一种评估和定量中性粒细胞外细胞陷阱形成的高通量检测

摘要

该协议描述了一种高度敏感和高吞吐量的中性粒细胞细胞外陷阱 (net) 检测方法, 用于通过免疫荧光三维共聚焦显微镜对体外网络形成进行半自动定量。该方案可用于评估 net 在不同刺激后的形成和降解, 并可用于研究潜在的 net 靶向疗法。

摘要

中性粒细胞外陷阱 (net) 是一种免疫性细胞外 dna 结构, 可由中性粒细胞释放于多种触发因素。母语已被证明是一种重要的宿主防御机制, 可捕获和杀死微生物。另一方面, 他们与各种系统性自身免疫性疾病有关。net 是一种免疫原性和毒性结构, 包含一系列相关的自身抗原, 包括抗中性粒细胞质抗体 (anca) 相关血管炎 (aav) 和系统性红斑狼疮 (sle)。根据刺激的不同, 可以诱导不同形式的英语教师。可使用不同的技术来量化 net 的数量, 包括测量上清液中的 dna 释放, 测量与网络分子 (如髓质过氧化物酶 (mpo) 或中性粒细胞弹性酶 (ne)) 的 dna 络合, 测量是否存在被瓜氨酸的物质组蛋白通过荧光显微镜, 或流式细胞仪检测的 nt 成分, 所有有不同的特点, 其特异性, 敏感性, 客观性和数量。这里是一个使用三维免疫荧光共聚焦显微镜以高度敏感、高通量的方式量化体内网络形成的方案。该方案可用于解决有关网络在健康和疾病中形成和降解的各种研究问题。

引言

中性粒细胞外陷阱 (net) 的形成是中性粒细胞在细胞外三维 (3d) 网状结构中释放其 dna 的过程, 与广泛的抗菌和危险分子、颗粒状和细胞质酶、肽和蛋白质。这些免疫原性和毒性结构通过捕获和杀死传染性病原体在健康人的先天免疫防御中具有重要的生理作用¹。然而, 他们也被证明参与血栓^形成2 和各种全身自身免疫性疾病, 包括抗中性粒细胞质抗体 (anca) 相关血管炎 (aav) 3, 系统性红斑狼疮 (sle)^4,5, 抗磷脂综合征 (aps)^2,6, 类风湿关节炎 (ra), 牛皮癣, 痛风^{7, 8,9}.

体外网络的形成已被广泛的研究与化合物 phorbol 12-米里州13醋酸盐 (pma), 诱导大量的 net 形成。然而, 大多数生理刺激诱导净形成¹⁰的水平要低得多。例如, 为了研究自身免疫性疾病设置中的 net 触发因素, 需要进行标准化、灵敏、高通量的定量检测, 以检测和量化 net 的形成。事实证明, 对英语教师进行量化具有挑战性, 目前采用不同的方法, 每种方法都有自己的优势和局限性¹¹。一种常用的方法是检测上清液中的 dna 12, 这是客观的, 但不区分 dna 的来源 (凋亡、坏死、英语), 因此对英语不是很具体。其次, 与 nt 特特特特特特异性蛋白质 (例如髓过氧化物酶 (mpo) 或中性粒细胞弹性酶 (ne)) 相结合的 dna 的酶联免疫吸附法 (elisa) 是一种更具体的检测 net 的方法, 并被证明与瓜氨酸组蛋白 3 (cith3) 阳性英语网 13。然而, 不知道这种方法是否足够敏感, 可以接收所有的英语, 例如, mpo、ne 和 cith3 负英语网络)。第三种方法是免疫荧光显微镜, 用于检测与 nt 相关的分子 (ne、mpo、cith3) 与细胞外 dna 的共同定位, 以量化 net。此方法通常是特定于英语, 但不能作为高吞吐量方法应用, 并且由于观察者偏差而不客观。此外, 此方法不考虑 mpo-n-、ne-teh3、cith3 负极英语, 这些网络 nt 通常存在, 具体取决于所使用的 net-tt-t15岁.流式细胞仪方法通过改变的向前散射 (fsc/ssc) 检测到 net, 表明在网络中性粒细胞16中细胞核肿胀.这种方法没有考虑到已经确定的不同形式的 net 形成, 这可能不涉及细胞核的膨胀, 如重要的 net 形成¹⁷。最后, 免疫荧光共聚焦显微镜已被应用于可视化和量化 net 形成直接染色细胞外 dna 与细胞不透的染料, 染色细胞^外dna 12^,18。一般情况下, 5 到10个大功率场是人工拾取和评估的, 其中包括96孔^{板 11,17}的每口井1-5。手动选择图像并不总是客观的, 容易产生偏差, 对高通量分析没有吸引力。最近开发了一种自动化、高吞吐量的 net 定量分析, 通过 z 堆叠免疫荧光共聚焦显微镜, 以3d 方式对11% 的油井进行成像, 覆盖 13μm, 从而形成了一种高度敏感的技术来评估 net与传统方法相比 10。本报告描述了通过使用3d 共聚焦显微镜的自动、高度敏感的检测量化 net 形成的最新协议, 该方法实现了每口井45% 的总成像面积, 并通过 z 堆栈覆盖27μm。该协议适用于以客观、公正的方式量化, 具有高灵敏度、低级别的 net 形成。

研究方案

所有患者和健康对照组同意参加 lumc 生物库。这两项生物生物学研究都得到了 lumc 伦理委员会的批准。

1. 健康中性粒细胞的分离

1. 在两个10毫升 edta 涂层管中从健康的献血者身上获得20毫升的外周血。
2. 将10毫升血液放入无菌50毫升管中, 加入磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 最高可达32.5 毫升。
3. 在细胞下添加密度梯度 (例如, 菲科勒-胺水杨酸)。
   1. 采用10毫升的管式和管式控制器, 采用14毫升的密度梯度。
   2. 将移液器放在50毫升管的底部。
   3. 将移液器控制器从移液器上取下, 允许密度梯度通过重力从管道流出, 直到毛细管效应达到最大值 (将留下1-2 毫升), 而无需使用电机。
   4. 通过将拇指放在移液器顶部进行移除, 从而防止在移液器拆卸过程中出现密度梯度泄漏。
4. 在 912 x g 和室温 (rt)下旋转管 20分钟, 无需加速或刹车。
   请注意:红血球 (rbc) 和中性粒细胞密度高, 位于 5 0 毫升管的底部。外周血单个核细胞 (pbmc) 作为一个白色环被分离, 并在密度梯度之上。pbs 稀释的血浆将高于 pbmc。如果需要, 可以通过将白色环转移到带有 pbs 的额外清洗步骤的新的 50 ml 管来隔离 pbmc。
5. 首先小心去除含有 pbmc 的白环, 然后取出 pbs 稀释的血浆, 最后尽可能地去除密度梯度层。
6. 为了从中性粒细胞中分离中性粒细胞, 用冷不育蒸馏水裂解红细胞。
   1. 从冰箱中取出一个浓度为10倍的冷菌蒸馏水瓶和一个10倍浓缩的 pbs 烧瓶。
   2. 快速完成此步骤。直接在颗粒上加入36毫升的冷菌蒸馏水, 并仔细搅拌一次。在20秒后加入4毫升的 10倍 pbs, 制成同位素溶液。仔细混合一次。
   3. 在 739 x g和4°c 下旋转管 5分钟 (用于去除 rbc)。中性粒细胞会出现在白色的颗粒中。
   4. 小心地丢弃上清液。再次执行步骤 1.6.2, 并确保颗粒正确悬挂。
   5. 在 328 x g和4°c 下旋转管5分钟。
   6. 小心去除上清液, 在 pbs 5 毫升中重新悬浮颗粒。数一数中性粒细胞, 让它们放在冰上。
      请注意:1管血液 (10 毫升) 的预期产量约为15-75亿个中性粒细胞。

2. 中性粒细胞的红色荧光细胞标签

1. 在15毫升管中的 pbs 2 毫升中, 使中性粒细胞悬浮液 10-20 000万零基。
2. 在不同的 15 ml 管中, 用4μl 的2μm 红色荧光电池链接器 (见材料表) 制作 2 ml pbs 的溶液。轻轻地加入这个中性粒细胞悬浮液, 并仔细混合。
3. 在黑暗中在37°c 下完全25分钟的时间, 用红色荧光细胞链接器标记中性粒细胞。
4. 在 rt 高达15毫升的 rt 中加入含有10% 热灭活胎儿牛血清 (fcs) 的 rpmi 1640 培养基, 并仔细混合一次, 从而使标记失效。如果颗粒形成, 请确保颗粒被小心地重新悬浮。
5. 旋转管5分钟在 328 x g 和rt。
6. 去除含有 2% fcs 和 10% p任何 s 的无酚 rpmi 1640 介质5毫升中的上清液并再悬浮颗粒。
   请注意:红色荧光细胞标记后, 可能会发生50% 的细胞丢失。

3. 中性粒细胞外细胞陷阱形成的诱导

1. 在含 2% fcs 和 10% pcs的无酚红 rpmi 1640 培养基中, 使细胞悬浮液为 0.42 x 10 6 cellssml。
2. 在一个黑色的96井扁平底板中, 每口10μl 中加入 37, 7500 中性粒细胞。
3. 加入10μl 的所选刺激 (如病人血清) 一式三份, 以达到10% 的浓度在井中。始终包含负控制 (介质) 一式三份。
4. 在黑暗中在37°c 下孵化所需时间, 从30分钟到2、4或6小时不等. 建议在黑暗中孵化4小时。
5. 计算添加 25μl 5μm 不渗透 dna 染料所需的体积 (见材料表), 以达到井内1微米的最终浓度。如有必要, 可在含有 2% fcs 和 10% pcs 的 rpmi 1640 介质中进行稀释, 以获得5μm 浓度。
6. 在孵育时间结束前15分钟加入 25μl 5μm 不渗透 dna 染料。在黑暗中37°c 时继续孵育15分钟。
7. 非常小心地取出上清液 (~ 125μl), 并在需要时进行储存。加入100μl 的4% 甲醛 (pfa)。保持在黑暗中, 并立即继续执行步骤4。

4. 具有高含量、高分辨率免疫荧光共聚焦显微镜的 net 可视化

1. 通过单击采集设置, 在免疫荧光共聚焦显微镜上配置设置。
   1. 单击 "配置" 选项卡。
   2. 选择目标和相机。选择 10倍 apo lambda 目标, 采用共聚焦60微米针孔的采集模式。
   3. 点击板,选择96孔塑料板。选择要访问的网站, 并选择固定数量的网站。填写3列和3行, 不重叠 (0 微米), 总共覆盖45% 的井。
   4. 点击收购。选择 "启用基于激光的对焦"。如果需要, 选择"获取 z 系列时间序列" 。
   5. 点击网站自动对焦。
      1. 点击板底的焦点按底部厚度偏移设置。对于初始井找到样品, 选择第一个获得的井。对于站点自动对焦, 请选择所有站点。
   6. 点击波长。
      1. 对于波长的数量, 请选择2。对于 tl 底纹校正优化级别, 请选择2。
      2. 对于波长 1, 选择 "德州红"。
         1. 对于自动对焦选项, 选择 z 偏移激光, 后激光偏移 1.1μm. 使用自定义范围为200-10 的 z 堆栈。
      3. 对于波长 2, 选择 "fitc"。
         1. 对于自动对焦选项, 选择具有 w1 0μm z 偏移量的激光. 使用自定义范围为200-10 的 z 堆栈。
         2. 对于采集选项, 请选择 z 系列和二维投影图像最大值。对于采集选项, 选择 "底纹校正"关了, 关了, 关了
   7. 选择z 系列。选择步骤数:10。选择步长: 3 毫米 (总范围为 27μm)。
2. 将板置于免疫荧光共聚焦显微镜中。
   1. 单击 "运行" 选项卡。
      1. 填写车牌名称和描述, 并选择存储位置。
      2. 选择需要获取的井。
3. 选择德州红和 fitc 的曝光时间。
4. 点击获取板开始收购, 这将需要大约1小时的每个板块。

5. net 形成分析

1. 使用为分析科学多维图像而设计的图像处理程序 (参见材料表) 来分析 net 的形成。
2. 将采集的图像数据传输到单独的硬盘驱动器。
3. 选择颜色添加工具。
   1. 选择 w1 并选择硬盘驱动器中存储数据的文件夹。
   2. 选择 w2 并选择硬盘驱动器中存储数据的文件夹。
      请注意:使用在文件名中使用 w1 的标准宏为德州红色图像添加红色, 并使用 w1 为 fitc 图像添加绿色。
4. 选择 "分析宏"。
   1. 选择w1, 选择阈值 (强度阈值), 通常为10。选择所需的像素值 (大小阈值, 例如, 100)。
   2. 选择w2, 选择阈值 (强度阈值), 通常为10。选择所需的像素值 (大小阈值, 例如, 500)。
   3. 选择电子表格文件的目标, 运行分析, 然后保存日志文件。
5. 分析电子表格中的数据。

结果

中性粒细胞细胞外陷阱 (net) 的形成是量化的三维方式, 通过量化染色细胞外 dna 超过 10个 z 堆栈与3μm 的距离开始在每口井的焦点平面。通过测量累积面积, 该检测的灵敏度提高 (图 1a)。分离的中性粒细胞的平均纯度为 98.7%, 标准偏差 (sd) 为 1.10, 在14个不同的样品中进行测量。红细胞的平均百分比为 1.04%±1.1% sd, 单核细胞的平均百分比为0.085 ±0.17% sd (数据未显示)。成像的染色中性粒细胞的总面积仅在每口井的焦平面上进行量化, 这与每口井的中性粒细胞总数有显著的相关性, 皮尔逊相关系数为 0.99 (95% 置信区间 [ci] 0.985-0.997,p < 0.0001) (图 1b)。中性粒细胞中 net 形成的定量的代表性结果是由10% 的 aav 患者血清或培养基 (med) 刺激的负对照, 表现为每辆年龄的中性粒细胞 10个 z-堆栈的累积染色细胞外 dna 面积 (图1c). 显示了 aava 受激中性粒细胞 (图 2a) 和 nt (图 2A) 中代表性图像的快照。

图 1: 通过测量细胞外 dna 和中性粒细胞计数对 net 形成进行定量.(a) 面积在 10个 z 堆栈上累计量化, 用于未受刺激的中性粒细胞 (med) 和无刺激中性粒细胞, 并通过10% 的 anca 相关血管炎 (aav) 患者血清 (n = 4) 通过图像处理程序进行量化。每个刺激量测试一式三份, 每个点代表中值。(b) 通过图像处理程序 (r 2 = 0.99, p^< 0.0001) 在每口井的焦平面上量化红色荧光标记细胞面积和细胞计数。(c) net 的形成表示为每个成像中性粒细胞 (细胞区) 的累积面积。每三次的均值 (sem) 的均值±标准误差按每次刺激绘制。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: net 定量分析的快照.荧光标记的中性粒细胞显示为红色, 染色的细胞外 dna 显示为绿色。10倍计划 apo ambda 目标。(a) 无受刺激的中性粒细胞。(b) 中性粒细胞受 aav 血清刺激。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

这种检测最关键的部分是需要在每个实验中使用新分离的中性粒细胞, 因为中性粒细胞是短暂的, 冷冻时死亡。这每次都需要一个健康的捐献者, 这可能会由于捐献者的特点而带来一些变化。其中一个变化是中性粒细胞的激活状态。在分离之前, 中性粒细胞可以在体内已经被激活。此外, 中性粒细胞可以在整个隔离步骤中被激活, 特别是在红细胞裂解过程中, 因此需要一个有经验的中性粒细胞处理程序, 以尽量减少中性粒细胞的激活。一般情况下, 抽血后应尽快进行中性粒细胞的隔离, 实验不应暂停, 以避免过度自发激活。其次, 应避免对中性粒细胞进行粗暴处理。因此, 所述协议的显著优势是, 在96孔板中播种中性粒细胞后, 最小的移液干预。重要的是, 中性粒细胞的活化状态最好评估在无刺激的条件下, 在这种情况下, 这种检测可以敏感地检测到低水平的 net 形成。另一个可能影响检测的因素是在培养基中使用 fcs。fcs 的百分比已从10% 下降到 2%, 以避免可能抑制 net 形成的抗氧化活性^19,20或可能激活中性粒细胞, 尽管热失活。没有 fcs 或使用不同类型的媒体的文化尚未尝试过。在进行检测时, 总是会采用无刺激或介质控制, 以显示背景信号 (例如, 中性粒细胞的激活状态)。与未受刺激的样品相比, 每个刺激的折叠增加, 以在使用相同刺激的不同实验中获得一致的结果。

一个重要的因素, 可能高背景是染色细胞外 dna, 这是无关的过程中的 net 形成。本试验试图通过在15分钟的短潜伏期后立即去除细胞外 dna 染色, 并在固定后直接分析钢板来减少这种情况。因此, 必须使用先进的共聚焦显微镜, 具有足够的速度和分析能力, 在1至2小时内捕获96孔板, 建议自动设置曝光时间和焦点。因此, 显微镜设置可以在每个样本之间变化, 实验的颜色强度阈值是整体最佳图像质量所必需的。后者影响到正确量化中性粒细胞和英语的最终能力, 因此应使用多个控制样本 (例如健康对照血清) 来确认最佳设置。在分析捕获的图像时, 在分析程序中使用像素阈值和大小阈值可以更好地选择 net 形成。

从 net 形成中提取的细胞外 dna 可能是不同死亡途径的结果, 包括 netosis、坏死性、热释症、铁虫病, 甚至是重要的 net 形成1的非裂解过程^.因此, 目前的检测的一个局限性是, 只通过染色的细胞外 dna 没有区分 net 的形成和其他相关的细胞死亡途径。有可能通过使用不同死亡途径的选择性抑制剂来区分支持 net 形成的不同形式, 或通过单独的免疫标记来确认特定的 net 标记的存在, 如 cith3 和 ne,与 dna 共同定位。该检测¹⁰证实了细胞外 dna 与 cith3 和 ne 的联合定位。在这种检测中避免 net 特定标记的优点, 可以评估所有形式的 net 形成, 导致中性粒细胞挤出 dna 尽可能完整和客观的高通量筛选的潜力。该方案在研究免疫复合物介导的免疫综合体在自身免疫性疾病中的低水平诱导中的适用性已得到证明, 在这种情况下, 检测定性和定量差异的能力可能比过程类型更重要涉及^10,21,22。说明这种新的 net 定量检测方法对不同的研究人员研究 net 形成的各个方面具有重要价值。小调整的分析很容易实施: 调整刺激期, 使用最喜欢的 net 标记, 重点放在一个特定的死亡路径, 导致 net 形成, 使用不同的放大倍率或使用不同的 net 标准量化和分析。

总之, 所提供的协议是一种高度敏感、广泛适用的 net 形成半自动定量方法, 用于评估不同刺激下的 net体外诱导.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqua Sterile H2O	B. Braun, Melsungen, Germany	12604052
Fetal bovine serum (FCS)	Bodinco, Alkmaar, The Netherlands		Used in high concentrations it could influcence NET formation
Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% density 1.077 g/mL	LUMC, Leiden, The Netherlands	97902861
Immunofluorescence confocal microscope	Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
Neutralization PBS (10x)	Gibco, Paisley, UK	70011-036
Penicillin/streptomycin (p/s)	Gibco, Paisley, UK	15070063
Phenol red free RPMI 1640 (1x)	Gibco, Paisley, UK	11835-063	Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal
Phosphate-buffered saline (PBS)	B. Braun, Melsungen, Germany	174628062
PKH26 2 μM Red fluorescent cell linker	Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA	PKH26GL-1KT	PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan
Program for scientific multidimensional images analysis	ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
RPMI medium 1640 (1x)	Gibco, Paisley, UK	52400-025
Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye	Gibco, Paisley, UK	57020
Trypan blue stain 0.4%	Sigma Aldrich, Germany	17942E
96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate	Falcon, NY, USA	353219