利用 nlsgps1 förster 共振能量转移 (fret) 生物传感器可视化细胞赤霉素水平

摘要

赤霉素感知传感器 1 (gps1) 是第一个用于测量具有高时空分辨率的赤霉素植物激素细胞水平的 förster 共振能量转移基生物传感器。该协议报告了利用拟南芥下胚和根尖的基因编码 nlsgps1 生物传感器对细胞赤霉素水平进行可视化和量化的方法。

摘要

植物激素赤霉素 (ga) 是一种小型的移动信号分子, 在植物的种子萌发、细胞伸长和发育转变中起着关键作用。gibberellin 感知传感器 1 (gps1) 是第一个基于 förster 共振能量转移 (fret) 的生物传感器, 可以在体内监测细胞 ga 水平。通过测量核定位-gps1 (nlsgps1) 的荧光发射比, 在不同组织类型的内生和外源性遗传算法梯度的时空映射在细胞尺度上是可行的。该协议将描述如何在三个例子实验中成像 nlsgps1 的发射率: 稳态、前后外源赤霉素 a₍ ga₄) 处理, 以及整个处理时间过程。我们还提供了使用斐济和商业三维 (三维) 显微图像可视化和分析软件分析 nlsgps1 排放率的方法, 并解释了使用 nlsgps1 量化赤霉素水平的局限性和可能的陷阱。

引言

植物激素在植物生长发育中发挥着根本的作用。这些小的、移动的信号分子通常在几个层面上进行调节, 如生物合成、分解代谢和短距离和远距离传输^{1、2、3、4}。多年来, 对激素信号转导途径和下游转录反应的理解更加敏锐。然而, 要将激素信号通路的不同细胞反应与调节输入引导激素分布联系起来, 我们需要在细胞规模上对激素水平进行时空定量。基于 fret 的生物传感器, 可以检测植物激素可以提高科学家的能力, 量化激素水平的细胞规模。基于 fret 的生物传感器由 fret 对 (供体和受体荧光蛋白) 组成, 该组合与连接特定配体或响应生物刺激的感觉域相连。对于小分子生物传感器, 配体结合触发感觉域的构象变化, 导致 fret 对的两个荧光蛋白之间的距离和/或方向的变化。通过激发供体并测量受体在供体^5,6 上的荧光发射比, 完成了 fret 生物传感器的比率分析。配体结合可作为这一排放比的变化 7。

我们最近开发了一种基于 fret 的植物激素 ga 生物传感器, ga 是一类激素, 可以促进种子萌发、细胞伸长, 以及从植物到开花阶段的发育转变。nlsgps1 生物传感器是核局部的, 并提供了对不同植物组织中 ga 动力学的时空洞察。在拟南芥细胞中, ga 与可溶性受体、赤霉素不敏感的矮人 (gid) 结合, 而这种复合物会诱导 della 蛋白的降解, della 蛋白作为 ga 信号²的负调节剂。nlsgps1 的 ga 感官域由拟南芥ga 受体 (AtGID1C) 组成, 该受体与 della 蛋白 (atgia) 的 74-氨基酸截断和由增强的 cerulean 的增强型二聚化变种组成的 fret 对作为供体荧光蛋白和阿芙罗狄蒂 (一个二氧化碳多样化的金星) 作为受体荧光蛋白⁸。nlsgps1 生物传感器是一种用于生物活性 ga₄ (k_d = 24 nm_{为 ga 4}) 的高亲和力传感器, 可用于不同的组织类型, 以绘制和量化 ga 梯度。为了避免在体内对拟南芥ga 水平的误解, 我们还开发了一种无响应的 nlsgps1 (nlsgps1-nr) 变种, 作为负对照。nlsgps1-nr 蛋白携带的突变在 ga 结合口袋中, 破坏 ga 的结合和 della 蛋白的突变, 破坏与 gid 受体蛋白的相互作用^7,9。在 nlsgps1 和 nlsgps1-nr 线路中观察到的排放比模式或变化可被视为与 ga 约束事件没有直接关系的文物。还必须指出的是, nlsgps1 与 ga₄的结合不是快速可逆的, 因此, 细胞 nlsgps1 的排放比率应被解释为代表特定核中 ga 最近的最高浓度, 而不是实时的稳态水平。因此, nlsgps1 无法对遗传算法水平的下降进行分析。

在这里, 我们提供了一个详细的协议, 用于利用 nlsgps1 生物传感器的模型植物拟南芥的细胞, 使用共聚焦图像为基础的方法在高分辨率。该协议提供了关于在稳定状态和时间过程中的植物根系和下胚轴的成像信息。nlsgps1 传感器有可能被用于不同的组织类型, 以及跨植物物种, 以绘制和量化 ga 分布。

研究方案

1. 准备工作

1. 准备半 murashige 和 skoog 琼脂 ph 5.7, 没有蔗糖 (1 l)。
   1. 在950毫升的超纯水中溶解2.2 克的 murashige 和 skoog (ms) 基部培养基。使用 5m koh 将 ph 值调整为5.7。
   2. 用超纯水弥补最终体积为1升的溶液。把它分成两个500毫升的瓶子, 每个瓶包含1% 的植物琼脂。在121°c 下的高压灭菌器20分钟。
2. 在 ph 5.7 处制备 ms 液体, 不含蔗糖 (1 升)。
   1. 在950毫升的超纯水中溶解 1.1 g ms。使用 5m koh 将 ph 值调整为5.7。用超纯水弥补最终体积为1升的溶液。把它分成两个500毫升的瓶子。在121°c 下的高压灭菌器20分钟。
3. 准备 ga₄。
   1. 将 ga₄溶解在乙醇中 70%, 使最终浓度为 100 mmga₄库存。
   2. 要准备工作溶液, 请将 ga₄库存稀释至 0.1–1μm, 以 1 ms 液体 ph 值5.7 为。

2. 植物生长

1. 对拟南芥种子进行消毒。
   1. 使用化学引擎盖工作。将液体种子 (约200个种子) 放入2毫升微离心管中。使用具有耐氯油墨的标记, 并将带有开口盖的管子放置在灭菌容器内 (一个可以密封的大盒子)。
   2. 将含有50毫升超纯水和50毫升次氯酸钠溶液的250毫升烧杯放在灭菌容器内。
   3. 在烧杯中加入3毫升浓缩盐酸 (hcl)。立即密封容器, 并允许用氯气灭菌6-16小时。
   4. 打开容器后, 关闭种子架中所有微型离心管的盖子。灭菌种子可以干燥储存, 直到电镀时间。
2. 在半 ms 琼脂方板上播种约20个消毒的拟南芥种子。用多孔手术胶带密封板材, 并用铝箔包裹板。在4°c 下将其培养1-3天进行分层。
3. 对于根系成像, 将板转移到垂直位置的生长室 3天, 具有以下生长条件: 长天条件 (ld, 16小时的光/18小时的暗色);120μmol^m-2s-1光强;温度 22°c (在光循环期间) 或 18°c (在黑暗周期), 65% 相对湿度 (rh)。
4. 对于深生长的下胚轴: 将板转移到生长室, 以获得1–4小时的光脉冲, 使萌发同步。用铝箔包裹板材, 并将其放置在生长室的垂直位置3天。

3. 样品制备

1. 稳态测量 (图 1 a)
   1. 在清洁显微镜幻灯片上, 加入50μl 的 m s 液体 (从现在起称为模拟溶液)。轻轻地将表达 nlsgps1 的幼苗从板材转移到滑块上。
   2. 取一张干净的盖板, 在盖板的每个角落发现一滴真空油脂。轻轻地将盖板放在幼苗上, 并小心添加额外的模拟溶液, 以去除任何气泡。
2. ga₄处理: 化学交换实验 (图 1b).
   1. 在 ga₄处理之前, 使用充满真空润滑脂 (连接到管道尖端) 的20毫升注射器在干净的玻璃滑块上绘制一个矩形 (长度: 3.5 厘米, 高度: 2.5 厘米), 并在干净的玻璃滑块上涂上一层均匀的真空润滑脂 (图 1 b)。为了允许细线的真空润滑脂, 应切割管道尖端, 使其开口直径为1毫米。
   2. 在玻璃滑块中加入50μl 模拟溶液。用干净的钳子, 摘下 nlsgps1 幼苗, 轻轻地将它们放在模拟溶液中。为了防止任何损坏, 通过支持子叶的下侧转移幼苗, 而不用钳子抓住幼苗。
   3. 取一张干净的盖板, 在盖板的每个角落发现一滴真空油脂。使用钳子, 将盖板放置在真空润滑脂矩形的中心。现在, 盖板被密封在与真空润滑脂矩形的长边相对应的两侧。
   4. 小心添加额外的模拟溶液, 以填补水库和清除水库内的任何气泡, 而不会干扰内的幼苗。
   5. 使用共聚焦显微镜在 ga₄治疗前采集图像。按照本协议第4节中所述的说明进行操作。
   6. 对于 ga₄处理, 将显微镜幻灯片从共聚焦阶段取出。设置一个20分钟的计时器。
   7. 启动计时器后, 将缓冲液与含有 1μm ga₄的培养基 s 液体交换。从盖板左侧添加 ga₄溶液 (约 50μl), 并从右侧取出以前的 (模拟) 溶液。继续交换解决方案, 完全替换模拟解决方案, 这大约需要 10分钟 (图 1b)。
   8. 将玻璃滑块放回显微镜舞台上。再等 10分钟, 然后再获取 ga 后的图像。
3. 为感兴趣的组织设置时间路线
   请注意:例如, 感兴趣的组织可能是下胚轴或根。我们经常使用商业灌注系统 (图 1c, 见材料表) 或屋顶芯片 7^、10、11进行成像 nlsGPS1 生物传感器的时间课程.
   1. 在粘片的灌注通道中心添加200μl 模拟溶液 (见材料表)。轻轻采摘 nlsgps1 幼苗, 并将其放置在在贴纸上的模拟溶液中。
   2. 使用钳子, 轻轻地放置玻璃盖板, 并使用钳子的背面, 轻轻按压盖板的外缘, 使其与粘性滑块外围的粘性材料形成牢固的粘结。
   3. 使用两个弯头 luer 连接器 (内径 [id] 0.8 mm) 和硅胶管 (id 为 0.8 mm), 将粘滑块连接到20毫升注射器和收集流出溶液的出口容器。使用 luer 锁接头 (id 为 0.8 mm) 将注射器连接到硅胶管。
   4. 手动轻轻按下装有模拟溶液的注射器, 让足够的溶液通过腔内, 使腔内没有气泡。将注射器放在可编程注射器泵上并按住。
   5. 根据泵提供的手册, 设置特定于所用注射器的泵参数 (即直径和体积) 以及流量。
      请注意:在该协议中, 采用了 1-3 mlh 的流速, 可以根据实验要求进行改变。启动泵启动时间过程。
   6. 对于在一段时间内进行的 ga 4 处理 (图 1c), 通过暂停泵_停止灌注, 并更换一个新的包含-mms 液体并辅以 ga₄的注射器。如下一节所示, 继续进行共聚焦成像。

4. 显微镜检查

请注意:我们进行共聚焦激光显微镜。

1. 使用配备激光的共聚焦显微镜采集图像, 以进行 fret 成像。
   请注意:对 nlsgps1, 对青色荧光蛋白 (cfp) 和黄色荧光蛋白 (yfp) 的变种进行了成像。在本协议中, 商用显微镜 (见材料表, 列为显微镜1和 2) 用于10倍或20x 干0.70 谐波化合物 plan apo 目标。
2. 对于显微镜 1, 分别使用 448 nm 和 514 nm 波长激光来激发 cfp 和 yfp。获取顺序扫描。设置检测器 (例如, hyd smd), 以检测460–500纳米的 cfp (供体排放) 和525–560纳米的 yfp (fret 排放) 后的 cfp 激发。使用第二个序列, 设置一个检测器, 以检测525–560纳米的 yfp (yfp 发射) 后, yfp 激发。
   请注意:这种 yfp 荧光被用作表达式控制, 以及在分割原子核, 以生成表面使用商业三维显微图像可视化和分析软件。
3. 对于显微镜 2, 分别使用440纳米和 514 nm 波长激光线激发 cfp 和 yfp。获取两个轨道。对于轨道 1, 设置探测器 (如chs), 以检测464-500 纳米的 cfp (供体排放) 和 526–562 nm 的 yfp (fret 排放) 后的 cfp (fret 排放)。对于轨道 2, 设置一个检测器, 以检测 526–562 nm 的 yfp (yfp 发射) 后, yfp 的激发。
   请注意:这种 yfp 荧光被用作表达式控制, 以及在分割原子核, 以生成三维可视化和分析软件中的表面。
4. 使用 512 x 512 像素的格式和12位的分辨率获取图像。
5. 增益需要调整到经验确定的值, 该值允许一个好的信号, 而不是饱和像素。在实验中, cfp 和 fret 发射之间的增益不应改变。将针孔设置为1个通风单元 (au)。将 bidi 粘滑块放置在共聚焦显微镜的阶段, 并进行前面所示的成像。
6. 在显微镜1软件中, 在主动实时扫描中, 利用位于图像屏幕左上角的发光, 以确定感兴趣区域的曝光不足和饱和度。在显微镜2软件中, 使用位于图像屏幕底部的范围指示器来确定感兴趣区域的曝光不足和饱和度。对于任何定量图像分析, 都不应该有像素饱和度。
7. 将 z 堆栈设置为1μm 的步长。可以减小步长以提高 z 分辨率, 也可以增加步长以提高采集速度或增加可成像的位置样本数量。对于自动时间过程, 请将时间与 z 堆栈 (来自采集模式选项卡的 xyzt 模式) 一起设置, 以便在设定的时间间隔内获取图像。

5. 利用斐济进行图像分析

请注意:使用 imagej (斐济) 可以处理成像数据, 并产生拟南芥幼苗 nlsgps1 排放率的二维 (2-d) 图像。有关图像的示例, 请参见图 2a、 2A、 2A、 2A和3a。在 imagej 中, 可以使用搜索功能找到此协议的每个命令。按计算机键盘上的空格键和 l 。将打开一个新窗口;在搜索字段中键入所需的命令。

1. 将文件 (. lif 或. lsm 文件) 拖到斐济 (图像 j) 中, 并将图像作为超堆栈打开。
2. 从主菜单中选择 "图像>堆栈> z 项目", 然后选择"求和切片"以捕获所有像素, 而不仅仅是 "最大投影" 中的最亮像素。
3. 从主菜单中选择 "处理>减去背景",并将滚动球半径设置为50像素。取消选择任何其他选项并处理所有三个图像。此步骤使用 "滚动球" 算法删除背景。
   注:根据经验确定50像素包括原子核作为前景。
4. 从主菜单中选择 "图像>颜色>拆分通道"。将打开三个新窗口: c1-sum (cfp 通道);c2-sum(fret 通道) 和c3-sum (yfp 通道)。
5. 选择c3-sum窗口, 然后从主菜单中选择 "过程>筛选器 > 高斯模糊" , 并应用高斯模糊1以降低图像噪声。
6. 从主菜单中选择 "图像" > 调整 > "亮度对比度", 然后选择 "自动"。
7. 从主菜单中选择 "处理 > 增强对比度",然后将 "饱和= 0.35" 设置为 ""。
8. 从主菜单中选择 "图像>类型" > 8位,然后将堆栈转换为8位图像.
9. 从主菜单中选择 "图像>调整>自动本地阈值"。在"自动本地阈值" 中, 选择以下参数: phansalkar 方法、半径 = 15、参数 1 = 0、参数 2 = 0和白色堆栈。在此步骤中, yfp 堆栈用于制作二进制掩码。
10. 选择c2-sum窗口, 然后从主菜单中选择 "处理>筛选器" > 高斯模糊,然后应用高斯模糊1。
11. 选择c1-sum窗口, 然后从主菜单中选择 "处理>筛选器" > 高斯模糊,然后应用高斯模糊1。
12. 要从两个通道创建排放比堆栈, 请从主菜单中选择 "处理>图像计算器"。在将出现的新窗口中, 选择c2-sum作为图像 1, 选择"除作为运算符", 然后选择c1 和作为图像2。
13. 请确保选择 "创建新窗口和32位格式"。将出现一个名为c2-sum 的结果的新窗口。
14. 从主菜单中选择 "图像 > 查找表" > lut 16_colors。
15. 从主菜单中选择 "处理 > 图像计算器"。在将出现的新窗口中, 选择c2-sum 的结果作为图像 1, 选择"乘法作为运算符", 然后选择c3-sum作为图像2。在此步骤中, yfp 二进制掩码与 yfp/cfp 堆栈相乘, 仅显示 yfp 控制通道中存在的像素。
16. 从主菜单中选择 "进程>数学>除法",并将值设置为255。在打开的新窗口中, 选择 "是" 以分析堆栈中的所有图像。将出现一个名为c2-sum 结果的新图像。
17. 从主菜单中选择 "图像" > 调整 > "亮度/对比度", 然后选择 "自动"。
18. 从主菜单中选择 "处理 > 增强对比度",然后选择 "饱和类型 = 0.35"。
19. 从主菜单中选择 "图像" > 调整 > "亮度/对比度",并设置最小值和最大值以捕获 ga 分布。可选步骤: 从主菜单中选择"分析 > 工具 > 校准栏和显示 lut 校准栏", 并将c2-sum 的结果结果保存为. tiff 文件。
20. 若要获取排放比率的值, 请从主菜单中选择"分析 > 集测量", 然后选择"平均值"和"标准偏差"。
21. 从工具栏中选择矩形形状并绘制感兴趣的区域 (roi)。从主菜单中选择 "分析 >测量". 一个新窗口将报告所选投资回报率的平均值。
22. 将获得的值复制并粘贴到电子表格软件 (例如, excel 或起源 pro) 中, 并为 ga₄前后的处理实验制作直方图, 或为时间过程实验制作折线图。

6. 使用三维可视化和分析软件进行图像分析

请注意:使用选定的软件 (见材料表) 的优点是对对象 (例如, 原子核) 进行分割, 并从共聚焦 z 堆栈创建三维图像。有关图像的示例, 请参见图 2F、 2F、 2f、2F和3b。

1. 打开软件并导入文件 (. lif 或. lsm 文件)。
2. 基于控制 yfp 发射通道的分段原子核, 使用曲面向导。分割对象被称为 "曲面"。此分割步骤允许将细胞核中的所有体素作为一个对象进行分析, 同时消除细胞核外的体素的背景。
3. 在 "曲面" 向导中, 将背景减法 (局部对比度) 设置为 3μm, 将阈值设置为默认值。掩卡 cfp 发射 (供体励磁供体发射 [dxdm]) 和 fret 发射 (供体励磁受体发射 [dxam]) 通道基于使用 yfp 发射 (受体激励受体发射 [axam]) 通道创建的表面。
4. 使用扩展xt 平均强度比计算供体激发受体发射除以供体激发供体发射 (dxam/dxdm) 在两个通道中各个表面的平均强度值之间的比率。
   请注意:此扩展可在线下载。
5. 要使用 nlsgps1 发射率为各个曲面着色, 请选择带有统计信息的颜色编码, 该编码表示为色轮图标。选择"平均强度比率"作为统计类型。
6. 从表中导出各个值的比率, 该比率位于 "统计"图标下。
7. 将这些值复制并粘贴到电子表格中, 并为前后 ga₄处理实验制作直方图, 或为时间过程实验制作线性图。

7. 统计分析

请注意:有关 nlsgps1 排放比的蜂量和框图, 请参见图 3d 。

1. 打开软件, 将原子核表面的发射率粘贴为 y 柱。
2. 选择感兴趣的列, 然后选择 "统计" > 统计说明> "规范化测试", 以了解示例是否正常分布。运行 "正则测试", 将打开一个新窗口并报告结果。
3. 如果样本是正常分布的, 请使用t检验作为统计测试。选择"统计 > 假设测试" > "行" 上的"两个样本 t 测试", 然后运行t检验。
4. 如果样本通常不分布, 请选择"统计 > 统计假设测试" > 方差的 "两个样本测试",以了解样本之间的方差是否有显著差异。
5. 如果方差没有显著差异, 请使用曼-惠特尼 u 测试作为统计测试。选择"统计 > 非参数测试>曼诺-惠特尼测试并运行测试。
6. 如果方差有显著差异, 请使用kruskal wallis 方差测试作为统计测试。选择"统计 > 非参数测试> kuskal wallis 方差分析测试并运行测试。

结果

使用 nlsgps1, 可以测量细胞 ga₄水平的组织中的荧光成像, 包括根尖和深生长的下胚轴 (图 2)。在拟南芥根中, nlsgps1 的排放率梯度表明分生组织和分裂区的 ga 水平较低, 后期伸长区的 ga 水平较高 (图 2 a 和2A)。相反, 在 nlsgps1-nr 根中没有观察到排放比梯度, 这表明内生 ga 梯度不是人工制品 (图 2c和2d)。在暗长下轴也形成了 nlsgps1 的排放比梯度, 子叶和顶端钩的水平较低, 下胚轴基部的水平较高 (图 2e和2E)。相反, 在 nlsgps1-nr 下胚轴中没有观察到排放比梯度 (图 2g和2G)。在拟南芥根和深生长的下胚轴细胞中, 内源性 ga 积累与细胞伸长率相关。

此外, 与拟南芥根_的分割区 (图 3) 相比, 外生提供的 ga 4 优先积累在伸长区 (图 3), 表明 nlsgps1 可用于研究内生和外源 ga模式。

在时间过程实验中, nlsgps1 幼苗被放置在粘滑室中, 并与 0.5 ms 液体灌注, 然后用0.1 微米 ga₄进行30分钟的处理。视频显示, 与分割区相比, 外源 ga₄在根部伸长区的积累速度更快 (视频 1)。

图 1: 共聚焦成像的样品制备.这些面板显示了样品制备的示意图, 为 (a) 一个稳态实验, (b) 前后前后外源 ga₄处理, 和 (c) 处理时间过程实验使用粘滞幻灯片 (c)。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:拟南芥根和暗生生长的下胚轴的 ga 梯度.利用 imagej 软件对 (a) nlgps1 和 (c) nlgps1-nr 根的二维图像进行了分析, 并使用商业三维分析了 (b) nlsgps1 和 (d) nlsgps1-nr 的三维图像图像分析软件。这两种分析均显示拟南芥根系内生 ga₄梯度。利用 imagej 软件对 (e) nlsgps1 和 (g) nlgps1-nr 暗生子的二维图像进行了分析, 并利用商业三维图像分析软件。这两种分析都显示了暗长下胚轴的内源性 ga₄梯度。lut 条显示 nlsgps1 排放率的假着色。yfp 图像报告为表达式控件。利用两个阶段位置获得低聚糖图像。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 根系外源 ga 梯度.前两个面板显示 (a) nlsgps1 根的二维和 (b) 三维图像之前和治疗后20分钟的外源 ga 4 ( 1μm)。yfp 图像报告为表达式控件。最后两个面板显示 (c) 延伸区 (用白色框架定义的区域) 的 nlsgps1 发射率的平均值和标准偏差以及 (d) vesw前夕 (d) nlsGPS1 辐射比的框图。在伸长区, gga 4 处理后 nlsgps1 的排放率显著高于 (mann-whtney u 试验, * * * p-值 < 0.0001)。请点击这里查看此图的较大版本.

视频 1: 用粘滑对 nlsgps1 根进行灌注实验.这段视频显示了 nlsgps1 与 0.5 ms 液体完美结合并用 0.1μm ga₄处理30分钟的三维图像。在时间过程中, 每10分钟获得成像 3小时, 每次时间间隔如下: 30分钟模拟溶液 (帧 t = 1, t = 2, t = 3), 30分钟 ga 4 处理 (帧t = 4 , t = 5, t = 6), 2小时的模拟(框架t = 7 到t = 18) 解决方案。在采集之前, 样品与模拟溶液完美结合 2小时,请点击这里查看此视频。(右键单击下载.

讨论

基于 fret 的 ga 生物传感器 nlsgps1 为多细胞植物中 ga 激素梯度的研究和测量提供了一种定量方法。基于 fret 的生物传感器可以通过质谱法的质谱和转录记者间接测量或基于信号蛋白降解的方法¹², 改进的时空分辨率来量化动力学. ^13岁不同组织类型的高分辨率细胞成像可以对 ga 生物学产生有意义的洞察, 并引发关于多细胞环境下 ga 积累的调节和功能的新假设。例如, 监测 nlsgps1 生物传感器在特定 ga 生物合成、分解代谢和传输突变体中的变化, 以及在时空诱导的扰动过程中的变化, 对于测试遗传算法梯度是如何建立在根和地址根细胞对 ga 梯度的响应。该传感器可用于其他模型和作物品种, 以测试控制 ga 介导的种子萌发、细胞伸长和开花控制的机制的保存。

基于 fret 的 nlsgps1 生物传感器成像的关键步骤是, 1) 在定量 fret 分析过程中像素不应饱和, 2) "检测器增益" 等成像参数对于供体发射 (dxdm) 和受体排放 (dxam) 收购, 3) 控制 nlsgps1-nr 线应用于排除文物, 4) 样品应准备尽量减少漂移和焦点变化问题。此外, 生长样品的环境条件对控制很重要, 因为 ga 水平对环境条件 (如光持续时间和光强 14^{、15、16) 很敏感,17岁}。这类分析的一个关键限制是, 由于比率成像中固有的噪声增加, 成像需要较高的信噪比。因此, nlsgps1 成像对于不适合使用氰化物和黄色荧光蛋白的比例荧光显微镜的组织和器官将没有用处, 例如, 在荧光蛋白检测不良的较深组织。另一方面, 比强度读数更受欢迎, 因为内部控制有助于排除特定细胞、组织中生物传感器表达、稳定性、亮度或可探测性变化所产生的文物, 或条件。例如, fret 生物传感器成像和图像分析也被用来研究各种组织中的各种配体^{5,6, 18,19}, 20^,.这里报道的成像实验和图像分析可以进行修改, 以适应新的成像方法, 如光片显微镜, 可以产生新的见解, 例如, 在更深层次的根组织类型。

第一代 nlsgps1 生物传感器是一种高亲和力传感器, 它提供了 ga 梯度的高分辨率贴图, 它还可以报告外源 ga 处理后 ga 细胞内的增加情况。nlsgps1 目前的局限性之一是传感器不能迅速逆转, 因此, 报告不是在稳态 ga 水平上, 而是在感兴趣的溶液中最近最大的 ga 浓度。传感器的精确周转率也不清楚, 这一点, 再加上可逆性低, 排除了检测可能在几分钟到几小时内发生在某些组织类型中的内源性 ga 释放。还需要注意的是, 在成像其他生物活性 ga ^{时, nlsgps1 与其他 ga 形式 (ga 3k d = 240 nm、ga 1 k d = 110 nm) 相比, 对 ga 4 (k d = 24 nm) 具有较高的亲和力7}. 遗传算法生物传感器的后代可以在保持高度亲和力的同时提高可逆性, 或对各种前体、生物活性或分解代谢 ga 表现出不同的特性。 

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds	NASC	N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds	NASC	N2107735
Gibberellin A4 (GA4)	Sigma	G7276	dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach)	Fisher S/5040	HSRA 064
Hydrogen cloride HCl	Sigma	31434
Micropore tape	3M	1530-1
ibidi sticky-slide	Ibidi	81128	Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide	Ibidi	80168	Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides	Ibidi	10812
Elbow Luer Connectors	Ibidi	10802
silicone tubing	Ibidi	108401
Luer Lock Connector	Ibidi	10826
programmable syringe pump	World Precision Instruments	AL-1000
Vacuum grease	Sigma	18405
Murashige and Skoog Basal Salts	Duchefa	M0221
Agar plant, 1 kg	Melford	P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick	Fisher Scientific	12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm	Fisher Scientific	12363138
Luer-slip Syringe 20 mL	Fisher Scientific	10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape	Fisher Scientific	12787597
Potassium Hydroxide, 500 g	Sigma Aldrich	221473-500G-D
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel	Scientific Laboratory Supplies	INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel	Fisher Scientific	12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6	Ibidi	10829
Leica SP8			Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780			Confocal laser microscope 2
Imaris	Bitplane		3D visualization and Analysis software
Fiji			image analysis software
OriginPro	Origin Lab		Statistical Analysis Software