利用体外和细胞内形状研究小分子诱导的预 mrna 结构变化

摘要

通过引物扩展 (shape) 实验分析的体外和细胞内选择性 2 '-羟基酰化的详细方案, 以确定在存在 rna 靶向小分子的情况下, mrna 前序列的二级结构。本文中介绍。

摘要

在针对小分子的药物开发过程中, 需要阐明它们与目标 rna 序列相互作用的结构变化。本文提供了一个详细的体外和细胞内选择性 2 '-羟基酰化分析引物延伸 (shape) 协议, 以研究 rna 结构的变化, 在存在的实验药物存在的脊髓肌肉萎缩 (sma), 生存运动神经元 (smn)-c2, 以及 smn2 基因的前 mrna 的外显子7。在体外形态中, 含有 smn2 外显子7的140个核苷酸的 rna 序列通过 t7 rna 聚合酶转录, 在 smn-c2 存在下折叠, 然后用温和的 2 '-oh 酰化试剂 2-甲基咪唑 (nai) 进行改性。这种 2 '-oh-nai 加合物通过³²p 标记引物延伸进一步探测, 并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (page) 进行求解。相反, 2 '-oh 酰化在细胞内的形状发生在原位与 smn-c2 结合细胞 rna 在活细胞。然后, pcr 扩增了 smn2 基因中外显子7的 mrna 前序列, 以及 shape 诱导的引物延伸突变, 并进行了下一代测序。通过对这两种方法的比较, 体外 shape 是一种更具成本效益的方法, 不需要计算能力来可视化结果。然而, 体外 shape 衍生 rna 模型有时会偏离细胞环境中的二级结构, 这可能是由于与 rna 结合蛋白的所有相互作用的丧失。细胞内形状不需要放射性物质工作场所, 并在细胞环境中产生更准确的 rna 二级结构。此外, 细胞内 shape 通常适用于更大范围的 rna 序列 (~ 1, 000个核苷酸), 利用下一代测序, 而体外 shape (~ 200 核苷酸) 通常依赖于 page 分析。在 smn2 前 mrna 中的外显子7的情况下, 体外和细胞内形状 rna 模型是相似的。

引言

选择性 2 '-羟基酰化分析引物延伸 (shape) 是一种测量每个核苷酸在感兴趣的 rna 序列中的动力学的方法, 并阐明单核苷酸^{分辨率 1}下的二级结构。在体外条件 2^,3,4 (纯化 rna 在一个定义的缓冲系统) 和在活哺乳动物细胞^{5, 6,已经}开发了 shape 方法来研究继发中长 rna 序列的结构 (通常和 lt;1,000 核苷酸用于细胞内形状和 lt;200 核苷酸体外形状)。它是特别有用的评估的结构变化后, 结合 rna 相互作用的小分子代谢物^{2,4,7,8 和研究}机械作用在药物开发过程中的 rna 靶向分子 9^,10。

rna 靶向药物发现....

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研究方案

1. 体外形状

请注意:从已发布的协议1修改协议^.

1. 准备 rna 模板
   请注意:t7 转录模板被排序为合成双链 dna (dsdna), 并通过插入大肠杆菌载体进行扩增 , 该载体携带独特的一对 ecrori/bamhi 限制性内切酶位点, 如 pet28a, 或通过 pcr 进行扩增。pcr 扩增协议如下图所示。
   1. 混合以下材料: 50μl pcr 主混合物 (见材料表), 10μm 中的每种引物 2μl (序列见表 1 ), 2μl 中的 dsdna 模板为2μl 和3μl 的二甲基亚硫酸盐 (dsDNA), 41μlh2o aliot 分为两个 pcr管 (每个管含有50μl 的反应混合物)。
   2. 设置热循环器如下: 第1阶段) 95°c 30秒;阶段 2) 95°c 为 20秒;阶段 3) 56°c 为 20秒;阶段 4) 72°c, 20秒;第5阶段) 循环回到第2阶段, 循环30个周期;阶段 6) 72°c 3分钟;和阶段 7) 无限保持在 4°c, 直到下一步。
   3. 通过提取凝胶切片纯化 pcr 放大器 (参见材料表<....

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结果

我们之前证明, rna 拼接调节剂 smn-c2 与 smn2 基因前 mrna 的外显子7上的 aggaag 母题相互作用, 并使用 shape 评估 smn-c2^{6 存在}时的 rna 结构变化。smn-c2 的结合位点不同于 fda 批准的 sma、nusinersen 反义寡核苷酸 (aso), 它在内含子 7^、28 (图 1 a) 上结合和阻断了内含子上的内含子拼接消声器 (iss)。大多?.......

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讨论

在体外形状中, 使用高质量的均质 rna 模板至关重要。然而, t7 转录通常会产生异质序列³⁶。特别是在 3 '-末端有±1核苷酸的序列, 产量不可忽略³⁶ , 通常很难通过聚丙烯酰胺凝胶纯化去除。异构 rna 模板可以在引物延伸产物的测序凝胶分析中产生多组信号, 这有时会使其难以解释结果。rna 模板表达盒的 5 '-和 3 ' 端的核酶将使两端同质化。

无论.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA oligonucleotide	IDT		gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix	Thermo Fisher	F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit	Takara	740609.50
MegaScript T7 transcription kit	Thermo Fisher	AM1333	Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water	Thermo Fisher	750023
2x TBE-urea sample buffer	Thermo Fisher	LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)	Bio-Rad	1610146
10x TBE buffer	Thermo Fisher	15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit	Thermo Fisher	166-0045
Kimwipe	Kimberly-Clark	34133
TEMED	Thermo Fisher	17919
SYBR-Safe dye	Thermo Fisher	S33102
6% TBE-urea mini-gel	Thermo Fisher	EC6865BOX
ChemiDoc	Bio-Rad
T4 PNK	NEB	M0201S
γ-32P-ATP	Perkin Elmer	NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen	GE Healthcare	RPN1669	calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen	Molecular Dynamics	BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon	GE Healthcare
NAI (2M)	EMD Millipore	03-310
GlycoBlue	Thermo Fisher	AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Thermo Fisher	18090010	Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)	Thermo Fisher	R0192
ddNTP set (5 mM)	Sigma	GE27-2045-01
large filter paper	Whatman	1001-917
Gel dryer	Hoefer	GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34	Addgene	72287
Heat inactivated FBS	Thermo Fisher	10438026
Pen-Strep	Thermo Fisher	15140122
Opti-MEM I	Thermo Fisher	31985062
FuGene HD	Promega	E2311
TrpLE	Thermo Fisher	12605010
DPBS without Ca/Mg	Thermo Fisher	14190250
TRIzol	Thermo Fisher	15596018
RNeasy mini column	Qiagen	74104	Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide	Thermo Fisher	AM9342
MnCl2•4H2O	Sigma-Aldrich	M3634
random nonamer	Sigma-Aldrich	R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	11904-018	Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse	Thermo Fisher	12344024
NextSeq500	Illumina
NucAway column	Thermo Fisher	AM10070	for desalting purpose