墨西哥鱼基因功能的操纵

摘要

我们描述了在进化模型系统中操纵基因的方法. 描述了三种不同的技术: Tol2 介导的转基因、使用 CRISPR/Cas9 对基因组进行有针对性的操纵以及使用吗啡酮敲除表达。这些工具应有助于直接研究表面和洞穴居住形式之间变异背后的基因。

摘要

洞穴动物提供了一个引人注目的系统, 用于调查许多复杂特征的进化机制和遗传基础, 包括眼睛退化、白化病、睡眠不足、高血糖和感官处理。由于不同洞穴系统之间的环境压力, 来自世界各地的紫鱼物种表现出形态和行为特征的收敛进化。在实验室环境中研究了不同的洞穴物种。墨西哥的泰拉,具有视觉和盲目性的形式, 提供了独特的见解, 生物和分子过程的基础, 进化复杂的性状, 并作为一个新兴的模型系统的良好的准备。虽然在 mexicanus 中已经确定了调节不同生物过程进化的候选基因, 但验证单个基因作用的能力有限。转基因和基因编辑技术的应用有可能克服这一重大障碍, 并研究复杂性状进化的机制。在这里, 我们描述了一种不同的方法来操纵基因表达在 a. mexicanus。方法包括使用吗啡、 Tol2转基因和基因编辑系统来操纵马塞卡努斯的基因功能, 这些系统通常用于斑马鱼和其他鱼类模型. 这些协议包括详细描述定时繁殖程序、受精卵的收集、注射和转基因动物的选择。这些方法将允许研究遗传和神经机制的演变的不同性状的影响。

引言

自达尔文的物种起源^{1 以来}, 科学家们已经深入了解了由于洞穴生物2的作用, 这些特性是如何进化形成的, 以应对确定的环境和生态压力^.墨西哥的特拉, a. mexicanus, 包括眼睛祖先的 "表面" 人口居住在整个墨西哥和南部的得克萨斯州的河流, 以及至少29个地理上孤立的洞穴形态种群居住在塞拉德阿布拉和墨西哥东北部其他地区 3。一些与洞穴相关的特征已经被发现在一个维菌, 包括改变的耗氧量, 脱色, 眼睛的损失, 和改变喂养和觅食行为^{4,5, 6, 7,8,9}。由于清晰的进化史、对生态环境的详细描述以及独立演化洞穴的存在, mexicanus为研究收敛进化的机制提供了一个强有力的模型人口^10,11。在洞穴中存在的许多洞穴衍生特征, 包括眼睛丢失、睡眠不足、增加喂养、失去学业、减少攻击性和减少压力反应, 都是通过独立的起源多次进化的, 通常使用^{洞穴8,12, 13,14,15之间}的不同遗传途径。这种反复的进化是一个强大的方面 , 可以提供洞察更普遍的问题 , 遗传系统可能会扰产生类似的表型。

虽然基因技术在许多鱼类 (包括鱼) 基因功能机械调查中的应用有限, 但斑马鱼的最新进展为鱼类的基因技术发展提供了基础¹⁶,¹⁷,¹⁸,^19,20。许多工具被广泛用于斑马鱼操纵基因表达, 这些程序的实施早已标准化。例如, 在单细胞阶段注射吗啡寡核苷酸 (mo) 有选择地阻断 rna, 并在开发^过程中阻止短时间窗口的翻译 21, 22^.此外, 基因编辑方法, 如聚集定期间隔的短回文重复 (CRISPR)/crispr 相关蛋白 9 (Cas9) 和转录激活剂样效应核酸酶 (TALEN), 允许产生定义的缺失或在某些情况下, 通过基因组^{19、20、23、24 的}重组进行插入。转基因是用来操纵稳定的基因表达或功能在细胞类型的特定方式。Tol2系统有效地用于生成转基因动物, 方法是将转座酶 mrna 与含有转基因 25^,26的tol2 dna质粒进行共置。Tol2系统利用 Medaka 的tol2移位酶生成具有稳定性的转基因结构的种系插入。产生Tol2转基因包括为tol2转座酶17注入含有由Tol2整合位点和 mrna 两侧的转基因的质粒.该系统已被用来生成一系列的转基因线斑马鱼, 它的使用最近已扩展到其他的紧急模型系统, 包括鱼, 小鱼, 粘背, 以及最近, 墨西哥洞穴 27, ²⁸,²⁹,³⁰。

虽然紫鱼是一个迷人的生物系统, 用于阐明性状进化的机制, 但它作为进化模型的全部能力尚未得到充分利用。这在一定程度上是由于无法直接操纵遗传和细胞功能 31。利用定量性状位点 (qtl) 研究确定了调节复杂性状的候选基因, 但这些候选基因的验证一直^很困难, 有 32,^{33, 34}。最近, 利用吗啡进行瞬态击倒, 使用 CRISPR 和 T吃饭系统进行基因编辑, 以及使用Tol2介导的转基因技术, 研究了一些性状³⁵、³⁶、37的遗传基础.,³⁸。这些技术的实施和标准化将允许对生物特性的分子和神经基础进行操作, 包括基因功能的操纵、已定义细胞群的标记以及功能记者的表达。虽然这些基因工具的成功实施, 以操纵基因或细胞功能已在紧急模型系统中证明, 详细的协议仍然缺乏在a. mexicanus。

Mexicanus提供了对进化机制的关键洞察, 以应对不断变化的环境, 并提供了识别调节不同性状的新基因的机会。一些因素表明, mexicanus是一个极其可操作的模型, 用于应用现有遗传模型中现有的既定基因组工具, 包括在实验室中轻松维持鱼类的能力、大的育苗大小、透明度, 一个测序的基因组, 并定义行为检测³⁹。在这里, 我们描述了一种方法, 用于使用吗啡, 转基因, 和基因编辑的表面和洞穴种群的. 这些工具在马西卡努斯的更广泛应用将允许对海鱼和河豚发育、生理和行为差异演变背后的分子过程进行机械研究。

研究方案

1. 莫菲洛里诺寡核苷酸设计

注: 通过国家生物技术信息中心 (NCBI) 基因和 NCBI SARA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) 以及 Ensembl 基因组浏览器 (https://www.ensembl.org) 提供了a. mexicanus的序列。在设计用于表面和洞穴居住形式的吗啡时, 在这一阶段识别形态之间的任何遗传变异是至关重要的, 因此可以避免这些遗传区域成为吗啡的目标。吗啡目标站点内的任何多态性变化都可能导致无效的绑定。这种设计类似于斑马鱼等其他鱼类系统, 此前已在a. mexicanus^{21、36、40 中}被证明能有效工作.

1. 封堵吗啡的设计
   注: 转化阻断吗啡通过绑定到内源起始位点阻止翻译, 并阻止翻译机械通过斯特粒线结合 mRNA 序列。
   1. 从 ATG 起始位置开始识别目标基因的编码区域。
   2. 通过复制记录目标序列的前25个基对, 并将序列粘贴到文本编辑器或实验室笔记本中。
   3. 使用在线软件 (例如, http://reverse-complement.com) 或手动翻译, 生成目标序列的反向补语。将生成的反向补语保存在文本编辑器或实验室笔记本中。
   4. 从一家生成吗啡寡核苷酸的公司订购具有反向补数序列的吗啡。请参阅公司材料表。
2. 堵花吗啡的设计
   注: 分裂阻断吗啡块剪接, 从而防止形成成熟的 mRNA 分子。这为在起始位点未明确定义时进行击倒提供了另一种方法, 或者在需要通过聚合酶链反应 (PCR) 验证击倒时提供了一种更优化的方法。这种阻止脾的吗啡 (通过 atg 阻滞 Mo) 的好处是, 可以通过逆转录酶 (RT)-pcr 和凝胶上的大小差异在凝胶上可视化来很容易地评估外显子排斥或内含子。RT-PCR 和凝胶电泳, 以确定吗啡的疗效应使用标准的实验室程序。
   1. 识别目标基因的 mrna 前序列。利用来自 mexicanus 基因组的现有信息, 通过 Ncbi 或 Ensembl 确定内含子边界³³。
   2. 目标外显子 (拼接供体) 或内含子边界 (接合受体) 位点用于内含子夹杂物或外显子排除点。
      注: 拼接体通常以 5 ' 拼接点的内含子中的 "GU" 序列 (U1 目标) 为目标, 在 3 ' (U2 目标) 内耳接点处的"ag"序列为目标。在正常情况下, 拼接 U1 和 U2 亚基将这些目标位点结合在 mrna 前序列上, 以便进行适当的拼接。但是, 如果这些目标序列中的任何一个被吗啡阻止, 拼接体将移动到下一个可用的 U1 或 U2 站点, 从而导致 mRNA 序列中的内含子排除或外显子。这将涉及规划优化, 取决于目标基因²¹的性质。通常, 阻止内部 U1 站点会将拼接重定向到下一个可用的 U1 站点, 从而导致外显子切割。或者, 阻止第一个或最后一个拼接连接点会导致内含子, 因为没有其他站点将拼接重定向到。使用序列软件预测各种排除与包含的影响。预测可以表明潜在的帧和过早停止密码子, 表明一个更有效的目标站点的 mRNA 中断。
   3. 一旦确定了目标站点, 就将其顺序记录在文本编辑器或实验室书籍中。确保目标站点有25个基对 (bp) 长。
   4. 使用在线软件 (例如, http://reverse-complement.com) 或手动翻译, 生成目标序列的反向补语。将其顺序记录在文本编辑器或实验簿中。
   5. 从一家生成吗啡寡核苷酸的公司订购具有反向补数序列的吗啡。请参阅样品公司的材料表。

2. 注射用吗啡

注: 需要进行几种浓度或多体积的 mo 注射, 以确定最佳的注射浓度。典型的注射量为 400–800 pg 的 MO。吗啡敲倒的效果可持续长达6天注射后。

1. 获取库存吗啡。股票吗啡到达冻干。在使用所需的库存浓度 (例如, 4 mm) 之前, 用无菌 h2o 对其进行保湿。储存在- 20°c, 直至使用。

3. CRISPR gRNA 的设计、体外转录和制备

1. CRISPR gRNA 设计
   注: Grna 是利用 Varshney 等人和 Wierson 等人的先前公布的研究结果生成的.
   1. 使用基因组浏览器, 识别感兴趣的基因的编码区域。利用基因组序列, 通过寻找一个 20 bp 核苷酸目标测序, 从 GRNA 开始, 然后是 PAM 序列 (NGG), 来识别外显子中的 gRNA 目标序列。启动 (ATG) 后的基因区域将成为目标。
      注: 如果在该基因所需的外显子中找不到具有 5 ' 端 GG 的目标序列, 则可以用一个或两个g 替代序列末尾的第一和第二核苷酸。然而, 这两个 G的必须纳入寡核苷酸, 因为这些都是 t7 转录所必需的。
   2. 设计和订购一种基因特异性寡核苷酸 (寡核苷酸 A:5 '-taacactacacttagnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngttgattaagtagc-3')。在 T7 启动子序列 (红色) 和用于退火的重叠序列之间添加基因特异性 20 bp gRNA 目标序列 (带根), 而不添加 PAM 序列。退火和放大 (见步骤 3.2.1) 这个寡核苷酸 a 和第二个寡核苷酸 (寡核苷酸 B: 5 '-GOCCCCCACCCACTGGCACTGCTTCTGAGGGTAGTTTTATTATTATTATTACTTTTTTACTCTTAACTTAACTTAACT-3 ') 生成用于转录的 gRNA 模板。
      注: Oligo B 对于每个反应都是相同的, 只需订购1x。
2. gRNA 制备和转录
   1. 退火并放大寡核苷酸。包括以下引物来扩增 gRNA 以提高产量: 5 '-TAATACACACATA-3 ' (T7 引物) 和 5 '-Gatcgccacgggggggggg-3 ' (3 ' gRNA 引物)。使用kod聚合酶进行 PCR。
      注: 对于寡核苷酸 a 和寡核苷酸 b 中的引物, 建议使用10个周期以获得良好的产量。在 Wierson 等^人41 中可以找到详细的协议。
   2. 使用市售的体外转录试剂盒 (见材料表) 转录 gRNA。这是通过修改 Klaassen等人42公布的制造商协议来实现的.
   3. 如 Klaassen 等^人所述, 沉淀、清洗和重新悬浮 grna。
      注: gRNA 必须重新悬浮在无 rnase 的水中, 以防止降解。
   4. 记录 gRNA 的浓度, 这可以用分光光度计确定。通过在琼脂糖凝胶上运行2μl 来评估 RNA 的质量。在注射前, 请将其保存在- 80°c。
3. Cas9 制剂和转录
   1. Cas9 mRNA 可以使用商业上可用的体外转录试剂盒 (见材料表) 进行转录, 如前面^所述的43。使用 nls-cas9-nls^{版本 43}。
   2. 记录 gRNA 的浓度, 并通过在琼脂糖凝胶上运行2μl 来评估其质量。Aliquots RNA, 以避免通过多个冻融循环产生的分解, 并将等价物存储在-80°c.

4. 托2结构、托二转座酶和转染的制备

1. 准备 Tol2 转基因结构以进行注射。
   注: 我们已经成功地利用了公共/可用的斑马鱼和美达卡结构在a. mexicanus。这些结构在mexicanus中完全起作用, 这可能是因为序列同源性很高 (有关可用的结构, 请参阅 adgene 存储库和 Zebrafish 信息网络 (zfin) 数据库)。斑马鱼启动子碎片在mexicanus中使用时, 在预期的组织中表达了转基因。
   1. 获取 Tol2 结构或生成质粒与组织特异性启动子, 所需的转基因, 和 Tol2 臂 (见 Kwan 等人,⁴⁴)。收到后, 对构造进行排序以验证质粒。
   2. 根据制造商的指导原则, 对建筑进行准备.在无 Rnase-h2o 中清除最终质粒, 用分光光度计测定浓度, 将浓度稀释至 100–300 Ng/μl,并将结构储存在- 20°c.
2. 摘要 Tol2 转座酶质粒, 并合成 mRNA。
   1. 获取 Tol2 转座酶质粒 (Pcs-zt2tp) 的副本, 作为生成 Tol2 mRNA⁴⁵的模板。
   2. Midiprep Pcs-zt2tp 结构根据制造商的准则。在低容量的无 rnase 水或缓冲液中使用它 (~ 50μl)。将等价物存放在- 20°c。
   3. 使用限制性酶消化 Tol2 质粒。
      1. 使用表 1对10微克的圆形 pcs-zt2p 质粒进行限制性消化。
      2. 将反应分成2-50μl 反应, 并在37°c 的热循环中孵育反应.
      3. 第二天, 将酶加热到65°c20分钟, 使其失活。
      4. 在消化后立即纯化线性化质粒, 根据制造商的指南使用市售 pcr 纯化试剂盒 (见材料表)。在15μl 的无 rnase-h2o 中清除质粒, 并用分光光度计测定产品的浓度。
      5. 在1.5% 琼脂糖凝胶上运行1Μl 的消化质粒和1Μl 的未切割质粒, 以确认线性化质粒。
   4. 进行 Tol2 mRNA 的体外转录。
      1. 利用1μg 的线性化 Pcs-zt2tp 质粒作为转录模板。如表 2所示, 请遵循制造商的体外转录指南 (参见材料表).
      2. 根据制造商的指导, 在37°c的热循环中进行孵化.
      3. 加入1Μl 的 DNase, 按照制造商的准则, 在37°c的热循环器中孵育。
      4. 根据转录试剂盒协议执行氯化锂沉淀。将 RNA 颗粒在 ~ 20–30Μl的无 rnase h2o 中再置。
      5. 使用分光光度计确定产品的浓度, 并记录 RNA 质量。
      6. 将产品稀释至 ~ 100–300 ngμl, 并将其稀释为5-10μl 样品, 以避免重复冻融.将其存放在- 80°c, 直至使用。
         注: 可以用凝胶电泳检测1–2Μl 纯化的 Tol2 mRNA 是否有熔体带。

5. 微注射

1. 注射通用工具的制备
   注: Kovalko 等人46对本节中的程序作了详细介绍, 并在此概述了一些小的修改。
   1. 将溶解在鱼类系统水中的温暖3% 琼脂糖浇注到100毫升培养皿中, 生成注射板。小心地将一个鸡蛋注射模具放入新鲜倒的琼脂糖, 为鱼卵打井。将模具的侧面置于45°角, 然后将其慢慢降低到琼脂;慢慢降低模具在一个角度, 避免空气被困在模具下面。琼脂糖凝固后, 轻轻取出霉菌。板材可在4°c下存放、密封, 最长可达1周。
   2. 根据制造商的指导原则, 从硼硅酸盐玻璃毛细血管中拔针, 在电致针拉拔器中注射.该协议将因移液器拉拔而异;但是, 在表 3中可以找到一个拉针程序的示例。
      注: 优化针头对注射很重要, 因为太长的针头会弯曲而不是干净地穿透鸡蛋。
   3. 通过打破标准的玻璃移液器, 为鸡蛋的转移制作大口径玻璃移液器, 使开口足够大, 可以容纳鸡蛋。使用本森燃烧器, 通过将破碎的移液器的末端暴露在火焰中, 直到其光滑, 对玻璃破碎的端进行抛光。
2. 育种设置
   注: 有许多不同的协议用于繁殖a. mexicanus。有关详细的协议, 请参阅博罗夫斯基39。在注射前1周开始繁殖。
   1. 第1天, 将2至3名女性和3至4名男性放置在一个10加仑的油箱中, 保持在 24±1°c.
   2. 在第1天至第7天, 将喂养增加到每天约3倍。确保饮食包括生活食物, 如黑虫和盐水虾。
   3. 第6天, 添加一个设置为27°c的单罐式加热器. 实验室的水箱温度可能会有所不同;因此, 这将是一个增加 2-3°c相对于正常的储罐温度。
   4. 在第7天的晚上, 也就是注射之夜的晚上 (zeitgeber [ZT]9-11), 用水浸透的海绵彻底清洗储罐, 并用细网或虹吸管清除多余的食物或杂物。
   5. 在第7天的晚上, 开始检查 ZT15 的表面鱼卵, 并继续每15-30分钟检查一次, 直到 ZT18。对于空鱼, 开始检查鸡蛋在 ZT17, 并继续检查每 15-30分钟,直到 ZT20。
      注: 时间基于14:10 小时的光: 使用时间的暗周期。繁殖时间是估计, 个别实验室必须确定确切的时间。在卵被释放后不久收集卵子是至关重要的, 以便在单细胞阶段注射。
3. 单细胞级卵的收集
   1. 预计繁殖的夜晚, 每15-30分钟检查一次储罐,并监测储罐底部的鸡蛋。鸡蛋呈半透明, 直径约为1毫米。
   2. 使用一个精细的网状鱼网收集鸡蛋, 并将其转移到一个玻璃碗充满新鲜的鱼系统水。在显微镜下检查鸡蛋, 以确认鸡蛋处于单细胞阶段。
   3. 使用玻璃移液器, 将单细胞卵转移到注射板。在这个阶段需要玻璃移液器, 因为鸡蛋会粘在塑料上。
   4. 使用移液器, 小心地将鸡蛋释放到5.1 节琼脂糖注入板的井中。用最大鸡蛋数量 (每排 30–40, 最多5排) 填充预热 (室温下) 的注射板。完整的行有助于防止鸡蛋在注射过程中移动。用少量的鱼系水保持注射板上的鸡蛋水分, 直到注射的效果。
4. 皮针装置和一般注射优化指南
   1. 使用适合毛细管内部的凝胶加载移液器吸头或使用标准的微移液器吸头, 并在末端添加一个2-4Μl的螺栓, 以填充注射针。填充针头后, 使用钳子修剪注射针的多余长度。
   2. 使用安装在微机械手中的针头进行微注射, 连接到皮镜微喷射器上。
   3. 将注射时间设置为 0.03 s, 将压力设置为 ~ 0.0 psi。注射压力会相应地变化, 但针头之间的差异不大, 因此优化以实现 ~ 1.0 nL 注射螺栓。
      注: 注射压力通常在 ~ 10–30 psi 的范围内。
   4. 通过注入矿物油和测量螺栓大小与滑动千分尺, 以实现约1–1.5nl 注入量, 从而标准化注入孔。调整注射压力 (psi) 以增加或减少球体体积。
   5. 用实验室组织从鸡蛋的顶部抽水。
      注:阿斯蒂安克斯蛋绒毛膜比斑马鱼蛋稍微难以穿透。我们发现, 从鸡蛋顶部抽水有助于针头进入鸡蛋。板材优化可以让一个盘子上的鸡蛋约200个。
   6. 使用微机械手用针头穿透每个鸡蛋, 并直接注入蛋黄。一旦定位在蛋黄中, 通过按下注射按钮或注射脚踏踏板注射鸡蛋。
      注: 一个完整的板可以在 ~ 15分钟内注入。单细胞阶段持续约40分钟。
5. 吗啡酮注射液
   注: 在不造成毒性的情况下击倒所需的吗啡量需要针对每个基因靶标进行优化;然而, 集中 4 0 0 p 是一个很好的起点。
   1. 准备吗啡, 以便每个鸡蛋将注入 400 pg 的吗啡。在冰上解冻吗啡。注射溶液由吗啡 (在所需浓度下)、无 rnase h2o 或 D14.au 溶液和苯酚红色(最终体积的 10%) 组成.有关示例, 请参见表 4。
   2. 每个胚胎注入 1 nL。
6. CRISPR 注射
   1. 准备 RNA, 使每个胚胎注射 25 Pggg而 r, 300 pg mRNA 总数。关于 CRISPR/Cas9 注射混合物的样品, 见表 5。
   2. 将每个胚胎的 Grn\ cas9 mrna 直接注入胚胎 2 Nl。
7. 应用 Tol2 转座子和 Tol2 侧向质粒进行转染
   1. 在冰上解冻转座酶 mRNA 和 Tol2 质粒。将 Cas9 mRNA (在 25ngμl)、所需的 Tol2 结构 (在 25ng/μl) 和苯酚红色 (≤10%的最终体积) 结合在无 rnase 的水中.关于 Tol2 转基因注射混合物样本, 见表 6。
   2. 将注射溶液和针头放在冰上, 以避免 mRNA 的降解。以每个胚胎的体积为 1 nL 的速度注入。

6. 饲养和筛选注射鱼

1. 注入鱼饲养
   1. 注射鸡蛋后, 立即将其转移到玻璃碗 (10 x 5 厘米), 其中含有 ~ 200 毫升的鱼系水。鸡蛋很容易通过将注射盘浸入装满鱼水的碗中, 用移液器冲洗鸡蛋来冲洗。
   2. 每个碗放置~ 50–80个注射胚胎, 并在22–24°c下进行.
   3. 每天用注射的鱼清洗碗 2倍, 去除死去的胚胎, 每天改变 ~ 20% 的水。
   4. 额外的饲养是按照以前公布的协议^进行的.
2. 吗啡注射个体的筛选
   1. 在立体显微镜下对动物进行可视化, 以筛选表型。吗啡的作用可持续到注射^{后 21}~ 5天。
   2. 在注射后4天测量行为表型。
3. 对 CRISPR indels 的筛选
   1. 设计引物来扩增目标部位周围的基因组 DNA。设计引物, 使目标 PCR 产品约为100–125 bp。
      注: 例如, 对于caf2位点, 使用正向引物 5 '-ctctgggggggc-3 ' 和反向引物 5 '-ggggggtttttgatggc-3 ' 放大了 grna 靶点周围的区域, 用于 pcr 产品长度为 105 bp。
   2. 根据机构动物协议, 牺牲胚胎或鱼翅夹住成年鱼。
   3. 将胚胎或分离的鳍收集到 PCR 管中, 提取 DNA, 并进行 Pcr. 基因特异性引物的 PCR 样本方案可在ma 等人中找到。
   4. 为了评估诱变, 在 70 V 的3% 琼脂糖凝胶上运行 5μl PCR 产物, 3 h. 野生型 (非诱变化) DNA 将导致 PCR 产物作为一个独特的带。突变 DNA 会导致凝胶上有一个涂抹带。
   5. 为了确定突变等位基因的序列, TA 根据制造商的指令克隆 PCR 产品,选择菌落和微制备培养物。发送生成的 DNA 进行测序。
   6. 为了建立和维持传播突变等位基因的鱼类线, 将成年鱼与野生鱼类交叉注射, 并筛选5-10 个胚胎, 以确定是否有任何后代携带基因的突变等位基因, 遵循 6.3.1-6.3.6 步骤。
      注: 不同的_{f1 个体从}相同的 f₀创始人鱼可以携带不同的突变。确保突变系被排序, 以获得预测的突变, 从而产生出框架外的等位基因。
   7. 通过 PCR 识别携带突变等位基因的鱼类, 方法是使用涂抹带分析 (步骤 6.3.1-6.3.6) 或设计等位基因特异性 PCR 引物, 从而扩增突变带和野生型基位基因 (图 2C)。
   8. 一旦一条鱼的线建立, 纯合突变等位基因来测试隐性表型。
4. 转基因阳性个体的筛选
   注: 建议使用含有荧光制造商的结构来简化转基因阳性个体的筛选。然而, 标准的 PCR 筛选方法可用于筛查传输。
   1. 在注射后 2天, 将 F₀鱼的组织特异性荧光蛋白可视化, 并具有浅荧光解剖范围。
      注: F₀幼虫中的表达是马赛克的, 阳性个体可能有一系列的表达表型。
   2. 保持积极的个人作为 F₀创始人鱼。
   3. 当 F₀的成熟度时, 反交叉的创业鱼对非转基因个体来自于相同的数量/实验室股票。使用步骤6.2 中所述的相同协议筛选 F₁后代。
      注: F₁幼虫中的表达式是一致的, 并确保 f1兄弟姐妹之间的一致性。
   4. 由于 Tol2 整合不是现场介导的, 而不同的创始人之间的整合可能会有所不同, 因此选择 F₁兄弟姐妹得出一个 f0 创始人和杂交正表达 f 1兄弟姐妹来生成 f 2 s.这个后代将是稳定线的基础。

结果

多种群的血管居住 a . mexicanus显示减少睡眠和增加清醒活性相对于他们的表面居住的康特¹⁴。低聚体/奥氏症 (hcrt) 是一种高度保守的神经肽, 其作用是增加清醒, hcrt 途径中的畸变在人类和其他哺乳动物中引起嗜睡症 47,⁴⁸。我们之前已经证明, 洞穴a. mexicanus增加了 hcrt 肽的表达, 这表明这种肽的表达增加可能是导致睡眠丧失的...

讨论

在这里, 我们提供了一种使用吗啡、CRISPR/Cas9 基因编辑和转基因方法来操纵基因功能的方法。斑马鱼的丰富基因技术和这些系统的优化, 很可能会使这些工具轻松地转移到中.最近的发现在mexicanus中使用了这些方法, 但在调查该系统中的各种形态、^发育和行为特征时, 它们仍未得到充分利用。^,

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fish breeding & egg supplies
Fine mesh fish net	Penn Plax	BN4
Fish tank heater	Aqueon	100106108
Egg traps	Custom made	NA	Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs
Glass pipettes	Fisher Scientific	13-678-20C
Pipette bulbs	Fisher Scientific	03-448-21
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Egg molds	Adaptive Science Tools	TU-1
Morpholino supplies
Control Morpholino	Gene Tools, LLC	Standard control olio
Custom Morpholino	Gene Tools, LLC	NA
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290-100ML
CRISPR supplies
Cas9 Plasmid	AddGene	46757
GoTaq DNA Polymerase	Promega	M3001
KOD Hot Start Taq	EMD Millipore	71-842-3
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom
T7 Megascript Kit	Ambion/Thermofisher	AM1333
miRNeasy Kit	Qiagen	217004
mMessage mMachine T3 kit	Ambion/Thermofisher	AM1348
MinElute Kit	Qiagen	28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmid	Kawakami et al., 2004	Request from senior author
CutSmart Buffer	New England Biolabs	B7204
NotI-HF Restriction Enzyme	New England Biolabs	R3189
PCR purification Kit	Qiagen	28104
SP6 mMessenger Kit	Ambion/Thermofisher	AM1340
Microinjection supplies
Glass Capillary Tubes	Sutter Instruments	BF100-58-10
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Picoinjector	Warner Instruments	PLI-100A
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micromanipulator Stand	World Precision Instruments	M10
Micmanipulator Base	World Precision Instruments	Steel Plate Base, 10 lbs