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Summary

该协议说明了使用组织病理学检查和免疫组织化学来描述叶酸受体β巨噬细胞及其与全免疫细胞浸润的关系, 在颞动脉活检在巨细胞动脉炎。

Abstract

巨细胞动脉炎 (gca) 是一种影响老年人的中大型动脉慢性免疫介导的疾病。gca 表现为关节炎和头痛、中风或视力下降的闭塞症状。巨噬细胞和 t 辅助淋巴细胞浸润血管壁, 产生促炎症反应, 导致血管损伤和缺血。到目前为止, 还没有 gca 生物标志物可以监测疾病活动和指导治疗反应。

叶酸受体β (frb) 是一种糖基磷脂甾醇蛋白, 锚定在细胞膜上, 通常表达在骨髓细胞系和大多数骨髓性白血病细胞, 以及在肿瘤和类风湿滑膜巨噬细胞,它的表达与疾病的严重程度有关。frb 结合叶酸化合物、叶酸结合剂和抗叶酸药物的能力使其成为癌症和炎症性疾病研究中的一个可吸毒靶点。本报告描述了组织病理学和免疫组化方法, 用于评估 frb 的表达和分布与 gca麻醉正理学。

用血红素和 eosin 对 gca 和正常对照组的福尔马林固定和石蜡包埋的颞动脉活检进行染色, 以回顾组织组织学特征并确定其病理学特征。免疫组织化学用于检测 frb、cd68 和 cd3 的表达。进行了微观分析, 以量化10个选定的高功率场部分的阳性染色细胞的数量及其各自在动脉壁的位置。

淋巴缺血细胞 (lh) 炎症伴内膜增生和弹性片受干扰在 gca 中被发现, 对照组没有发现。lh 浸润由大约60% 的淋巴细胞和40% 的巨噬细胞组成。frb 表达仅限于巨噬细胞, 占 cd688+ 巨噬细胞总数的 31%, 并局部到媒体和外膜。在控件中没有看到 frb。

该方案证明了 frb 巨噬细胞相对于 gca 血管免疫微环境的独特的数值和空间模式。

Introduction

巨细胞动脉炎 (gca) 是一种针对主动脉及其分支并影响老年人的中大动脉炎症性疾病。它表现为轻度至重度缺血性并发症, 如头痛、下巴疼痛、视力下降、中风和组织坏疽。诊断是由高炎症标志物, 如红细胞沉降率 (esr) 和一个独特的组织病理学模式的颞动脉活检 (tab)1证实。gca 是最常见的成人血管炎, 获得诊断的颞动脉的可及性比其他血管病变具有优势, 从而使人们能够更容易地研究其发病机制。tab 上的典型发现包括巨噬细胞 (巨噬细胞) 和 t 淋巴细胞浸润, 这些血管层在内膜、培养基和肌细胞的所有维度层中都有浸润, 同时破坏了通常将这些血管层分开的弹性层隔间2。目前的证据表明, gca 涉及一种未知的抗原, 它激活血管外膜中的树突状细胞, 然后招募辅助 t (th) 细胞, 特别是分泌白细胞介素-17 和干扰素伽玛 (ifg)。ifg 然后招募和激活巨噬细胞产生细胞因子和蛋白酶。这些包括促炎细胞因子;包括 il-12, 它相互激活 th1 细胞, 从而提供一个正反馈回路;肿瘤坏死因子和白细胞介素-6, 引起关节炎和发烧和金属蛋白酶, 损害弹性层。糖皮质激素 (gc) 构成标准的慢性治疗, 通过衰减 th17 il-17 而不是免疫反应的 thiifg 臂 3, 4,部分控制细胞因子通路.不幸的是, 停止 gc 导致疾病复发。作为一种替代方法, 甲氨蝶呤已被重新用于 gca 治疗, 但尽管更敏感的生物标志物尚未用于治疗监测5,6, 但所需的临床终点并没有一致实现。.2017年, 白细胞介素6阻滞剂 tocilizumab 被批准用于治疗 gca, 因为它有效地显示了疾病控制和类固醇的保护效果7,8。

到目前为止, gca 还没有很好的生物标志物。因此, 很难监测疾病活动和对现有药物的滴定剂量, 以避免不利影响, 减轻社会成本负担。因此, 必须寻找与疾病活动相关的候选生物标志物, 提供新的关于发病机制的见解, 并在治疗决策中提供帮助。

巨噬细胞活化失调是 gca 发病机制的关键因素。因此, 治疗 gca 的有效方法可能是选择性靶向活化巨噬细胞。叶酸受体β (frb) 是一种糖基磷脂酰肌醇糖蛋白, 锚定在正常粒细胞细胞、髓样白血病细胞和活化巨噬细胞中表达的细胞膜上。它的配体, 叶酸, 是一种必需的维生素, 在其减少的形式, 这使得细胞 dna 合成, 甲基化和修复9。frb 在自身免疫性疾病和癌变过程中被诱导表达。其表达仅限于类风湿关节炎单核细胞或促炎性 m1 巨噬细胞的表面, 或在固体器官和骨髓恶性肿瘤中的抗炎 m2 巨噬细胞 10, 11,12,13. 除了其作为活化巨噬细胞的生物标志物的潜在作用外, frb 还可以通过一个多步骤的过程, 从细胞内的受体与叶酸、抗叶酸或叶酸结合药物开始, 从而实现选择性药物运输表面, 然后将所需药物内化、释放并最终输送到内部细胞机械 12、14、15、16.与 frb 在癌细胞和活化巨噬细胞中表达相比, 在正常造血细胞中表达的 frb 无法结合叶酸, 从而确保 frb/folt 介导的药物传递仅限于 frb 阳性炎症或癌细胞。

在我们之前的研究中, 我们首次证明了 frb 在 gca 巨噬细胞中的表达, 其表达与 cd688+ 和内皮素受体β巨噬细胞相关, 这对 gca 的发病机制17有一定的贡献。在本报告中, 我们描述了用于评估 frb 巨噬细胞的组织病理学和免疫组织化学方法, 并分析了总淋巴细胞和巨噬细胞计数, 以深入了解 frb 在 gca 血管景观中的位置。

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Protocol

所述所有方法都得到了宾州机构审查委员会的批准。

1. 获得时间动脉活检后的组织病理学准备及处理

请注意:颞动脉活检 (tab) 是在局部麻醉和无菌条件下由认证的外科医生进行的。手术后, 获得3厘米动脉部分在受影响较大的一侧, 标本被固定在福尔马林立即 24小时, 分为3至4毫米的部分, 并嵌入石蜡, 注意适当的对齐组织在块然后在室温下储存。样本选择是在验证病历后进行的。诊断是基于1990年美国风湿病学院的标准, 要求研究对象满足5个领域中的3个领域: 年龄和 gt;50 年、新头痛、颞动脉压痛、红细胞沉降率 & gt;50 mmm/gn 方法和一个不正常的 tab。为了安全起见, 在处理标本、化学品和抗体时, 必须始终佩戴防护手套。

  1. 从嵌入块中, 使用微孔切割4-5 微米厚的部分。和染色与血红素和 eosin (h & e)。使用选定正常组织的控制部分进行质量保证。
  2. 在加热至40°c 的温水浴上漂浮切割部分, 以消除皱纹, 并拿起涂层玻璃微观幻灯片。 将玻璃滑块放在60°c 烤箱中的热板上 60分钟, 以便干燥和将部分粘附在滑块上。
  3. 将玻璃滑块放在60°c 烤箱中的热板上 60分钟, 以便干燥和将部分粘附在滑块上。
  4. 在显微镜幻灯片上安装3个部分。
  5. 将滑梯放置在垂直机架中, 并在37°c 下过夜24小时。
  6. 将幻灯片放入容器中, 并存放在4°c。

2. 免疫组织化学制剂、脱蜡、抗原回收和染色15、18、19、20

  1. 将幻灯片加载到幻灯片机架中。运行机架通过菜式如下: 两次在100% 二甲苯 5分钟, 每30秒的温和搅拌 10秒, 一次在100% 乙醇与10秒的搅拌, 一次在90% 乙醇与10秒搅拌, 一次在70% 乙醇与10秒搅拌, 并在双蒸馏 h2o 与10秒的搅拌。
    注: 处理二甲苯和丙酮应在通风罩中进行, 以避免吸入和呼吸毒性。
  2. 将机架转移到一个玻璃容器中, 该容器的温度为 200 ml, 为 10mmol, ph 6.0 柠檬酸缓冲液预热至95°c。在水浴中设置计时器 30分钟, 然后在室温下冷却 20分钟, 然后用自来水冲洗5分钟。
  3. 在3% 过氧化氢的200毫升中孵育 10分钟, 去除内源性过氧化物酶活性。在200μl 的三缓冲盐溶液 (tbss) 中清洗滑块3次。
  4. 从机架上取下幻灯片, 轻轻轻拍每张幻灯片, 擦拭多余的缓冲液。对于染色, 添加以下主要抗体 200μl, 在幻灯片上添加盖板, 并在潮湿的室内孵育 1小时, 在室温下:
    抗 frb 抗体稀释1:800
    单克隆小鼠反人类 cd68, 1: 200 稀释
    多克隆兔抗 cd3 1:100 稀释
    注: 胎盘福尔马林固定石蜡嵌入部分也按照步骤2.1 至2.9 中的规定进行处理, 并用抗 frb18 孵育, 并用作阳性对照。染色结果是通过寻找最佳抗体浓度获得的, 是通过用双稀释法滴定抗体来实现的 (例如, 1:50、1:50、1:50、1:50、1:50、11600)。
  5. 孵育后取下盖板滑移并丢弃。用 tbss 冲洗滑块 3次, 每次 2分钟, 排出多余的缓冲液。
  6. 加入含有生物素化抗兔子类二级抗体的200μl 二级抗体溶液, 与与组织抗原结合的非共轭原代抗体发生反应。将盖板放在滑梯上, 在潮湿的室内孵育45分钟。
  7. 孵育后取下盖板滑移并丢弃。用 tbs 冲洗滑块 3次, 每次 2分钟, 排出多余的缓冲液。
  8. 加入200μl 的二胺苯胺 (dab) + 底物缓冲液 (咪唑 hcl)-铬原系统, 孵育 10分钟, 以显示染色模式。用 tbss 清洗, 然后在自来水中清洗10分钟。
  9. 用血红素进行3分钟的反染色。
  10. 通过将70μl 的安装介质应用到滑块表面来安装幻灯片。慢慢地将盖板倾斜到安装介质上, 并避免在降低其位置时产生气泡。等待24小时才能干燥。

3. 病理组织学和免疫组织化学 (ihc) 分析

用光学显微镜检查 gca 阳性和正常受试者的 h & e 和 ihc 染色切片。

  1. 对于 h & e 染色部分:
    1. 评估血管结构, 识别内皮细胞内膜, 平滑肌细胞中的 tunica 培养基, 以及外膜炎 21,22的成纤维细胞和血管。
    2. 识别 gca 特征, 包括淋巴细胞和巨噬细胞浸润、细胞增生和内部弹性层的降解。
    3. 通过识别和定量分析与淋巴细胞相关的巨噬细胞数量, 分析淋巴血细胞浸润。评估内弹性层块破坏和常驻细胞增生变化的程度, 并与对照进行比较。
  2. 对于 ihc 染色部分:
    1. 检查 frb 的染色模式, 注意其按特定类型或类型的细胞的表达, 其在血管层中的分布, 以及它与总免疫浸润、总巨噬细胞标记、抗 cd68 和平底锅的关系淋巴细胞标志物抗 cd3。
    2. 通过计算10个随机选择的高功率场 (hpf) 上的阳性染色细胞, 量化 frb、cd68 和 cd3 细胞的表达, 并记录其表达方式。
      请注意:这些正常和病理细胞和结构的鉴定是由一个认证的心血管病理学家 (j. m.) 和风湿病学家 (s. a. a.) 进行的, 结果记录在所有病例。
    3. 使用数码相机捕获代表性图像。
      请注意:完成这些步骤后, 剩余的等价物可存储在-80°c。

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Results

病理组织学发现

正常标本中的 h & e 染色显示正常动脉解剖, 内膜内皮细胞, tunica 培养基中的平滑肌细胞, 以及包括成纤维细胞和供体血管的异质胶原蛋白基质, 称为 vasa vasorum在 tunica 外膜。没有发现炎症浸润。gca 正颞动脉表现为中度至重度炎症, 具有巨噬细胞、淋巴细胞、偶尔的浆细胞和多核巨细胞聚集。注意到?...

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Discussion

gca 是成人中最常见的血管炎, 其病理特征体现了 t 辅助淋巴细胞和活化巨噬细胞的有力组合, 也可以在其他肉芽肿性疾病或血管病, 如结节病和肉芽肿性多血管炎2,3。在 gca 中, 颞动脉提供了一个中到大大动脉的良好表示, ta 活检提供了一个相当大的样本, 可以存储在石蜡块多年, 从而创造了机会, 研究新兴诊断和像 frb 这样的治疗靶点在血管微环境中。我?...

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

这项工作是在道格拉斯·斯泰尔博士、玛丽安·克林格、安·本科、风湿病系/医学司以及宾州立大学医学院分子和组织病理学核心实验室的支持下得以完成的。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MicrotomeReichert-Jung
plain and frosted microscope slides and cover slipsFisher Scientific 
Vertical rackFisher Scientific 
Light microscopeOlympus BX60  microscope
Xylene
Acetone in distilled waterconcentrations 100%, 90%, 70%
Tris-buffered saline solution (TBS) Dako Wash BufferS3006
3% hydrogen peroxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB)Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  Mounting MediumFisher Scientific SP-15-100
Harleco Gill's III HematoxylinFiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock SolutionFisher Scientific 23-749-977
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta Manohar Ratnamoptimized at 1:800
Monoclonal mouse anti-human CD68Dako M071801optimized at 1:200
Polyclonal rabbit anti-CD3Agilent DakoA0452optimized at 1:100
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibodyDako
Placental tissue for FRB positive control

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