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  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里, 我们提出了方法的高通量研究一系列的墨西哥紫鱼行为和重要染色的机械感官系统。这些方法使用自由软件和定制脚本, 为行为研究提供了一种实用且经济高效的方法。

摘要

栖息在洞穴中的动物进化出一系列的形态和行为特征, 以适应其永恒的黑暗和食物稀疏的环境。在这些特征中, 觅食行为是行为特征进化功能优势的有益窗口之一。本文介绍了分析振动吸引行为 (VAB: 自适应觅食行为) 和适应血管的 tetra、 Astyanax mexicanus相关机械传感器成像的最新方法。此外, 还提出了对包括多动症和睡眠损失在内的一系列额外的空鱼行为进行高通量跟踪的方法。紫鱼也表现出性, 重复的行为和更高的焦虑。因此, 空鱼作为进化行为的动物模型。这些方法使用可应用于其他类型行为的自由软件和自定义脚本。这些方法为商业上可获得的跟踪软件提供了实用和具有成本效益的替代办法。

引言

墨西哥的特拉, (Tele特征 idae) 在鱼类中是独一无二的, 因为它有两种截然不同的替代形态--一种是有视力的、表面居住的变形和一种由几种不同的形态组成的盲目的、洞穴居住的变形人口1。虽然在形态和生理上不同, 但它们仍然是干扰素2,3。这些干涉形态似乎发展迅速 (约 20, 000年)4, 使其成为研究快速适应的理想模型系统。据悉, 紫鱼具有一系列不同的形态和行为特征, 包括味蕾密度的增加、机械传感器数量的增加、按振动刺激的特定频率调整的觅食行为、多动症和失眠。其中许多行为可能同时进化, 其中一些被认为在黑暗的洞穴中觅食5和在黑暗和食物稀疏的环境中节能 6,7。

在许多进化模型系统中, 由于大多数物种分布在复杂环境中的连续梯度上, 很难获得关于动物形态和行为如何改变环境的综合知识。然而, 洞穴和表面变形的对比, 在一个尖锐的生态带描绘的高度对比的环境中演变, 导致阿斯特安纳克斯成为一个很好的模型, 了解动物的进化。这使得它能够更容易地将基因和发育过程与环境中的适应性特征和选择联系起来。此外, 最近对Astyanax这些特征的生物医学调查表明, 这些特征可能与人类症状8、9、10 平行.例如, 失去社交性和睡眠, 以及多动症、重复行为和皮质醇水平的增加, 与自闭症谱系障碍8中观察到的情况相似。

为了解决许多行为和形态特征的复杂的共同进化, 它是有利的, 以检测其中的许多突出潜在的遗传和分子途径。本文介绍了一种表征阿斯蒂亚纳克斯表面、洞穴和形态的洞穴型行为表型程度的方法。分析表型特征的焦点行为有空化觅食行为 (振动吸引行为, 简称 vab) 和多动症/睡眠持续时间11,12。还提出了一种与 VAB13相关的感觉系统的成像方法。最近, 许多用于运行行为检测的开源跟踪软件已经出现了14,15.这些工作非常好的短视频, 不到10分钟长。但是, 如果视频较长, 因为密集的计算跟踪时间, 则会出现问题。有能力的商业软件可能是昂贵的。所介绍的方法主要使用免费软件, 因此被认为是具有成本效益和高吞吐量的方法。其中还包括基于这些方法的代表性结果。

研究方案

所有程序都按照 "实验动物护理原则" (国家卫生研究所85-23 出版物, 1985年修订) 和 Manoa 机构动物护理和使用的夏威夷大学批准的准则进行委员会动物议定书17-2560-3。

1. 振动吸引行为 (VAB) 检测 (整个记录过程≤ 10分钟)

注: 使用红外敏感相机或通过修改 USB 网络摄像头构建红外摄像机。若要修改 USB 网络摄像头, 请参阅 Keene 实验室在 JoVE 的这一空富问题 (来自此a. mexicanus问题) 中提供的详细描述, 或补充材料中的简要描述。

  1. 录制设置
    1. 为确保相机保持在位置, 仍然, 并在适当的焦距从主题被记录, 建立一个黑匣子框架的聚氯乙烯 (PVC) 管, 测量120厘米 H x 45 厘米长 x 90 厘米宽。
    2. 框架结构建成后, 用塑料遮光幕覆盖, 如用于水培农业的窗帘。
    3. 在框架的顶部, 放置一个黑色的丙烯酸板, 其中一个窗口的红外热像仪在中心测量相同的直径, c 安装可调变焦镜头。在此框中, 放置 VAB 检测设备 (图 1)。
  2. 振动装置
    注: 振动是使用小型函数生成器产生的。
    1. 对于以下方法, 将振动调到 0.15 mm 的振幅和 40 hz 的频率, 这是引起吸引力5,16的最大响应的频率。
    2. 将函数发生器连接到水平面扬声器。
    3. 使用热胶或垫片粘合剂, 将直径为14厘米的7.5 毫米玻璃棒连接到扬声器表面的防尘罩上。
    4. 垂直于此杆, 并朝下, 附加另一个7.5 毫米直径的玻璃棒4厘米长 (图 1)。
  3. 行为检测
    1. 在充满有条件的水 (ph 值在6.8-7.0 之间, 电导率约 700μs, 温度约 22°c) 的圆柱形检测室中进行为期4天的实验.通过观察鱼类对觅食的潜伏期, 检查它们是否已经适应了。比他们的家坦克更长的延迟表明更多的适应时间是需要的。在整个驯化过程中, 每天用活的青蒿素喂养一次。
    2. 在检测前一天 (经过3天的驯化), 将检测室中的水替换为新鲜的调理水。
    3. 在检测当天 (经过4天的驯化), 剥夺实验鱼的食物, 直到检测完成。讽刺会改变他们对振动的反应。
    4. 在 Ver除 Dub 免费软件17:15 框架中设置录制参数, 编解码器: x264vfw, 录制持续时间: 3分30秒。
    5. 通过调谐到 40 Hz, 准备发射振动装置 (见步骤 1.2)。有关设备的说明, 请参见图 1 。用去离子水冲洗振动玻璃棒, 去除任何水溶性化学物质。
    6. 在黑暗中工作, 将检测缸放置在记录舞台上, 在黑匣子中使用红外背光, 让鱼类适应3分钟。
      1. 3分钟适应后, 录制 3分钟30秒的视频。在录制开始时, 将振动玻璃棒插入水柱 (深度约0.5 厘米)。
      2. 避免在水中放置振动玻璃棒时产生任何噪音或振动, 因为鱼甚至可以感觉到最轻微的干扰。
      3. 在开始视频录制的30秒内完成此过程, 以确保记录超过3分钟的行为。
    7. 录制时监视视频, 以确保在此阶段不会发生错误。
    8. 完成记录后, 从圆柱形检测室取出振动玻璃棒, 并将检测室从记录阶段取出。从1.3.5 对下一条鱼重复。
  4. 视频分析
    注: 将编解码器转换为 ImageJ 只能加载的格式, 仅适用于 Windows 操作系统18 (表 1)。
    1. 将压缩的 avi 视频转换为 ImageJ 的可读格式, 并设置分析参数。
      1. 安装 AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/)、pfmap 生成 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) 和 avfs ver1.0.0.5 或 ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/)。请注意, 此方法对程序版本敏感。所提供的网站链接将指导适当的版本 (表 1)。
      2. 通过双击avs _ cret . bat (补充文件) 运行批处理文件。右键单击要分析的 avs 视频文件 (从avs _ cre特. bat 创建的 avs 文件中进行选择)。
      3. 由于使用 ImageJ 中的跟踪器插件进行视频分析需要加载 ImageJ 宏 (补充文件M馆 _ vab _ moko. txt), 因此通过拖放到 ImageJ 的 gui 外壳中加载该宏。此宏将为以下分析启用某些热键。
      4. 在工作目录中, 创建一个名为 "Process _ ImageJ" 的新文件夹。
      5. 右键单击要分析的. avs 文件 (从avs _ cre特. bat 创建的 avs 文件中进行选择)。选择 "快速装载" 选项。将 avs 文件安装为外部驱动器后, 在 ImageJ 中打开 avi 文件 (avi 文件的名称以 ". avi" 结尾)。
      6. 若要设置距离测量的比例, 请使用直线选择工具在检测室之间绘制一条直线来选择检测室的直径, 然后单击 "分析 > 设置刻度" 功能。例如, 如果使用内径为9.4 厘米的圆柱形盘子, 则输入9.4厘米。选中"全局" 的无线电框, 以便在以下所有视频分析中实现规模标准化。
    2. 转换为二进制堆栈并运行分析。
      1. 使用椭圆选择工具复制检测室区域, 然后右键单击并选择 "图像 ≫ 复制".此时, 请指定要进一步分析的帧范围, 例如, 在振动杆进入水中后保留前 2, 700 帧 (在15帧/秒时, 这正好是3分钟的视频)。
      2. 清除检测室的外部, 并通过点击键盘数字栏上的热键7转换为二值图像。
      3. 背景清除并出现提示后, 使用已设置为黑色的椭圆选择工具, 在中心添加一个黑点, 以指示振动玻璃棒的位置 . 单击"确定",将出现一个提示, 以继续进行阈值调整。
      4. 设置阈值, 使鱼的二进制 (全部黑色和白色) 图像。调整阈值, 以便在整个视频剪辑中可以看到鱼, 然后选择"应用"。
      5. 通过点击数字栏上的热键8运行 "跟踪器" 插件.在提示时将最小像素大小设置为 100, 并点击ok, 为所有3分钟的二进制视频生成振动杆和每帧鱼之间的距离。
      6. 调整视频中噪音产生的误跟踪。为此, 请检查"结果"窗口, 以确定返回3号或3号物体的帧, 指示这些框架中的额外物体 (例如, 水中的颗粒或棒透明臂的阴影), 以及 "杆" 和 "鱼" 中的 "杆" 和 "鱼"。框架。使用画笔工具删除任何多余的对象。
      7. 点击数字栏上的热键9导出整个视频的二进制图像堆栈 (在需要重新分析的情况下) 和具有坐标和距离数据的. xls 文件 (补充文件cf01. xls, Threshold_CF01.tif 和, Trac_CF01.tif).热键9还将关闭与当前视频关联的所有文件。对所有复制重复步骤1.4.2.1 到1.4.2.6。
      8. 运行宏脚本 (补充文件JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) 将多个跟踪器结果文件 (. xls) 合并到一个电子表格中, 并将方法的数量和持续时间计算为距离该根线1.5 厘米的区域。不持续至少0.5秒的方法将不计算在内。根据感兴趣的特定问题, 更改距离和时间的参数, 作为一种方法。
    3. 完成所有分析后, 释放 PC 磁盘空间。删除已装入的文件, 以释放磁盘空间-avi. avi 和. avi. avs 文件 (由软件生成的扩展名)-通过在 1.4.1.2 部分中运行 avs _ cret . bat 的同一文件夹中运行批处理文件多卸载. bat. bat。

2. 睡眠和多动症检测 (24小时记录)

  1. 行为检测
    1. 5种实验鱼, 每室4天或4天以上, 在一个定制设计的 10 L 丙烯酸记录水族馆 (45.9 厘米 x 17.8 厘米 x 17.8 厘米; 长 x x 深度, 分别) 充满了条件水 (见步骤 1.3.1)。
      1. 将每个单独的腔与黑色丙烯酸板分开, 使腔体大小相等, 尺寸为 88.9 mmx177.8 mmx177.8 毫米 (图 2)。一定要覆盖每个鱼缸, 以防止鱼在房间之间跳跃。
      2. 将可编程电源计时器设置为在适应期间自动打开白光 led 灯 12小时, 并在适应期间每天关闭 12小时 (例如, 将灯设置为上午 7点, 将关闭时间设置为晚上 7点)。这将使鱼的生理节律 (如果它容易被夹带)。
      3. 使用不透明的白色丙烯酸板类似的 10 l 罐作为扩散器通过白色和红外光, 以便提供漫射光, 在所有坦克的均匀强度。
      4. 在整个驯化过程中, 每天用活青蒿素喂养一次, 并在每个水族馆内通过海绵过滤器提供曝气。
        注: 确保鱼在一致的时间 (即每天 1 x 在上午 9:00), 因为喂养时间也会影响生理节律19的夹带。
      5. 通过观察鱼类对觅食的潜伏期, 检查它们是否已经适应了。比他们的家庭坦克更长的延迟表明更多的适应时间是需要的。
    2. 在检测前一天 (3天或更多次的驯化), 将检测室中的水替换为新鲜的调节水 (见步骤 1.3.1)。
    3. 在 Ver除 Dub 软件17:15 框架中设置录制参数, 编解码器: x264vfw, 录制持续时间:86, 400 秒 (24小时)。
    4. 打开录制阶段后面的红外背光 (参见图 2)。通过观察屏幕上的 Ver除 Dub 实时图像, 调整每个水族馆的位置, 使它们面对 USB 摄像头。
    5. 在录制当天, 用活的青蒿素喂每条鱼, 取出所有海绵过滤器, 然后打开红外背光。
    6. 在上午开始24小时录制 (例如, 开始时间为上午 9:00, 完成时间为第二天上午 9:00)。开始捕获视频并保护位置以避免干扰。定期检查录制是否正在运行。
    7. 24小时后, 确保视频正确保存。将视频传输到 PC 工作站, 以跟踪和分析鱼的行为。
  2. 视频分析
    1. 首先, 通过查看照明来检查视频质量。检查每个部分是否有一条鱼, 是否有任何外国移动可能导致误跟踪。
    2. 准备好面罩, 避免在水族馆外误跟踪。制作两个面具: 一个是 "偶数", 一个是 "奇鱼", 根据它们在鱼缸中的顺序。
    3. 为上述掩码创建两个名为 "奇数" 和 "偶数" 的文件夹。在每个文件夹中移动 SwisTrack 的跟踪参数文件。
    4. 打开 SwisTrack 跟踪软件 (补充文件跟踪 _ odd. swift 或跟踪 _ even.swistrack) 的跟踪参数文件。指定视频文件和掩码文件的路径, 然后保存并退出跟踪参数文件。根据实验, 分别在 "Blob 检测" 和 "最近邻居跟踪" 组件中调整 blob 数量和最大像素参数。
    5. 双击运行一个脚本的胜利自动化软件, 这将自动打开 SwisTrack 软件 (补充文件swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe 或 swistrack_4.exe-这些都是相同的可执行文件), 这帮助更新 SwisTrack 中的自适应背景减法。
    6. 打开跟踪 _ odd . Swistrack 或跟踪 _ Evenx. SwisTrack 在 swistrack 软件中加载跟踪参数文件。加载参数后, 按下运行按钮开始跟踪。
    7. 在最初的 9, 000 帧 (600秒, 即录制视频的前 10分钟) 内, 通过查看 SwisTrack 组件列表中的自适应背景减法、二进制掩码和最近的邻居跟踪来检查鱼的跟踪是否有效 (请参见附带的视频)。然后在 "组件" 列表中选择自适应背景减法。
    8. 点击键盘上的r按钮, 恢复成功自动化, 让电脑跟踪。对于具有 4 cpu 内核和 8 GB 内存的桌面, 跟踪将每24小时视频需要5-7 小时。根据需要, 运行多个 SwisTrack 进程 (包括单个视频文件的奇数和偶数个场), 直到 CPU 中的内核数。例如, 4 核可以同时处理4个视频。
    9. 在此跟踪过程中, 请避免将此 PC 用于其他目的, 因为赢光自动化程序会自动移动鼠标指针。最初的 9, 000个帧将在以下过程中被丢弃。
    10. 将 3 Perl 脚本文件 (1.fillupGaps2.pl、2.Calc_fish_id_moko_robust 和 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) 分配到包含 swistrack 在 "偶数" 和 "奇数" 文件夹中生成的跟踪文件的文件夹中 (请参阅步骤 2.2.3)。
    11. 使用 Ver除 Dub 从视频文件中剪辑视频的一帧, 并将此剪辑作为照片导入 ImageJ。选择水族馆的长度 (45.9 厘米) 在 ImageJ, 并计算像素/厘米比率。在文本编辑器程序中以1.fillGaps2.pl写入像素/厘米比率并保存。
    12. 启动 CygWin 程序, 一个 Unix 仿真器。通过在命令行上使用cd , 找到包含 3 perl 脚本的 SwisTrack 文件夹。
    13. 通过键入Perl 1.fillGaps.pl来运行 perl 脚本。这三个 Perl 脚本将每个跟踪文件分配到水族馆的一个独特的房间, 并分析睡眠时间和游泳距离, 而鱼是清醒的。完成分析需要1-2小时。
    14. 评估名为"摘要 _ sleep. txt" 的文本文件, 以确定从分析中删除的帧数是否为可接受的低;丢失少于15% 的帧被认为是可以接受的。
    15. 将分析的结果从"摘要" _ 夫) 中复制并粘贴到带有宏 (补充文件Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm) 的电子表格中。
    16. 运行宏以提取跟踪文件的汇总数据。

3. 机械感觉神经瘤的 DASPMI 或 DASPEI 染色

注: DASPMI 和 DASPEI 染色是光敏的, 应在黑暗条件下进行。下面的协议是使用 DASPMI 作为一个例子, 同时为 DASPMI 和 DASPI。

  1. 染色协议
    1. 对于总共1升的染色库存溶液 (25μg/ml), 在 Dh2o 的1升中加入 0.025 g 的 DASPEI 或 DASPMI 晶体, 让它溶解一夜。将溶液存放在 4°c, 不受光线影响。
    2. 在22°c 的黑暗环境中, 将鱼浸入溶解在有条件水中的 2.5Μgml daspmi 或 DASPI (见步骤 1.3.1) 45分钟。
    3. 45分钟后, 将鱼从 DASPMI 或 DASPI 溶液中取出, 浸泡在有条件的水的冰浴中, 用66.7 微克/丁基乙基 3-氨基苯甲酸甲烷磺酸盐盐 (MS222) 麻醉。
    4. 将鱼放在培养皿板上, 并在荧光显微镜下拍照。获取 z 堆栈图像并另存为. tif 文件, 以便进行以下分析。
  2. 使用 ImageJ 进行图像分析
    1. 在包含. tif 文件的文件夹中, 粘贴 ImageJ 宏文件 (neuromast _ imagejjtxt) 的模板, 并创建一个名为 "Process _ imagej" 的新文件夹。在 ImageJ 宏文件中, 设置当前目录的路径。
    2. 启动 ImageJ 并通过将宏文件拖到 GUI 中或单击 "文件 ≫ 打开并选择宏文件来打开宏"。
    3. 通过单击"宏" ≫ "运行宏"来运行宏。然后, 该宏将自动打开要分析的图片文件。如果图片文件未打开, 请单击 "宏 ≫ 文件拾取".
    4. 对于神经桅杆量化, 请使用多边形工具选择感兴趣的区域。
    5. 按热键5复制感兴趣的区域。
    6. 使用"画图工具" 删除或添加点, 以便从上一张图像中获取额外或缺失的神经母细胞, 然后点击6。命中6后, 将出现两个新窗口: 编号神经递甸方案和一张总神经运动量化的表格。
    7. 点击7保存这两个文件: 一个文件存储为. tif 图像文件, 另一个保存为. xls 文件。存储这些文件后, 将打开一个新的图片文件进行分析。
    8. 通过运行宏脚本 (Sn _ number _ Diameter. xlsm), 将每个鱼的神经母粒计数合并到一个电子表格中。

结果

本文给出的结果是用所提出的方法可以获得的有代表性的例子。因此, 根据实验条件, 结果可能会与这里给出的鱼和河豚稍有偏差。

振动吸引行为

VAB 的代表性结果可以在图 3中找到洞穴鱼和河豚。注意表面鱼的边缘跟随行为 (图 3 a...

讨论

这些方法易于访问, 但由于其免费软件起源的性质, 可能会很复杂。因此, 强烈建议在进行任何实际试验之前进行试验检测和分析。

一旦建立了实验和分析框架, 数据生成的速度就会很快。一旦建立, 它可以记录两条鱼在7分钟内的 VAB 检测, 30 鱼在24小时的活动/睡眠检测, 和一条鱼2.5 至3分钟的神经质体成像, 从 MS222 麻醉到最终的图像捕获。根据所使用的计算机的性能, 视频和图?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢包括 N ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Cetraro, N. simon, C. valdez, C. Macapac, J. choi, l. lu, j. Nguyen, s. Podhorzer, H. Hernandes, j. fong, j. Kato 和 i. lorder, 用于本手稿中使用的实验鱼。我们还感谢基恩实验室成员, 包括 P. Masek 训练我组装红外 CCD 摄像机。最后, 我们要感谢夏威夷 a ' i Mānoa 大学通信学院媒体实验室, 特别是 B. smith、J. lam 和 S. white, 为制作视频提供了宝贵的帮助。这项工作得到了夏威夷社区基金会 (16CON-78919 和 18CON-90818) 和国家卫生研究所 (P20GM125508) 向我的赠款的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide)MilliporeSigmaD3418
880 nm wave length black lightAdvanced IlluminationBL41192-880
avfsfreewareVersion 1.0.0.6http://turtlewar.org/avfs/
AvisynthfreewareVersion 2.6.0http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
CygwinfreewareVersion 2.11.0https://www.cygwin.com/
Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish)Corning3140-10010 cm diameter 5 cm high
Ethovision XTNoldus Information  Technology, Wageningen, The NetherlandsVersion 14https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, BlackJardin (through Amazon.com)NASponge filter for Sleep/hyperactivity recording system
Grade A Brine shrimp eggsBrine shrimp directBSEA16Z
ImageJfreewareVersion 1.52ehttps://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lensToyoNAAttach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer
Neutral RegulatorSeachemNA
Optical cast plastic IR long-pass filterEdmund optics43-948Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam
pfmapfreewareBuild 178http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom)
Reef Crystals Reef SaltInstant OceanRC15-10
SwisTrackfreewareVersion 4https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam)MicrosoftQ2F-00013Cut 2-2.5 cm of the front
WinAutomationfreewareVersion 8https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)
Windows operating systemMicrosoft7, 8 or 10https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfwfreewareNAhttps://sourceforge.net/projects/x264vfw/

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