通过Sialoglycan的代谢标记识别主要神经干细胞和祖细胞的细胞表面标记

摘要

这里介绍的是一个协议，结合了体外神经内皮共培养系统和代谢结合的异形理念功能组，以扩大主神经干和祖细胞，并标记其表面用于细胞表面标记的成像或质谱分析的紫锥蛋白。

摘要

神经干细胞和祖细胞（NSPCs）是大脑复杂结构和功能的细胞基础。它们位于体内的专门利基，可以在体外分离和扩展，作为细胞移植修复脑损伤的重要资源。然而，NSPCs是异构的，在分子水平上没有明确定义或由于缺乏特定的细胞表面标记而纯化。先前报道的该协议将神经内皮共培养系统与代谢甘油标记方法相结合，以识别初级NSPCs的表面脂质蛋白酶。NSPC-内皮共培养系统允许在体外自我更新和扩展初级NSPCs，产生足够数量的NSPCs。 培养的NSPC中的Sialoglycan使用非天然的亚西酸代谢报告器进行标记生物正交功能组。通过比较自更新的NSPC中的异二蛋白酶，在内皮共培养中扩展，具有不同的神经培养，我们确定了在NSPCs中丰富的膜蛋白列表。协议详细涉及:1）NSPC内生共文化与NSPC区分文化;2） 标记与阿齐多糖每O-乙酰化N-乙酰氨基苯甲胺（Ac₄曼纳兹）;3）生物锡结合到改性双发胶，用于在神经培养固定后进行成像，或从神经培养中提取蛋白质进行质谱分析。然后，通过对扩展NSPC和分化神经培养的质谱数据的比较分析，选取了NSPC富集表面标记候选物。该协议对识别起始材料中低丰度膜蛋白具有高度敏感性，可应用于其他系统具有适当修改的标记发现

引言

神经干细胞被定义为一个多能细胞群，可以自我更新，以维持干细胞库，分化成神经元和胶质。它们是神经系统中的主要细胞类型，通过细胞移植到病变和受伤^{的大脑1，2，}在再生医学中可能提供巨大的治疗潜力。随着发育的进行，神经干细胞群成为异质^的3、4，神经干细胞在大脑中的比例逐渐^下降5。一般来说，胚胎神经干细胞和其他神经祖细胞，统称为神经干细胞和祖细胞（NSPCs），位于^小鼠6的生殖区、心室区和下室区。在胚胎大脑中，神经干细胞通过中间祖细胞（IPC）直接或间接地产生神经元，在某些物种中，通过外部潜区祖体（oRGs）7、8产生神经元。特定的分子特征、形态、干细胞利基的位置和分化潜力都决定了每个亚型在脑器官生成和临床应用^{中的作用9。}然而，目前可用的细胞表面标记不能明确区分和纯化NSPCs的不同亚型，从而限制了对这些亚型的理解和利用。

主要NSPCs表面标记的识别受到三个主要障碍的限制。第一个是组织中NSPCs的细胞数量有限，因此很难制备细胞表面蛋白样本进行常见的质谱分析。第二个限制是难以生成纯细胞亚型，以生成亚型特异性膜蛋白数据。最后，第三个挑战是细胞表面蛋白在全细胞蛋白中的比例低，这妨碍了通过质谱分析的检测灵敏度。

为了克服这些问题，我们开发了一种化学蛋白质组的方法，通过代谢标记的西洛基^蛋白质10来选择性地丰富和识别初级NSPC中的细胞表面蛋白。为了产生足够数量的NSPC，我们利用已建立的协议在体外扩大和维护未分化状态的初级胚胎NSPCs，使用可渗透支持与小鼠大脑内皮细胞系共同培养NSPC矩阵插入（例如，透井）系统¹¹。相反，没有内皮细胞单独培养的核动力源产生分化^{的后代11，12。}因此，可以相对分析来自这两个培养系统的蛋白质样本，以识别在NSPCs和分化神经元中不同表达的蛋白质。由于大多数细胞表面蛋白被硅^酸13修饰，非天然的硅酸前体模拟N-azido乙酰氨基胺四合化（Ac₄ManNAz）被用来劫持内在代谢途径，以便内源性，新的合成的硅石糖被标记为阿齐多组，产生化学^手柄14。通过阿齐多-烷基介导的生物正交反应，将生物素与硅脂酶结合，细胞表面蛋白可以通过链球蛋白耦合荧光素或基^质14进行可视化和富集，用于蛋白质组鉴定。

在这里，我们执行SDS-PAGE凝胶染色分析表面链胶蛋白酶从NSPC扩展在内皮共培养和区分细胞在非共培养系统中。我们还有选择地在两个培养系统中纯化表面的同步蛋白酶，以便进行蛋白组比较。与传统的离心基细胞表面纯化^方案15相比，我们的方案通过特定的标记结合和亲和力减少表面蛋白提取程序，从而提高了提取效率净化。同时，在细胞表面蛋白主要发生细胞表面蛋白的前提下，提高了细胞表面蛋白的提取纯度。虽然内皮因子不能完全阻止扩大的NSPC的分化，但共同培养和分化培养之间的比较研究提供了一种方便的方法来精确定位干细胞富集的表面蛋白，而无需分析^由FACS16纯化的NPC蛋白质。我们相信这种方法可以应用于研究其他系统的表面蛋白与适当的修改。

研究方案

本研究中使用的所有动物规程均经清华大学IACUC（机构动物护理和使用委员会）批准，并按照IACUC的准则执行。清华大学实验室动物设施已获得AAALAC（国际实验室动物护理评估与认证协会）的认可。对于胚胎的分期，鉴定的阴道塞的中天被计算为胚胎日0.5（E0.5）。

注:所有细胞在37°C和5%CO2条件下在细胞培养箱中培养。

1. 在渗透支持插件中制备小鼠内皮培养物

注:BEND3 电池根据制造商的说明进行维护。

1. 通过在500 mL的DMEM中加入50mL的FBS和5mL的青霉素-链霉素，制备BEND3细胞培养基（BM），并混合均匀。
2. 从培养皿中吸出培养基，用1mL的PBS洗涤BEND3细胞培养。在细胞中加入1 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育细胞4分钟。
3. 在细胞中加入1 mL的BM，以中和胰蛋白酶-EDTA，并轻轻上下移液，使细胞完全分离。将细胞悬浮液转移到新的15 mL锥形管中，并在室温（RT）下离心5分钟，400 x g。
4. 从管中吸出上清液，用9 mL的新鲜BM重新悬浮细胞，然后将1mL的细胞悬浮液加入一个可渗透的支撑插件中。在矩阵的底部腔室每口井再添加 2 mL 的新鲜 BM。继续培养单元格一天。

2. 准备小鼠主皮质 NSPC 培养

1. 培养板、木瓜消化培养基和皮质粘附培养基（AM）的制备
   1. 将每孔 1 mL 的 PLL 溶液加入 6 孔板，将 6 孔板与聚L-莱辛 （PLL） 涂覆。然后，在RT孵育板30分钟。
   2. 将 PLL 溶液转移到 15 mL 锥形管中。用双蒸馏水洗板3次。将盘子晾干，放在一边，直到使用。
   3. 通过在5mL的DMEM中加入50U的木瓜素、50μL的L-谷氨酰和50μL的100mg/mL乙酰-L-半胱氨酸，制备木瓜蛋白消化培养基。将培养基短暂混合，将其加热至37°C，30分钟，用于酶活化。
   4. 制备皮质细胞附着培养基（AM）:加入500μL的L-谷氨酰胺、500μL的丙酸钠、500μL的100mg/mL N-乙酰L-半胱氨酸、500 μL的N2、1mL的B27和5μL的100μg/mL bFGF到50mM的DMEM中。在使用前将介质混合好，将其加热至 37°C。
2. 原发性脑皮质细胞的制备和随后的电镀
   1. 因宫颈错位而牺牲E10.5时间怀孕小鼠。
      注:在E10.5，大多数细胞在大脑皮层中增殖NSPC，产生体外后代的大克隆。
   2. 用75%乙醇消毒腹部。使用精细剪刀和微锯齿钳沿中间线的右侧切割皮肤和基础肌肉，以打开腹部。用锯齿状钳子轻轻地将子宫从腹腔中取出，用细剪刀将其从腹腔中切出。
   3. 在10厘米培养皿中用40 mL的预冷冻HBSS清洗子宫。然后，将子宫转移到一个新的10厘米培养皿中，然后用40 mL的预冷冻HBSS再次洗涤。
   4. 将子宫转移到一个新的10厘米培养皿与40mL的预冷冻HBSS。从子宫和羊膜中取出胚胎，然后用珠宝微钳将胚胎的头部从躯干上切下。
   5. 用 40 mL 的预冷冻 HBSS 清洗头部，并将头转移到带有 40 mL 预冷冻 HBSS 的新 10 厘米培养皿中。使用珠宝商微钳剥离覆盖大脑的皮肤和软骨，然后切断脑皮，并收集他们在15 mL锥形管与预冷却的HBSS。
   6. 在4°C和300 x g下，通过离心将皮质颗粒3分钟。从管中吸出上清液，然后将活性木瓜蛋白消化培养基和15μL的4mg/mL DNase I加入组织颗粒中。
   7. 通过温和的涡旋短暂地重新悬浮组织颗粒。在37°C下孵育组织30分钟。在此期间，每10分钟短暂涡旋，松开组织。
      注:在消化结束时，管子中不应有可见的组织片。
   8. 在4°C和450 x g下，通过离心将皮质细胞进行10分钟的细胞。从管中吸出上清液，用预冷却的DMEM清洗细胞颗粒。重复此步骤一次。
      注:在消化和洗涤过程中，注意不要粗略移移组织和细胞颗粒，以避免用强大的剪切力破坏细胞。
   9. 从管中吸出上清液，然后将1.5 mL的预冷却HBSS加入管中。用温和的移液将皮质细胞颗粒分离成单个细胞。使用血细胞计计算细胞数。
   10. 将 2 mL 的 AM 和 2 x 10⁴皮质细胞每孔加入 6 孔板中。在37°C和5%CO₂孵育板3小时，让细胞附着在板上。

3. 神经内皮共培养和Ac₄ManNAz标签系统的设置

1. 在插入物中电镀 BEND3 电池一天后，先轻轻吸进底部腔室中的介质，然后插入。使用预加热的 DMEM 清洗刀片的外带 3 次。使用预加热的 DMEM 冲洗刀片的外表面。
2. 将 1 mL 的预加热 AM 加入一个插入件中，然后将插入物转移到具有主皮质细胞的井中。在37°C和5%CO₂下孵育共培养12小时。
3. 在 DMSO 中溶解 Ac₄ManNAz，达到 200 mM 的库存浓度。设置神经内皮共培养后12小时，每底部腔室添加1μL的Ac₄ManNAz股票，每插入至共培养物中加入0.5μL的库存。立即摇动板并轻轻混合介质。对于控制单元，添加相等的 DMSO 体积。
4. 在37°C和5%CO2下再培养细胞5天。将 AM 与 10x bFGF 作为再进给介质 （RM） 进行准备。在此期间，每插入100μL的RM和每底部腔室200μL的RM，每隔一天重新喂食内皮和神经细胞。在重新喂食期间，请勿向培养区提供 Ac₄ManNAz 或 DMSO。

4. 扩大原发性NSPC和分化神经元中亚洛木蛋白的免疫荧光染色

1. 在双蒸馏水中制备 BTTA-CuSO₄复合 1 30x 库存，含有 1.5 mM CuSO₄和 9 mM BTTAA。在PBS中制备含有50μM生物素-烷基、2.5 mM抗坏血酸钠和1xBTTAA-CuSO4复合物的新鲜生物素结合缓冲液1。
2. 从共培养板上拆下刀片。从底部井中吸出培养基，用预加热的PBS清洗神经细胞一次。
3. 从井中吸出PBS。将每口井中预冷冻的4%甲醛PBS溶液加入1mL，在RT处固定10分钟。然后，用预冷冻的PBS清洗细胞3次。
4. 从井中吸出PBS，将1mL新鲜制备的生物锡结合缓冲液每孔1分加入细胞。在RT孵育细胞10分钟。
5. 从井中吸出反应缓冲液。用PBS清洗细胞3次。准备含有1%FBS和1μg/mL Alexa氟647-链球菌素的染色缓冲液。将每口井的染色缓冲液加入1 mL，并在RT下孵育细胞30分钟。
6. 用预冷的PBS从井中吸出染色缓冲液和洗涤细胞3次。在PBS中制备含有5%BSA和0.3%非离子洗涤剂-100的阻断缓冲液。将每口井的1 mL阻塞缓冲液加入细胞，并在RT孵育10分钟。
7. 将反nestin和β-tubulin III抗体分别稀释到阻断缓冲液中，其比率分别为1:20和1:1，000，制备初级抗体溶液。从井中取出阻塞缓冲液，并将每口井的1 mL原抗体溶液加入细胞。在4°C孵育细胞过夜。
8. 从井中取出原抗体溶液。用预冷冻的PBS清洗细胞3次。通过稀释 Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1、Alexa Fluor 546 山羊抗小鼠 IgG2b 和 DAPI 一起以 1:1，000 的稀释作用，将辅助抗体溶液制备成阻塞缓冲液。从井中吸出PBS，并将每口井中加入1 mL二级抗体溶液。在RT下孵育细胞2小时。
9. 从井中吸出抗体溶液，用预冷却的PBS清洗细胞3次。之后，单元格已准备好进行图像捕获。

5. 从扩大的初级NSPC和分化神经元中纯化的西洛克淋球蛋白

1. 在双蒸馏水中制备 BTTA-CuSO₄复合 2 15x 库存，含有 1.5 mM CuSO₄和 3 mM BTTAA。在双蒸馏水中制备含有4%SDS和10 mM EDTA的蛋白质再悬浮缓冲液A;含有150 mM NaCl、50 mM三乙醇胺和1%聚乙烯油性乙醚（如Brij97）的双蒸馏水中含有pH7.4的蛋白质再悬浮缓冲液B。使用前，混合缓冲液A:缓冲液B= 1:8（vol/vol）以制备完整的蛋白质再悬浮缓冲液。在PBS中制备含有2%SDS的蛋白质洗涤缓冲液1;250 mM碳酸氢铵（ABC）中含有8M尿素的蛋白质洗涤缓冲液2;和蛋白质洗涤缓冲液3含有2.5M NaCl在PBS。
2. 从共培养板上拆下刀片。从底部井中吸出培养基，用预冷却的PBS清洗神经细胞一次。
3. 从孔中吸出PBS，并将每孔200μL的预冷却RIPA缓冲液加入板中。在冰上孵育板5分钟，将蛋白质解液收集到1.5 mL管中。在4°C和12，000 x g下离心，将细胞碎片离心10分钟。
4. 将上清液转移到新的 1.5 mL 管中。根据制造商的说明，使用 BCA 试剂盒确定蛋白质浓度。将蛋白质浓度调整至1mg/mL。
5. 加入100μM烷基-生物素、2.5 mM抗坏血酸钠和1xBTTAA-CuSO₄复合2至1mL的蛋白质解液，并混合好溶液。在 RT 孵育混合物 1 小时。
6. 将反应溶液转移到50 mL锥形管中20 mL的预冷冻甲醇中。混合良好，在-30°C孵育过夜，以沉淀蛋白质。
7. 在4°C和4，500 x g下，通过离心沉淀15分钟沉淀蛋白质。用20 mL的预冷冻甲醇清洗蛋白质颗粒两次。从管子中吸出上清液。用4 mL的蛋白质再悬浮缓冲液重新悬浮蛋白质颗粒，并将蛋白质再悬浮转移到新的15 mL锥形管中。
8. 取50μL的链球菌珠，用PBS洗涤3次。将洗涤过的珠子加入蛋白质再悬浮。以 20 rpm 的转速在 4°C 下在垂直旋转器上孵育溶液 3 小时。
9. 用6种缓冲液依次清洗珠子:蛋白质洗涤缓冲液1、蛋白质洗涤缓冲液2、蛋白质洗涤缓冲液3、0.5M ABC、0.25M ABC和0.05 M ABC。
10. 洗涤后，用 20 μL 的 PBS 重新悬浮珠子，并将珠子转移到新的 1.5 mL 管中。将20μL的2倍蛋白质加载缓冲液加入珠子中，在95°C下治疗10分钟。然后，蛋白质样品应接受SDS-PAGE，并根据制造商的说明，用库马西亮蓝色R-250染色。切割凝胶中的蛋白质，如库马西亮蓝色R-250所示，用于质谱分析。

结果

原发性胚胎NSPC的体外扩张和代谢标记整个过程需要6天（图1A）。BEND3细胞系和新鲜分离的初级NSPCs的质量是成功实验的关键。BEND3细胞是可溶性因子的来源，可溶性因子刺激NSPCs的自我更新和增殖。在与神经细胞共同培养之前，应确保BEND3细胞没有任何污染，并且以最小的细胞死亡积极分裂。主 NSPC 必须仔细准备，以避免在分离过程中造成过度损坏。?...

讨论

表面标记通常用于标记和纯化体外和体内的特定细胞^{类型17、18。}表面标记物的发现为再生医学和干细胞研究做出了巨大贡献，它提供了分子工具，从正常或病理组织和培养皿中选择性地丰富干细胞群，提供纯化细胞用于临床或研究生物特性的资源。然而，由于难以将干细胞与原发性组织分离，神经干细胞研究的表面标记物开发进展缓慢。此处描述的协?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2x	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1,000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
Sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1,000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
Urea	Sigma	U5378