小鼠结肠吻合术的建立

摘要

手术后吻合口泄漏或破裂是术后发病和死亡的主要原因。我们的手术创建结肠吻合术是一个可靠和可重复的方法, 研究吻合术的愈合机制。

摘要

肠道吻合术通常在选择性和急诊手术中进行。即使如此, 吻合口泄漏是结肠手术中非常可怕的并发症, 可发生在多达26% 的手术吻合口, 此类口漏患者的死亡率高达39%。目前, 仍然缺乏详细说明吻合血管愈合细胞机制的数据。通过更好地了解适当的吻合口愈合, 可以大大加强吻合口泄漏的预防策略和治疗方式。

小鼠模型是理想的, 因为此前的研究表明, 与其他动物模型相比, 小鼠吻合术在临床上与人类的情况最相似。我们提供了一个易于重现的小鼠结肠吻合术模型, 这将允许进一步说明吻合口愈合。

引言

一个非常可怕的并发症的手术吻合的肠道是吻合破裂或泄漏。吻合口泄漏, 导致腔内物质溢出到腹腔, 有生命危险, 可迅速导致腹腔内败血症;小肠吻合术后的休克率从0.3% 到5.5% 不等, 结肠吻合术^的休克率上升到0.5% 至26% 之间。由于败血症迅速发作, 腹部内污染3后迅速上升至死亡, 泄漏后的死亡率可能高达 39%.预防策略和治疗方式目前是建立在病理生理学的基础上的, 而病理生理学并没有得到充分的了解。

目前, 吻合口愈合往往被比作更广泛研究的皮肤伤口愈合, 这被证明是一个相对较差的传真。愈合发生在一系列重叠阶段, 从初始滞后阶段开始。在肠道吻合术产生后的0-4 天, 滞后期的定义是急性炎症反应, 清除细胞碎片的伤口。接下来, 在3-4天的时间里, 成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的产生是成纤维相的典型。最后, 在第10天之后, 长时间的胶原蛋白重塑被称为成熟阶段。重要的是要注意, 吻合口的强度是相当低的, 取决于手术放置的订书针或缝合^线的外在支持, 直到胶原蛋白沉积4。了解肠壁每一层在吻合伤口愈合和参与炎症介导的细胞类型 (如巨噬细胞) 中的作用和时间, 以及阐明替代标记以预测吻合失败或成功的情况。大幅降低结肠手术后的发病率、死亡率和医疗费用⁵。

在以前的研究中, 小鼠模型被证明是模拟人类吻合术^的有用方法。虽然有流行的、经过验证的和经过充分研究的小鼠结肠吻合模型的例子, 特别是科明等人描述的方法.⁷、这些模型有利于回肠或上升的结肠吻合术^{技术 8}。以前对人类患者的研究表明, 回肠、结肠结肠和结直肠吻合的泄漏率存在显著差异, 这突出表明需要在不同的解剖位置建立更多的实验模型。另外, 常用的方法旨在开发一个模型, 故意造成吻合口泄漏, 而不是阐明正常吻合伤口愈合所需的细胞机制⁹。老鼠模型曾尝试过, 但吻合口裂开的比率和/或泄漏的迹象 (即脓肿形成) 明显低于人类和小鼠^6,7。此外, 小鼠的转基因实验线比老鼠多。这使得大鼠模型对吻合模型不太有用。此外, 猪和犬模型的临床调查也比^{6、7 型}少。

我们提出了一个安全的, 技术上简单, 容易和快速可重复的程序, 以创建结肠吻合在一个小鼠模型, 这将有助于进一步调查未报告的机制吻合^{伤口愈合10}.

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研究方案

以下议定书已获得俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 的批准, 并遵守所有关于使用研究动物的机构伦理准则。此外, 所有实验都是根据关于实验动物研究的机构、州和联邦条例进行的。

注: 在这个协议中, 我们使用了女性和男性的康生在繁殖 c57bl6 在12至72周大的小鼠。所有用于这一程序的小鼠在手术前至少一周都被关押在我们的非屏障设施中, 以适应当地的生物群系。动物被允许在手术时间前进食, 我们在手术前既不使用口服机械肠准备, 也不使用直肠冲洗。

1) 吻合口的产生

1. 高压灭菌器, 加热盐水灌溉溶液, 并用70% 乙醇彻底清洁所有手术表面。
2. 要诱导麻醉, 请将鼠标放入连接到蒸发器的诱导盒中。在 1-2 l/min 中提供2-3% 异氟醚, 直到小鼠被镇静剂镇静剂。
3. 将动物放在加热装置上, 如加热垫, 以防止体温过低。
4. 皮下注射一次剂量 0.1 mg/kg 丁丙诺非 (30 克小鼠3微克) 进行术后镇痛, 一次剂量 10 mg2 克恩诺沙星用于术前抗生素预防。
   注: 虽然手术前和术后不需要抗生素, 但本机构的机构指南和动物护理和使用委员会建议在我们的设施中使用这些抗生素。
5. 将麻醉鼻锥放在老鼠的鼻子周围。在整个手术过程中, 仔细监测动物的呼吸速率, 并根据需要调整麻醉流量。将呼吸速率保持在每分钟30-40。
6. 使用剪发器, 然后使用脱毛剂, 将头发从腹部的整个皮肤表面取出。用水或70% 乙醇浸湿的纱布彻底去除脱毛剂。彻底干燥动物。
7. 在准备腹部之前, 将鼠标的四肢绑在每条腿末端的加热垫或手术表面, 以防止小鼠在手术过程中移动。用氯己定消毒腹部。包括整个剃须区域以及剃须区域边缘的头发。将无菌悬垂放在鼠标上 (图 1a)。
   1. 在悬垂之前, 将一个小的卵球形或长方形的窗户切入悬垂, 露出准备好的腹部。
      注: 窗户应暴露老鼠的整个腹部, 但覆盖四肢、尾巴、头部和胸部。我们为我们的操作切割了一个 4 x 3 厘米2窗口 (图 1b)。
   2. 沿着悬垂中线, 从底部边缘到卵球形或长方形窗口, 做一个小缝隙, 以便在过程中访问直肠 (图 1c)。
8. 做一个皮肤切口。从下腹部的中线开始, 用剪刀将皮肤垂直切割到。只切割皮肤, 避免割破腹壁肌肉组织 (图 2 a)。
9. 用钳子抓住腹壁的中线, 从腹部内装物中抬起。注意不要损伤腹部结构, 用锋利的剪刀垂直切割中线腹部筋膜的长度。延长皮肤切口的长度 (图 2b)。
10. 当肠子暴露时, 定位盲肠和小肠, 并将左侧内脏内侧旋转, 以暴露下降结肠和乙状结肠。将钝器探针尖端涂上润滑果冻, 并小心地将探针推进直肠, 以帮助识别后代/乙状结肠 (图 3)。
    注: 与人类不同的是, 小鼠的胎粪通常位于腹部的左上象限。在这一步中, 注意不要用探头打孔肠壁。如果肠壁穿孔, 终止手术并对鼠标实施安乐死。
    1. 避免用齿形或锋利的钳子抓便便便便可。相反, 使用阿图米钳, 棉尖施药器, 或温和的手指操作旋转内脏。
    2. 使用加热无菌盐水, 以确保暴露的肠道在整个过程中保持湿润。
    3. 结肠将位于中线左侧,并通过肠系膜连接到腹膜后。鉴定后, 部分取出钝器探针, 以方便开腹。
11. 对乙状结肠进行横向开腹手术。
    1. 用阿图拉蒂钳轻轻抓住比盆腔入口优越的乙状结肠 (图 4 a)。
    2. 使用锋利的微型剪刀, 使切割穿过乙状结肠垂直于结肠的方向, 并延伸到8-90% 的结肠宽度。这将有助于防止结肠的一端从手术场中撤回, 并便于修复 (图 4b)。
    3. 如果肠系膜血管在内脏旋转或开石过程中受伤, 用纱布或棉尖施药器轻轻按住压力长达2分钟。如果出血持续在此时间后, 放置一个数字 8 8-0 单丝缝合周围的出血点。
       注: 如果肠道在这之后出现坏死或受伤的迹象, 终止手术, 并使用您的机构动物使用委员会批准的人道方法对鼠标进行安乐死。
12. 修复乙状结肠开腹术。
    1. 使用 castroviejo 针驱动, 放置5-6 简单中断8-0 不可吸收的聚丙烯针修复结肠造口术。将缝合线彼此分开1毫米, 咬孔0.5 毫米。
       1. 注意避免滚动的边缘进入修复, 采取稍多于粘膜每针的浆膜。将尾巴留5毫米长。注意不要不小心将周围的肠道卡入缝合线 (图 4c)。
          注: 开始缝合在近肠系膜边界的开色术, 节省抗肠系膜的大部分的开颅手术的最后。
       2. 随着修复的进展, 推进跨肛门钝尖解剖探头, 以跨越修复之前, 最终缝合放置。这将有助于防止过于狭窄的修复和降低吻合口狭窄的比率。
13. 使用装有温暖盐水的10毫升注射器, 对腹部进行多次灌溉。如果鼠标下面的表面被浸泡, 请将鼠标擦干或移动到干燥的表面, 以避免体温过低。
    1. 使用放置在切口上的无菌纱布, 以吸收多余的灌溉。
    2. 在最后的灌溉, 填补腹部无菌盐水。小心地将润滑的 18 g 血管导管推进直肠, 并以 0.5-1 厘米3的空气充气.这将证明吻合术中的任何泄漏, 比可以修复另一个中断的聚丙烯缝合使用无菌探针跨越吻合。
    3. 在切除前使用血管导管对结肠进行脱脂。
14. 确保没有活动性出血。如果有, 直接对出血点施加温和的压力 1-2分钟. 如果出血持续, 请按上述方法放置止血缝合。
15. 轻轻地将中质的脏器返回到其正常的解剖位置 (图 5a)。
16. 关闭腹部切口 (图 5b)。
    1. 使用4-0 可吸收编织缝合线, 沿腹壁的肌肉层放置一个运行缝合线, 从切口顶部开始, 在切口的下侧完成。安装领带, 并削减缝合线留下5毫米的尾巴。
       注: 不要不小心在腹壁闭合中加入肠道。
    2. 重复4-0 单丝缝合关闭皮肤 (图 5c)。
17. 确保整个动物温暖干燥, 防止术后体温过低。
18. 当动物从麻醉中恢复时, 要仔细监测它。每72小时服用 0.1 mg kg 丁丙诺非2-3天后的疼痛控制程序。 在恢复期, 应每天仔细检查小鼠是否有脓肿或腹膜败血症的迹象。 术后疼痛和疼痛观察应包括: 限制运动, 包括弯腰式姿势、缺乏饮食、不适当的梳理、伤口周围过度炎症、切口部位缺乏正常愈合, 或不正常的嵌套。 任何表现出任何这些行为的动物都应立即通过二氧化碳窒息实施至少10分钟的安乐死, 然后进行双侧开胸手术。
19. 手术后7天内将 0.1 mg/欧元的恩诺沙星与小鼠的饮用水混合, 以防止腹部内感染或因与手术相关的粪便污染而败血症。

2) 收集吻合组织

1. 就在切除吻合组织之前, 使用机构动物使用委员会批准的人道方法对老鼠进行安乐死。
   注: 根据机构政策, 我们对动物实施安乐死, 方法是将它们放置在二氧化碳室, 在 2 lmmin 处注入100% 二氧化碳气体, 5分钟, 然后再进行双侧开胸手术。
2. 用氯己定消毒腹部, 然后用70% 乙醇消毒。
3. 用锋利的剪刀重新切割原来的中线切口。从上一个切口的下极开始, 将这个切口向上向上延伸 (图 6a)。
4. 使用剪刀, 切入肌肉层, 进入腹膜空间后, 将切口延伸到切口的顶部和底部。进入腹部时, 请注意避免肠伤或破坏吻合, 因为可能有肠道粘附在切口或吻合部位。
5. 小心地执行左内侧内脏旋转, 暴露修复后的乙状结肠 (图 6b)。在修复周围很可能会有肠道对肠的粘连。轻轻地、直言不讳地解剖这些粘连远离修复地点。要非常小心, 不要破坏吻合。
   1. 通过定位用于修复的聚丙烯缝合线的尾部来确定修复地点。使用剪刀和开始1厘米近端的修复, 横向横向通过下降结肠。重复此步骤1厘米远端到吻合部位。
6. 用精细的剪刀从结肠后缘的连接肠系膜上锐切结肠, 取出乙状结肠段 (图 7)。
7. 识别结肠标本的肠系膜边界, 并使用精细剪刀以纵向方式沿肠系膜边界的长度进行切割。这将从先前取出的圆柱形标本中创建一个正方形或长方形的冒号部分 (图 8)。
8. 在取出结肠段之前, 使用标记笔来标定结肠的反肠系膜边界。取出后, 沿标记对面的结肠长度进行纵向切割。根据组织学和免疫染色的需要, 修复、嵌入和切割样本组织。

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结果

手术后 7天, 吻合口应得到很好的愈合。吻合术可以在七天之前和之后的时间点收获, 以更好地说明吻合愈合的各个阶段。在图 9中, 组织学分析显示了由平滑肌α-肌动蛋白阳性肌成纤维细胞介导的纤维化 (三色体染色显示的胶原蛋白) 反应。然而, 我们发现, 从组织学分析的结果在小鼠之间不同, 特别是在吻合部位的再上皮化程度和肌成纤维细胞的浓度?...

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讨论

有几个关键的步骤, 以确保成功, 并最大限度地减少与此程序相关的疾病死亡率。首先, 确保仔细处理肠道组织, 并注意防止牵引损伤时旋转内脏, 以暴露结肠。肠道或肠系膜上的不适当张力会损害肠道或血管, 并导致肠坏死远离吻合部位。此外, 不应使用锋利的钳子或带牙齿的钳子来处理肠道。

与计划吻合部位分开的肠道损伤, 无论是在内脏旋转过程中, 还是通过钝探针穿孔, 都...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6/J mice	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole
Isothesia isoflurane	Henry Schein	50033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Shampoo	Medline	APL82287
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37 °C prior to use
10 ml syringe	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", PS-2 needle	Henry Schein	6546037
Blue monofilament suture 24” BV-1 needle	Henry Schein	8305H	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Straight, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline Sterile lubricating jelly	Medline	MDS032273H