增殖性糖尿病视网膜病变纤维血管并发症的体外组织培养模型

摘要

在这里, 我们提出了一个方案, 研究增殖性糖尿病视网膜病变的病理生理学使用患者衍生的, 手术切除, 纤维血管组织的三维本地组织表征和体外培养。这种体外培养模型也适合测试或开发新的治疗方法。

摘要

糖尿病视网膜病变 (dr) 是糖尿病最常见的微血管并发症, 也是工作年龄成年人失明的主要原因之一。目前没有糖尿病和氧引起的视网膜病变的动物模型会出现人类增殖性糖尿病视网膜病变 (pdr) 所表现出的全系列渐进性变化。因此, 对疾病发病机制和病理生理学的了解在很大程度上依赖于使用组织学切片和玻璃体样本的方法, 这些方法只能提供有关致病因素的稳态信息。越来越多的证据表明, 在三维 (3d) 微环境中的动态细胞和细胞外基质 (ecm) 相互作用对于新的治疗策略。因此, 我们假设用 pdr 手术切除眼睛的病理性纤维血管组织可以可靠地揭示这种毁灭性疾病的细胞和分子机制, 并测试新的临床潜力干预。为此, 我们开发了一种新的方法, 用于手术切除患者衍生的纤维血管组织 (ft) 的三维体外培养, 该方法将作为人类 pdr 病理生理学的相关模型。将 ft 分解成外植体, 并嵌入纤维蛋白基质中, 用于体外培养和三维表征。通过对原生 fts 和终点培养物的全安装免疫荧光进行彻底的研究, 从而可以对组织组成和多细胞过程进行彻底的研究, 突出了3d 组织级表征对发现相关特征的重要性。pdr 病理生理学。该模型将允许在 pdr 组织结构和微环境中动态生化和物理相互作用的复杂背景下同时评估分子机制、纤维素组织过程和治疗反应。由于该模型重述了 pdr 病理生理学, 因此也可进行测试或开发新的治疗方法。

引言

dr 是糖尿病的一种严重的眼部并发症, 在过去30年中, 这种疾病已达到巨大的比例¹。诊断20年后, 几乎每个1型糖尿病患者和60% 的2型糖尿病患者都有视网膜病变的迹象, 使糖尿病本身成为正常工作年龄失明的主要原因之一.根据微血管变性和缺血损伤的程度, dr 分为非增殖 dr (非 pdr) 和增殖 dr (pdr)。终末期疾病 pdr 的特点是缺血和炎症引起的新生血管和纤维化反应在玻璃体视网膜界面。在未经治疗的情况下, 这些过程将导致失明, 由于玻璃体出血, 视网膜纤维化, 视网膜三度脱离, 和新生血管性青光眼^3,4。尽管最近的进展, 目前的治疗方案只针对 dr 阶段, 包括糖尿病黄斑水肿和 pdr, 当视网膜损伤已经接踵而至。此外, 很大一部分 dr 患者没有从目前的治疗水族馆中受益, 这表明迫切需要改进治疗 4^、5、6.

到目前为止, 已经开发出多个其他体内疾病发展模型和糖尿病动物模型, 但没有一个模型可以概括人类 pdr^7,8中观察到的全部病理特征。此外, 越来越多的证据表明, 治疗反应与 ecm 组合以及细胞和无细胞微环境之间的空间排列和相互作用^密切相关。因此, 我们开始开发一个临床相关的模型的人 pdr 利用 ft 病理材料, 通常是从眼睛接受玻璃体切除术作为 pdr¹⁰的手术管理的一部分。

这份手稿描述了3d 体外培养和定性的手术切除, pdr 患者衍生病理 ft 的协议。这里描述的方法已被用于最近的一份出版物, 证明了成功解构本地 3d pdr 组织景观, 并重述了 pdr 病理生理学的特征, 包括血管生成和纤维化反应的异常血管结构¹¹。该模型还揭示了从薄薄的组织学切片中不易被欣赏的新特征, 如空间限制的凋亡和增殖以及血管胰岛形成¹¹。玻璃体液已被其他人成功地应用于三维内皮球体培养物, 以评估其血管生成潜力和血管静止分子¹²的有效性。当与体外三维淋巴细胞内皮细胞 (lec) 球体萌发试验结合使用 pdr 玻璃体作为刺激物时, 我们的模型揭示了可溶性玻璃体因子以及新生血管组织中的局部线索对作为刺激物的贡献。但对 lec 参与 pdr 病理生理学的^情况了解甚少^{,3, 11}。在 pdr 的管理中, 玻璃体视网膜手术是一个例行执行但具有挑战性的程序。由于外科器械和技术正在看到不断的进步和成熟, 及时和保守地去除纤维血管增生标本不仅提高视力, 而且还提供了宝贵的组织材料研究人类组织微环境复杂翻译方面的 pdr 病理生理学和治疗反应。

研究方案

这项研究得到了赫尔辛基大学医院机构审查委员会和伦理委员会的批准。每个病人都得到了签字的知情同意。

1. 解决方案、介质和设备的准备

1. 在收集纤维血管组织 (ft) 之前准备以下设备, 以确保快速处理。
   1. 灭菌高压灭菌器两个微解剖推子。
   2. 在900毫升去离子水中溶解1个预称的 pbs 片 (0.14 m ncl, 0.0027 m kcl, 0.010 m po 4-3), 制备 1x磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 搅拌溶解。将水量调整到1升, 并对现成的溶液进行灭菌高压灭菌。存放在 rt。
   3. 将上述溶液和设备收集在一个篮子里, 再加上一次性无菌手术刀、6厘米的无菌细胞培养皿和五个无菌的12井细胞培养板。
2. 在 hanks 平衡盐溶液 (hbss) 中制备 6 mgml 纤维蛋白原溶液, 将30毫克的血浆-贫化人类纤维蛋白原溶解成5ml 的 hbss, 使用 50 ml 管浸入37°c 的水浴中, 至少1小时。
   注: 使用前可将该溶液保存在水浴 (37°c) 中 7小时 (最长为 10小时)。
3. 加入5% 的胎儿小牛血清 (fcs) 或5% 的人血清、0.4% 的内皮细胞生长补充剂、10 ngml 重组人表皮生长因子、1μgml 氢化可的松和50μgml 庆大霉素制备前活性内皮细胞生长介质, 并保持在37°c 的水浴中, 直到使用。在4°c 下存放长达一个月。

2. 纤维血管组织解剖

1. 收集已从接受跨结膜微切口玻璃体视网膜手术的人的纤维血管组织 (ft), 由23或20规格的三端口骨平面玻璃体切除术作为 pdr 玻璃体视网膜手术治疗的一部分。
   注: ft 使用分割和分层切除, 必要时使用微剪刀切割, 并由经验丰富的玻璃体视网膜外科医生用眼内夹紧微钳从玻璃体腔中取出。需要采取极端的护理, 以消除完整的, 未损坏的 ft, 而不会造成损害的眼睛结构, 包括视神经或颞血管拱廊, 病理性血管组织最常见的位置。切除组织的大小是可变的, 通常在3到50毫米2之间.
2. 将 ft 放在6厘米的细胞培养皿中, 或将含有1毫升无菌 pbs 的 1.5 ml 管放在湿冰上, 并立即将其转移到研究实验室进行处理。
   注: 研究单元 (实验室设施) 必须在物理上靠近医院手术室 (or), 以最大限度地减少小的切除 ft 的转移时间。在这种情况下, 转移需要不到 5分钟, 外植体被嵌入纤维蛋白通常在 1-1. 5小时 (最多 2小时) 手术切除后。需要测试较长的传输时间对3d 文化的影响。
3. 将 ft 放置在一个6厘米的细胞培养盘中, 在室温 (rt, 25°c) 下含有1毫升的 pbs, 并使用具有5倍目标的倒置荧光显微镜获取组织图像。
   注: 图像是为定性评估和文档获取的。可以观察组织的大小、密度和一般成分 (例如,血管结构)。
4. 使用无菌手术刀和微解剖推子, 在直立不连续的立体显微镜下将 ft 切割成 ~ 1 毫米2片。将组织, 很好地淹没在 pbs 中, 使用微解剖推拿器就位, 并使用无菌手术刀进行清晰的切割。避免撕裂 ft, 因为这会改变本地纤维血管结构。
5. 将每个单独的一块放入一个12井细胞培养板的井, 其中含有1毫升无菌 pbs。
   注: 如有必要, 在进行切割之前, 使用微解剖推子将 ft 轻轻地铺到盘子上。

3. 铸造直立纤维蛋白凝胶液滴, 用于本土 ft 和 ex 活体培养的表征

1. 消毒过滤在步骤1.2 中制备的现成纤维蛋白原溶液, 并将0.22μm 过滤器安装在10毫升注射器中。
2. 制备纤维蛋白原溶液 (每 1.5 ml 管 25μl) 并保持在 rt 中. 为解剖后获得的纤维蛋白凝胶/每块 ft 制备一个等价物, 并制备一对额外的阿立剂, 用于测试纤维蛋白凝胶的形成。
3. 准备 hbss 溶液, 其中含有 4 unitsml 和400μgl 的阿普利宁, 称为以下 ta 溶液, 并保持在 rt. 根据需要准备尽可能多的 ta 溶液, 根据解剖后获得的块的数量 (每一个使用25μl 的 ta 溶液ft/f蛋白凝胶), 以及额外的量 (例如, 250μl), 用于检测纤维蛋白凝胶的形成, 并确保在纤维蛋白凝滴的整个铸造过程中提供足够的溶液。
   注: 纤维蛋白聚合需要使用凝血酶, 同时添加前列腺素, 以防止 fts^{13, 14 所}表达的细胞蛋白酶降解纤维蛋白凝胶。
4. 测试纤维蛋白凝胶形成的时间: 在步骤3.2 中制备的脂肪含量的25μl 纤维蛋白原溶液中加入 25μl ta 溶液, 并使用另一台设置为50μl 的移液器, 通过移液在试管中混合, 并将其放入6厘米的细胞培养盘中, 形成一个直立的液滴。
   注: 纤维蛋白凝胶的形成应在 ~ 1分钟内发生。如果这需要超过 1.5分钟, 则通过添加更多凝血酶, 可以提高步骤3.3 中制备的 ta 溶液中凝血酶的浓度。最初使用的凝血酶的十分之一可以反复添加, 直到纤维蛋白凝胶形成在1.5 分钟内。纤维蛋白凝胶形成的时间对于培养的三维是至关重要的, 因为快速凝胶形成 (1.5 分钟内) 可以防止 ft 片沉入纤维蛋白凝胶底部, 从而与细胞的2d 塑料表面接触培养板, 可导致二维细胞粘附和生长。
5. 使用无菌推拿器将一块 ft 片放置在24孔板的一个井的中心, 并使用 0.5-10l 移液器移液来去除任何多余的 pbs, 以避免在 ft 上产生吸力。在纸巾粘在推特上的情况下, 使用额外的推特, 以帮助将纸巾放在盘子上。
   注: ffin 凝胶也可以在48孔板上铸造, 以减少试剂的使用。然而, 这更具挑战性, 因为空间比较有限, 如果与井壁接触, 纤维蛋白就会扩散。
6. 在步骤3.2 中所列的25μl 纤维蛋白原溶液中加入25μl 的 ta 溶液, 并通过移液在试管中使用另一台设定为50μl 的移液器。分配到 ft 件放置在板井, 移液器向上和向下2-3 倍, 以便包括 ft 件在直立的液滴内, 提供一个三维周围矩阵的 ft。
   注: 确保在移液过程中没有吸气 ft, 并且不会形成气泡。还确保混合、分配和移液快速进行, 因为纤维蛋白凝胶将在1.5 分钟内形成, 如步骤3.4 中测试的那样。如果将纤维蛋白凝胶浇注在48孔板上, 请改用20μl 的纤维蛋白原溶液和20μl 的 ta 溶液。
7. 对所有 ft 件重复步骤3.5 和3.6。
8. 允许纤维蛋白凝胶在加湿气氛中, 在37°c 的细胞培养孵化器中孵育板, 使其凝固.
9. 0.5-1 h 后, 检查纤维蛋白凝胶是通过小心倾斜板完全形成的。当凝胶在板倾斜时不移动时, 继续走第3.10 步, 表明纤维蛋白凝胶的形成是完整的。
10. 用体外培养基 (24μl·well) 或48米井板中 300μlwell) 覆盖 ft/f福林凝胶, 辅以100μgml 的阿普菌素。通过滴式分配轻轻将介质移注。
    注: 在这里, 前列腺素用于防止 f蛋白凝^胶降解的细胞蛋白酶表达的 fts 13,¹⁴。体外培养基还可补充重组生长因子, 如 vegfa、vegfc、bfgf、tgfβ (见材料表)¹¹。
11. 将 ft 体外培养板放回37°c、5% co2 细胞培养孵化器 , 并在所需时间段内进行培养 (例如, 2-18天, 需要测试更长的培养周期)。每三天用新鲜的体外培养基取代50% 的培养基。

4. "在矩阵中" 成像

1. 使用倒置的荧光显微镜, 在同一天 (第0天) 和设定的时间间隔 (例如,每隔一天) 获取 ft 外培养物的图像, 以跟踪3d 生长。
   注: 所获得的图像可用于对 ft 的外露量进行量化, 使其在外植体¹¹上的两个垂直直径的总长度。

5. 本土 ft 和 ex vivo 文化的终点

注: ft/f蛋白凝胶可以在所需的时间段内进行体内培养 (ft 前体内培养物), 也可以固定在同一天 (原生 ft),用于原生 ft 表征11。

1. 用 pbs 溶液中4% 的甲醛培养基取代培养基, 在 rt 中选择1% 的甲醛, 修复原生 ft 或 ft 的体外培养物。对于原生 ft/fbin 凝胶, 在添加体外培养基后固定 0.5-1 h (如果纤维蛋白凝胶未被浸泡在培养基中, 固定会对其造成伤害)。
   注: 在烟罩中执行此步骤, 因为多聚甲醛具有腐蚀性、毒性和致癌性。
2. 在 pbs (2mlwell) 中三次5分钟清洗 ffin 凝胶。
3. 将 pbs 替换为含有0.02% 氮化钠的 2 mll 井, 并将固定纤维蛋白凝胶存放在 4°c, 直至进一步加工。用石蜡膜密封板, 确保 ft/f福林凝胶在储存中不干燥。
   注: 在烟罩中执行此步骤, 因为氮化钠有毒。

6. 全山免疫荧光染色

注: 此协议持续 5天, 可以中断与夜间孵育, 在指定的地方。不要让纤维蛋白凝胶在任何时候干燥。除非另有说明, 所有步骤均在 rt 执行。

1. 在启动染色协议之前, 请准备以下解决方案。
   1. 固定后溶液: 准备50:50 丙酮: 甲醇溶液, 混合等量丙酮和甲醇 (例如, 50 毫升)。储存在-20°c。请在染色前一天准备此解决方案。此解决方案可存储在-20°c, 并可用于后续的污渍。
      注: 在烟罩中准备此溶液, 因为丙酮和甲醇是易燃且对健康有害的。
   2. 阻止溶液: 在 pbs 中制备15% 的胎儿牛血清 (fbs), 0.3% 的辛醇聚氧乙烯醚溶液, 首先在 pbs 中加入15% 的 fbs。加入辛酚聚氧乙烯醚, 搅拌溶解。存放在4°c。
      注: 此解决方案可以提前大量准备, 在-20°c 时存储在15毫升的报价中, 并在使用前在染色协议启动当天解冻。对于每个染色协议, 请使用新准备的或新解冻的算法。
   3. 洗涤溶液: 加入 4.5 ml 的辛醇聚氧乙烯醚至 995.5 ml 的 pbs, 辅以0.45 的辛酚聚氧乙烯基。搅拌溶解。存放在 rt。
2. 使用不锈钢方形边缘铲子小心地从盘子里提起液滴。先将液滴从边缘分离, 然后抬起中心, 转移到含有1毫升 pbs 的12孔板井。
   注: 在此钢板格式下执行固定后、清洗和阻塞步骤。
3. 用1毫升冰凉50丙酮固定液滴: 甲醇溶液约 1分钟 (液滴的边界会变白)。
   注: 在烟罩中执行此步骤, 因为丙酮和甲醇对健康有害。
4. 用3-5 洗的 pbs 冲洗 (补液完成后, 液滴将沉入 pbs 溶液中)。
   注: 避免接触液滴与移液器尖端, 因为, 固定后, 他们是粘的塑料。在整个协议过程中, 避免通过吸气来吸气后修复、抗体、堵塞和清洗溶液, 因为这可能会损坏或完全摧毁液滴。相反, 倾斜板, 并使用500-5000μl 移液器小心去除溶液。
5. 在 21, 000 x g 和4°c 下离心堵塞溶液 15分钟, 以去除碎屑。
   注: 该溶液可在 1.5 ml 管中进行离心。未使用的解决方案可存储在 4°c, 并用于所有相关的后续步骤。
6. 在 rt 将液滴在500μl 阻滞溶液中培养2小时。
   注: 为了减少所使用的封堵液的体积, 板材可以在支架上倾斜, 只需使用300μl 的溶液液滴。
7. 在适当稀释的阻断溶液中制备原生抗体混合物 (至少 30μl/droplet), 离心剂在 21, 000 x g 和4°c 时进行15分钟。
8. 使用圆刃铲子将液滴转移到圆形 (u) 底部96井板中, 并在4°c 下与原发抗体混合物的至少30μl/液滴孵育。
9. 第二天, 将液滴转移到含有2毫升洗涤液的12孔板中, 先用 3次5分钟的洗涤, 然后用9分钟的洗涤。在4°c 下留下最后一次清洗 (2 毫升) 过夜。
10. 第二天, 用 pbs 冲洗三次, 并将液滴转移到圆形 (u) 底部96孔板中。
11. 在清洗过程中, 在堵塞溶液中制备适当的氟结合二级抗体混合物 (稀释 1:500, 至少30μl/液滴), 离心剂在 21, 000 x g 和4°c 下进行15分钟。
12. 通过使用圆刃铲子将液滴转移到一个圆形 (u) 底部96井板, 并以至少30μl 的二级抗体混合物孵育, 在 rt 中保持4小时的光保护。
    注: 执行所有后续的孵育和防光清洗步骤。
13. 将液滴转移到12井板中, 其中含有2毫升的洗涤液, 用圆刃铲子冲洗, 先用3分钟的洗净, 然后用四次30分钟的洗涤。在4°c 下留下最后一次清洗 (2 毫升) 过夜。
14. 第二天, 用 5 0分钟的清洗, 然后用 p b s 冲洗凝胶3次。在4°c 下留下最后一次清洗 (2 毫升) 过夜。
15. 第二天, 用圆刃铲子和反污渍核, 在 rt 孵育 10μgl hoechst 核染色 (至少30μl/液滴) 30分钟, 将液滴转移到圆形 (u) 底部96孔板中。
    注: 可使用 4 ', 6-二胺-2-苯二酚 (dapi) 作为替代材料的安装介质, 用于核子反染色。在这种情况下, 将跳过此步骤和步骤 6.16, 直接进入步骤6.16。
16. 用圆刃铲子将液滴转移到含有2毫升 pbs井的12井板中, 并用 pbs 冲洗三次。
17. 将液滴安装在显微镜幻灯片上, 如下所示:
    1. 在方形 22 mm x22 mm 的覆盖玻璃边缘涂上一层狭窄的快速硬化安装介质, 并使其干燥约1分钟。对每个掉落单独执行此步骤, 以避免安装介质过度硬化。
       注: 在烟罩中执行此步骤, 因为快速硬化安装介质对健康有害。
    2. 用圆刃铲子将含有2毫升去离子水的12孔板的井中冲洗液滴, 转移到显微镜滑块上。用一小块吸水纸去除多余的水。
    3. 将15μl 的非硬化防褪色安装介质涂在液滴上。
       注: 或者, 如果未使用 hoechst 核染色, 则可使用含有 4 '、6-二胺-2-苯丙二醇 (dapi) 的安装介质。
    4. 轻轻地将盖板玻璃放置, 快速硬化安装介质面向微观滑块, 在液滴上放置。
       注: 快速硬化介质将粘附在微观滑块上, 并保持液滴就位。
18. 对所有液滴重复步骤6.17。在每张显微镜幻灯片上安装两个液滴。
19. 让幻灯片在 rt 干燥约 2小时, 并在4°c 过夜存放。确保幻灯片水平放置, 并免受光线影响。
20. 使用共聚焦显微镜或配备光学切片功能和20x 或40x 目标的直立皮荧光显微镜成像染色的原生或终点 ft 体外培养物。使用瓷砖功能一次捕捉组织的更大面积。

结果

对 pdr 纤维血管组织特性和蛋白表达的深入了解主要依靠玻璃体样品和薄组织学 ft^{部分 3,15,16,17}。为了建立一种方法, 彻底研究三维组织组织和多细胞生理病理过程的 pdr, 我们提出了利用手术切除, 患者衍生的病理 ft 进行三维表征和体外培养。新鲜的 ft 被转移到研究实验室并进...

讨论

考虑到相关组织微环境对可靠的功能细胞和分子力学结果的重要性, 有必要找到适当的实验模型, 提供这种组织环境。本文介绍了纤维蛋白嵌入 ft 的体外pdr 培养模型, 可以研究 pdr 病理生理学在 pdr 临床样本的本机、复杂和多细胞环境中的机制。

协议中的关键步骤是适当的纤维蛋白凝胶形成、ft 的定位和染色过程中的适当清洗。由于纤维蛋白凝胶的形成主要取决于凝血?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Microforceps	Medicon	07.60.03	Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - Sterile	Swann-Morton	0513	Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)	Greiner Bio-One	391-3210	Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-well	Greiner Bio-One	392-0049	Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL	Greiner Bio-One	391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL	Greiner Bio-One	525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF	Millipore	SLGV033RS	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mL	Braun	4606108V	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Fisher	FB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well	Nunc	142475	Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel	VWR	82027-528	Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	Used for mounting
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Used for mounting
Absorbent paper	VWR	115-0202	Used for mounting
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma	Calbiochem	341578
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9394-500ML	Used for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serum	Gibco	10270106	Used for preparing the blocking solution
Human Serum	Sigma-Aldrich	H4522	Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/ml	Biowest	L0011-100
Endothelial cell media MV Kit	Promocell	C-22120	Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	T9284	Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder	Sigma-Aldrich	T9549-500UN	Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder	Sigma	A3428	Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth factors
Recombinant human VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβ	Millipore	GF346	1 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL final concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary antibodies
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molecular Probes	A-21468	Used at 1:500 dilution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope	Zeiss		For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscope	Olympus		For FT dissection
LSM 780 confocal microscope	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT