JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

利用多步培养系统, 我们报告了体外 b 细胞对血浆细胞分化模型。

摘要

血浆细胞 (pc) 分泌大量抗体, 并从被激活的 b 细胞中产生。pc 是位于骨髓或粘膜中的罕见细胞, 可确保体液免疫。由于其频率和位置较低, 对个人电脑的研究在人类中很困难。我们报告了 b 到 pc 体外分化模型使用选定的细胞因子和活化分子的组合, 允许重现发生在体内的细胞分化。在这个体外模型中, 记忆 b 细胞 (mbc) 将分化为前血浆 ab面 (前 pbs)、血浆 abc (pbs)、早期 pc, 最后, 分化为长寿 pc, 表型接近健康个体中的对应基因。我们还构建了一个开放访问生物信息学工具, 以分析与 pc 分化有关的 gep 数据中最突出的信息。这些资源可用于研究人 b 对 pc 分化, 在目前的研究中, 我们研究了人 b 到 pc 分化过程中表观遗传因子的基因表达调控。

引言

b 细胞与血浆细胞 (pc) 的分化对体液免疫和保护宿主免受感染至关重要1。b 至 pc 分化与转录能力和代谢的主要变化有关, 以适应抗体分泌。对控制 b 到 pc 分化的转录因子进行了广泛的研究, 揭示了包括 b-和 pc 特异性转录因子 (tf)2在内的专属网络。在 b 细胞中, pox5、bcl6 和 bach2 tf 是 b 细胞身份2、3 的监护人。irf4、 prdm1编码 blimp1 和xbp1 pc tf 的诱导将消灭 b 细胞基因, 并诱导一个协调的抗体分泌细胞转录程序 3,4,5。这些协调的转录变化与 ig 基因转录激活以及从膜结合形式到免疫球蛋白重链 2,3的分泌形式的转换有关,4. b 至 pc 分化与内质网和 golgi 仪器功能相关的基因诱导, 同时进行展开的蛋白质反应 (upr) 激活, 已知通过适应合成分泌免疫球蛋白6,7。tf xbp1 在这种细胞适应 8,9,10中起着重要作用。

b 细胞和 pc 是体液免疫的关键参与者。了解控制正常血浆细胞产生和存活的生物过程对于需要确保有效免疫反应和防止自身免疫或免疫缺陷的治疗干预至关重要。pc 是罕见的细胞, 早期分化阶段发生在解剖位置, 妨碍充分的生物表征, 特别是在人类。利用多步培养系统, 我们报告了一个体外 b 到 pc 分化模型。该模型再现了体内不同器官中发生的顺序细胞分化和成熟11、 12、13。第一步, 记忆 b 细胞首先被 cd40 配体、寡核苷酸和细胞因子结合激活四天, 并分化为前质体 (prepbs)。第二步, 通过去除 cd40l 和寡核苷酸刺激并改变细胞因子组合, 诱导前质体分化为质粒 (pbs)。第三步, 通过改变细胞因子组合11,12,诱导血浆 ab面体分化为早期 pc。第四步是用骨髓基质细胞条件培养基或选定的生长因子13培养这些早期的 pc, 从而获得完全成熟的 pc。这些成熟的 pc 可以在体外存活数月, 并分泌大量免疫球蛋白 (图 1)。有趣的是, 我们的体外模型重述了可在体内检测到的不同 b 到 pc 阶段的协同转录变化和表型11、12、13、14 ,15。pc 是稀有细胞, 我们的体外分化模型可以研究人的 b 到 pc 分化。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

该议定书遵循《赫尔辛基宣言》和蒙彼利埃大学生物资源医院中心的协议。

1. 体外正常血浆细胞分化模型

请注意:pc 是通过 11、12、13的四步文化生成的。

  1. b 细胞扩增和分化
    1. 使用健康志愿者的外周血细胞进行记忆 b 细胞纯化。
    2. 用 rpmi 1640 培养基24.5 毫升稀释7.5 毫升血液。
    3. 在无菌的50毫升锥形管中加入12.5 毫升的室温密度梯度 (例如, 菲卡尔)。用稀释后的血液的32毫升轻轻覆盖密度梯度。最大限度地减少这两个阶段的混合。
    4. 离心20分钟在 500 x g 与刹车关闭。从稀释的等离子密度梯度界面收集 pbmc, 将细胞放入无菌的50毫升管中, 用 hank 的平衡盐溶液完成到45毫升。
    5. 在 500 x g处离心细胞5分钟。小心地取出上清液, 并保持颗粒。
    6. 加入45毫升 rpimi1640--10% 的胎儿小牛血清 (fcs), 离心剂 5分钟, 500 x克。小心地取出上清液, 并保持颗粒。加入30毫升的 pbs% fcs。
    7. 使用抗 cd2 磁珠去除 cd2 + 细胞。为一个目标单元格添加4个珠子。在4°c 下孵化30分钟。
      1. 使用磁铁进行细胞分离应用, 将珠带细胞与未绑定的细胞分开。收集未结合的细胞, 并在4°c 下用抗 cd19 apc 和抗 cd27 pe 抗体孵育细胞颗粒 15分钟 (106个细胞的抗体为 2μl).
      2. 在 pbs% 山羊血清中清洗两次。
      3. 消除 fsc 和 ssc 图上的污染事件。fsc-a 与 fsc-h 和 ssc-a 与 ssc-h 地块上的地块单块, 以去除碎片并选择白细胞总数。在 cdh\ cd27 和 cd19 + cd27+上选择内存 b 单元。
      4. 使用纯度为95% 的细胞分选器纯化 mbc。
    8. 使用 imdm 和 10% fcs 进行所有培养步骤, 并辅以 50 mgml 人转铁蛋白和 5 mgml 人胰岛素。
    9. 板纯化的六井培养基板 (1.5 x10 5 mbcsml in 5 mll 井), 为期 4天, 其中 il-2 (20 uml)、il-10 (50 ngml) 和 il-15 (10 ngml)。
      1. 加入磷硫代酸 cpg odn 2006, 组织标记重组重组人可溶性 cd40l (scd40l; 50 ng/ml) 和抗聚组氨酸 mab (5 mg/ml) 用于 mbc 活化 (图 1)。只有在相同的细胞因子鸡尾酒中激活 scd40l 或 odn, 以降低扩增12。这里描述的激活信号的组合导致了激活 b 细胞的最大数量和 prepbs11、12 ( 图 1)。
      2. 对于基因表达谱, 在第4天使用细胞分选器纯化 cd38-/cd20-cd20-prepbs (图 2)。
  2. 等离子电池的产生
    1. 在第4天, 数一数细胞。
    2. 12井培养板中的板细胞在 2.5 x10 5/ml 中的 2 ml/井中。
    3. 通过去除 cpg 寡核苷酸和 scd40l 并添加一种新的培养基, 包括 il-2 (20 u/2), 促进分化, il-6 (50 ng/ml)、il-10 (50 ngml) 和 il-15 (10 ngml) (图 1)。在37°c 下培养细胞 3天 (从第4天到第7天)。
    4. 对于基因表达谱, 在第7天使用细胞分选器纯化 cd38+/cd20-pbs (图 2)。
  3. 早期血浆细胞的生成
    1. 第7天, 数一数细胞。
    2. 12井板板在 5 x 10 5/ml 在 2 ml/井.
    3. 在37°c 条件下, 使用新鲜培养基 il-6 (50 ng/ml)、il-15 (10ng/ml) 和 ifn-α (500 uml) 在早期 pc 中区分 pb 3天。对于基因表达谱, 在第10天使用细胞分选器纯化cd20-/cd38 + cd138+早期 pc (图 2)。
  4. 长寿命等离子体细胞的产生
    1. 通过改变文化条件, 将早期 pc 区分为长寿命的 pc。
    2. 在25°c 的 2 ml/井或 2, ml/井的24井培养板中, 用 il-6 和基质细胞条件培养基和 april (200 ngml) 培养12井培养板中的细胞.
    3. 用培养基培养基质细胞 5天, 获得基质细胞条件培养基。过滤基质细胞培养上清液 (0.2μm) 并冷冻。
    4. 添加50% 的基质细胞条件的媒体到 pc 培养与更新每周。生成的长寿命 pc 可以维持 13个月.只有在报告的 13种情况下, 白细胞介素-6 和 april 才能获得 pc 的长期生存。
    5. 测量流式细胞仪分类 pc 的 ig 分泌。
    6. 在 106 细胞培养24小时的 pc 和收获培养上清液。使用人酶联免疫吸附法 (elisa) 试剂盒11、12、13测量 igg 和 iga。中位 igg 分泌物从10分10分到60天的17细胞日不等.

2. b 到 pc 分化的分子图集

请注意:我们构建了一个方便和开放的访问生物信息学工具, 从 affymetrix gep 数据中提取和可视化与 pc 分化 (基因组景观)15有关的最突出的信息。gep 可从 arrayexpress 数据库 (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) 公开查阅, 包括纯化的 mbc、prebbs、pbs 和 epc: e-mtab-1771、e-mexp-2360 和 e-mexp-3034 和 bmpe-mexp-236014、15。基因共用是一个免费提供的网络工具。

  1. 选择 b 到 pc 数据集
    1. 在 "基因视图" 开放访问生物信息工具 (http://www.genomicscape.com) 中的"浏览数据" 菜单中选择 "b 到 pc" 数据集, 称为"人 b 细胞到血浆细胞"。使用主页上提供的分析工具中的 "表达表达报告" 工具, 可以可视化独特基因的基因表达谱或基因列表。
  2. 监督分析和主成分分析 (pca)
    1. 选择"分析工具" web sam以加载 sam 工具。
    2. 选择"人 b" 单元格到等离子单元数据集, 然后选择要比较的样本组。
    3. 使用可用的不同筛选器应用感兴趣的筛选选项。
    4. 要将基因表达谱与 sam 工具进行比较, 请修改筛选选项, 包括折叠变化、排列次数、错误发现率和比较类型。基因组学将计算分析, 并提供选定组之间的差异表达的基因。
    5. 通过在"分析工具"菜单中选择"主成分分析" 来运行主成分分析。
    6. 选择"人 b" 单元格到等离子单元数据集, 然后选择感兴趣的组。
    7. 粘贴感兴趣的基因列表或根据方差选择基因。要粘贴基因列表, 请选择 "要分析 genes\ ncrna 列表, 请单击此处...... genomicscape 将计算可可视化和下载的 pca。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

体外正常 pc 分化的总体过程如图 1所示。利用这里提出的协议, 我们可以产生足够数量的细胞, 而这些细胞无法从体内人体样本中获得。尽管研究了复杂的转录因子网络在 pc 分化中的作用, 但调节关键 pc 分化转录网络的机制仍然鲜为人知。细胞分化主要是由表观遗传和转录的变化驱动的。利用我们的体外模型和 b 到 pc gep 图集, 研究了表观遗传因子在?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

在人类中, pc 是罕见的细胞, 分化阶段发生在解剖的地方, 妨碍充分的生物表征。我们已经开发了一个体外 b 到 pc 分化模型使用多步骤培养系统, 其中激活分子和细胞因子的各种组合随后应用, 以再现发生在体内不同的器官组织 11,12,13。

其他有效的体外 b 对 pc 分化模型报告为18,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

作者们没有什么可以透露的

致谢

这项工作得到了法国国家癌症研究所 (PLBIO15-256)、anr (tie-leot 跳过) 和 itmo 癌症 (mm & tt) 的资助。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-CD2 magnetic beadsInvitrogen11159D
Anti-CD138-APCBeckman-Coulter B49219
Anti-CD19-APCBD555415
Anti-CD20-PBBeckman-Coulter B49208
Anti-CD27-PEBD555441
Anti-CD38-PEBeckman-Coulter A07779
Anti-histidineR&D SystemsMAB050
CpG ODN(PT)SigmaT*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human TransferinSigma-AldrichT3309
IFN-αMerckIntron A
IMDMGibco31980-022
Recombinan Human CD40L-hiR&D Systems2706-CL
Recombinant Human APRILR&D Systems5860-AP-010
Recombinant Human IL-10R&D Systems217-IL-
Recombinant Human IL-15Peprotech200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 ProteinR&D Systems202-IL-
Recombinant Human IL-6Peprotech200-06

参考文献

  1. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
  3. Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
  4. Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
  5. Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
  6. Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
  7. Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
  8. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  9. Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
  10. Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
  11. Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
  12. Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
  13. Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
  14. Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
  15. Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).
  16. Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
  17. Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
  18. Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
  19. Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
  20. Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
  21. Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
  22. Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
  23. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
  24. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
  25. Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
  26. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
  27. Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
  28. Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
  29. Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
  30. Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
  31. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
  32. Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
  33. McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
  34. Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
  35. Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
  36. Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
  37. Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877(2017).
  38. Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121(2018).
  39. Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
  40. Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
  41. Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4(2015).
  42. Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
  43. Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
  44. Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。