高水平 cas9 克隆体 (图 1

讨论

在这篇手稿中, 我们描述了一个详细的协议, 用于进行基于 crispr-cas9 的竞争生长检测, 以研究候选基因在 aml 细胞系中的作用, 使用流式细胞仪在人/小鼠 aml 细胞中的作用 (图 5)。该分析的目的是在中等吞吐量的范围内, 确定基因缺失对维持两到三周反洗钱细胞增殖的影响。需要认真遵循一些关键步骤, 以促进扩大所述议定书的规模。在 cas9 慢病毒的生产中, 有必要通过0.45μm 过?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
FLAG-M2 Antibody	sigma-aldrich	F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody	Invitrogen	31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Fisher	34095
ChemiDoc Imaging System	BIO RAD	17001401
Sorvall Legend RT centrifuge	Thermo Scientific
Blasticidin	Thermo Fisher	R21001
SYTOX Red	Thermo Fisher	S34859
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
DMEM	Thermo Fisher	11965-092
RPMI	Thermo Fisher	11875-093
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
Fetal Bovine Serum (FBS)	SAFC	12303C
single gRNA vector	Addgene #67974	pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit	sigma-alorich	NXTRACT
XtremeGENE 9	sigma-alorich	6365787001
Retronectin	Takara	T100B
Flow cytometer	BD Biosciences
T4 PNK	NEBioLabs	M0201S
T4 DNA ligation buffer	NEBioLabs	B0202S
T4 DNA Ligase enzyme	NEBioLabs	M0202S
Ampicillin	Fisher scientific	BP1760-25
LB agar	Fisher scientific	BP9724-500
LB Broth	Fisher scientific	BP9731-500
Qiagen mini-prep kit	Qiagen	27104
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher	NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant Murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant Murine M-CSF	Peprotech	315-02
Stable competent cells	NEBiolabs	C3040I
10 cm Tissue Culture dishes	Fisher Scientific	353003
Cell lysis solution	Qiagen	158906
Protein precipitation solution	Qiagen	158910
DNA hydration solution	Qiagen	158914
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BbSI	New England BioLabs	R0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit	Genessee Scientific	42-138
Puromycin	Fisher scientific	BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495949A
15 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495970C