从茶中提取的新建细胞悬浮培养基中六种系统杀虫剂的代谢研究(山茶西宁西斯L.叶

摘要

这项工作提出了建立从茶(山茶)叶衍生的细胞悬浮培养物的协议,可用于研究整个植物可以采用的外部化合物的代谢,如杀虫剂。

摘要

利用茶植物体外组织研究杀虫剂代谢的平台。从无菌茶树叶诱导形成松散的卡苏在Murashige和Skoog(MS)基底培养基与植物激素2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D,1.0毫克L-1)和基尼汀(KT,0.1毫克L-1)。在3或4轮次培养后形成,每轮持续28天。然后,将松弛的卡鲁斯(约3克)接种到含有相同植物激素的B5液体介质中,并在25~1°C的黑暗中,在摇动的培养箱(120 rpm)中培养。在3⁄4亚培养后,以1:1和1:2(悬浮母液:新鲜介质)的亚培养比建立从茶叶中提取的细胞悬浮液。利用该平台,在茶叶衍生细胞悬浮培养中加入六种杀虫剂(每片甲氨酰胺、伊米达洛狄德、乙酰胺、伊米达布蒂、二甲苯酸盐和奥米霍特)。利用液相色谱和气相色谱跟踪杀虫剂的代谢。为了验证茶细胞悬浮物培养物的效用,使用质谱法比较了处理过的细胞培养和完整植物中存在的三甲氧西和二甲苯甲酸酯的代谢物。在治疗茶细胞培养中,发现七种三甲氧烷代谢物和两种二甲苯醚代谢物,而在治疗完好的植物中,只发现两种三甲氧烷代谢物和一种二甲苯甲酸酯。与使用完整的茶树相比,使用细胞悬浮液简化了代谢分析,尤其是对于茶等困难的基质。

引言

茶是世界上消费最广泛的非酒精饮料之^一。茶是由木本多年生山茶的叶子和芽,茶植物生长在广阔的种植园,易受大量害虫3,4。有机磷和尼古丁类杀虫剂常被用作系统性杀虫剂5,以保护茶树免受害虫,如白蝇,叶漏斗,和一些白鳍豚物种6,7。施用后,这些杀虫剂被吸收或转移到植物中。在植物内部,这些系统杀虫剂可以通过水解、氧化或植物酶的还原反应转化。这些转化产物可能比母化合物更极性,毒性更低。然而,对于一些有机磷酸盐,一些产品的生物活性较高。例如,乙酰胺被代谢成毒性更大的甲胺磷8,9,和二甲苯酸盐成欧美磷10,11。因此,植物代谢研究对于确定植物中农药的命运非常重要。

植物组织培养物已被证明是研究农药代谢的有用平台,其识别代谢物与在完整植物13、14、15中发现的代谢物相似。使用组织培养物,特别是细胞悬浮培养物,有几个优点。首先,可以进行无微生物的实验,从而避免微生物对农药转化或降解的干扰。其次,组织培养提供一致的材料,随时使用。第三,代谢物比从完整植物中提取更容易,组织培养物通常具有较少的相互作用化合物和较低的化合物复杂性。最后,组织培养可以更容易地用于比较一系列农药代谢在一个单一的实验16。

在这项研究中,成功地建立了从无菌生长的茶树叶中提取的细胞悬浮液。然后用茶细胞悬浮培养法比较六种系统杀虫剂的耗散行为。

这个详细的协议旨在提供一些指导,以便研究人员可以建立一个植物组织培养平台,有用的研究异种生物在茶中的代谢命运。

研究方案

1. 茶文化

注:无菌叶来自在研究^组17中首次开发的体外生长的植物系。除孵化器中的培养时间外,所有程序均在第5节进行无菌层流罩。

1. 在高压灭菌之前,将两种介质的pH值(Murashige和Skoog [MS] 基底介质和甘博格的B5液体介质)调整到5.8。C,20分钟。
2. 用剪刀沿着无菌叶的中间静脉切开,然后将每半部分细分为约 0.3 厘米 x 0.3 厘米的培养皿中的小块。
3. 将无菌外植(小叶片)放入含有植物激素 2,4-D (1.0 mg L^-1)和 KT (0.1 mg^L-1) 的 MS 基础培养基。六种外植可放置在含有100 mL MS基底介质的300 mL烧瓶中。
4. 在黑暗中,在25°C的恒温下培养上述叶外植物。28天后,选择第一代诱导的烧瓶,并转移到新鲜的烧瓶(亚文化)。在3⁄4亚培养后获得松散和易碎的调用。

2. 茶细胞悬浮培养

1. 在无菌条件下,使用无菌手术刀片将坚固介质中的有力、易碎和松弛的切口切成小块(范围为 0.5⁄2 mm)。
2. 称重约3克的小卡鲁斯。将 callus 放入含有 20 mL B5 液体介质的 150 mL 烧瓶中,辅以 2,4-D (1.0 mg L^-1)和 KT (0.1 毫克 L^-1)。
3. 在黑暗中,在120rpm的摇动培养箱中,在恒温(25 ± 1 °C)下培养液体细胞悬浮液。
4. 经过7至10天的栽培后,取出培养瓶,让它们站立几分钟。
5. 以所有上清液作为种子材料进行亚培养至新鲜介质(悬浮母液与新鲜介质的亚培养比在1:1至1:2之间)。取出沉淀的大呼叫。
6. 获得最终良好生长的细胞悬浮培养后,3⁄4亚培养周期28天。

3. 三聚苯乙烯氯化物细胞活力测定

1. 在100°C下杀死活细胞样本10分钟,作为对照细胞,然后再进行存活染色。
2. 在6000 x g下将所有细胞悬浮培养基离心8分钟。在将2.5 mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.3)中细胞悬浮之前,取出上清液,并用手摇动1分钟。
3. 加入2.5 mL的0.4%三氯四氯苯(TTC)溶液,然后再次用手摇动。
4. 在常设培养箱(30°C)中孵育混合物1小时。

4. 用杀虫剂处理和取样茶细胞悬浮物培养物

1. 在细胞悬浮培养物中加入400 μL的过滤灭菌液溶液(500μgmL-1),包括四种尼古丁类化合物(二甲酰胺、乙酰氨基、依米达洛韦和伊米达克洛兹)或两种有机磷酸盐(二甲酸酯和omethoate),分别。
   注:如果目的是比较异种生物行为,使用同一母体细胞悬浮液测试不同的化合物。
2. 在恒温(25 ± 1 °C)和摇动培养箱速度(120 rpm)下用杀虫剂培养细胞悬浮液样品。在 0、3、5 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 和 75 天内采集样本(参见步骤 4.3 或 4.4)。
3. 要测试含有尼古丁类的样品,请去除同质细胞培养物的1 mL等分,将其放入1.5 mL塑料离心管中,并在4000 x g下离心2分钟。
   1. 在通过高性能液相色谱-紫外线 (HPLC-UV) 和超高性能液相色谱四极极极飞行时间 (UPLC-QTOF) 质量 (UPLC-QTOF) 质量进行分析之前,将超生物通过 0.22 μm 孔径滤膜光谱学 (材料表).
4. 要测试含有有机磷的样品,请去除细胞培养物的500μL等分,并放入35 mL离心管或1.5 mL塑料离心管中(制备后一种样品,如尼古丁类样品)。
   1. 在 500 μL 样品的 35 mL 离心管中加入 0.1 克氯化钠和 5 mL 丙酮/乙酸乙酯 (3:7,v/v)。
   2. 将混合物涡旋1分钟,然后让它们休息10分钟。
   3. 将上清液的2.5 mL放入10 mL玻璃管中,在40°C下使用氮蒸发器蒸发至接近干燥。
   4. 用1 mL丙酮溶解残留物,涡流1分钟,通过0.22μm滤膜,然后由气相色谱-火焰光度检测器(GC-FPD)进行分析。

5. 用杀虫剂制备完整茶树的样品

注:完整的茶树试验是在水培系统中使用在50 mL中生长的营养溶液(30 NH₄+,10 NO₃-,3.1 PO₄- 、 40 K^+、20 Ca^2+、25 Mg²⁺、 0.35 Fe^2+,0.1 B) 的茶苗进行的³⁺, 1.0 Mn^2+,0.1 Zn²⁺, 0.025 Cu^2+,0.05 Mo^+,和 10 Al^3+,在毫克 L^-1)¹⁸.安徽农业大学一个实验温室处于20°C的浅暗循环(12小时光和12小时黑暗)。

1. 将五株植物放入4升塑料锅中15天。
2. 分别在塑料罐中加入0 ppm(控制)或100ppm的三甲氧西甲酸酯或二甲苯甲酸酯。
3. 根据前一种方法制备完整的植物样品,除预^浸泡19外,然后用质谱分析,获得精确的质量光谱。

6. 仪器分析

1. 新生儿碱代谢行为的HPLC分析
   1. 使用HPLC-UV(材料表)检测第4.3节样品中波长为254nm的三甲氧西胺和乙酰胺的含量和代谢产物,以及270nm的imidacloprid和imidaclothiz的含量和代谢产物。
      注:HPLC-UV条件与前一^研究19相同。
2. 有机磷酸盐代谢行为的GC分析
   1. 使用手性柱(材料表)检测GC-FPD第4.4节样品中二甲霍伊酸酯和二甲苯甲酸酯的含量。
   2. 使用氮气作为载运气,并将流量设置为1.0 mL^最小-1。
   3. 将初始温度设置为 120°C,并按住 5 分钟,在 30°C 最小^-1时将温度升高至 150°C,在 10°C 最小^-1时保持 3 分钟,在 10°C -1 时增加到 170°C,保持 7 分钟。最后在30°C-1时增加到210°C,然后保持5分钟。
   4. 在无分体模式下将喷射温度设置为 200 °C;将探测器温度设置为 250°C。
   5. 将喷射音量设置为 1 μL。
3. 细胞培养中杀虫剂代谢物的UPLC-QTOF分析
   1. 使用带有C18列(材料表)的UPLC-QTOF检测细胞培养中的杀虫剂的代谢物(来自第4.3节的样本)。
   2. 将流速设置为 0.2 mL 最小^-1。将喷射音量设置为 10 μL。
   3. 对于经尼古丁类处理的样品,将初始移动相设置为 85% A(5 mM 铵甲酸水)和 15% B(乙酰乙酯)。超过 10 分钟,将移动阶段 B 增加到 38%,并在 1 分钟内返回 15%,保持 9 分钟。
   4. 对于有机磷处理的样品,将初始移动相设置为 55% A(0.1% 用于酸水)和 45% B(乙酰乙酯)。超过 5 分钟,将移动阶段 B 增加到 70%,然后在 0.5 分钟内返回到 B 的 45%,保持 2.5 分钟。
   5. 将QTOF操作参数设置如下:气体温度,325°C;干燥气体(氮气),10 L^最小-1;护套气体温度,350°C;护套气流,11 L 最小^-1;毛细管电压,4000 V;喷嘴电压,1000 V;碎片电压,100 V用于新烟碱杀虫剂,110 V用于有机磷杀虫剂;滑马器电压,65 V;在正子模式下工作。
   6. 将仪器设置为全扫描频谱和目标 MS/MS 模式。
   7. 使用准确的批量工具处理数据;推断没有标准产物的代谢物从MS/MS注释以及文献12,15,20,21,22 。
4. 完整植物提取物中杀虫剂代谢物的UPLC-Orbitrap分析
   1. 使用UPLC-Orbitrap质谱法(材料表)检测完整植物提取物中杀虫剂的代谢物。
   2. 将质谱(材料表)操作参数设置如下:护套气体压力,35 arb;气体温度,300°C;喷嘴电压,3.5千伏;毛细管温度,350 °C。
   3. 将洗脱程序设置为上述(步骤 6.3.3 和 6.3.4),以便对细胞培养进行 UPLC-QTOF 分析。

结果

在MS介质上种植28天后,通过测量污染、褐化和诱导,从田间种植的茶树和从在无菌环境中在体外生长的茶树中切去的叶子中,对叶的诱导进行了比较。图 1A.在20、37、62和90天的文化上,卡鲁斯的增长被记录下来(图1B)。在整整90天的栽培过程中,从体外生长的叶子中提取的卡鲁斯比从田间生长的叶子中提取的卡鲁斯更活跃。无菌叶子的?...

讨论

本文介绍了在茶植物组织中建立农药代谢模型的详细过程,包括植物外植物的选择、细胞活力的测定、茶细胞悬浮培养的建立等。活动。植物组织的任何部分都可以用来在消毒环境中启动callus25。在这项研究中,茶叶被选择用于开叶,不仅因为叶子比地下部分受到的污染要小,还因为它们是作物的可食用部分和杀虫剂应用的主要目标。

在这项研究中,比较了从田间?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetamiprid (99.8%)	Dr. Ehrenstorfer	46717	CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%)	Tedia	AS1122-801	CAS No: 75-05-8
Agar	Solarbio Science & Technology	A8190	CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%)	Dr. Ehrenstorfer	525	CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%)	Dr. Ehrenstorfer	109217	CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%)	Dr. Ehrenstorfer	91029	CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%)	Toronto Research Chemical	I275000	CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%)	Solarbio Science & Technology	K8010	CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%)	Dr. Ehrenstorfer	105491	CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)	Solarbio Science & Technology	P8070	CAS No: 25249-54-1
Sucrose	Tocris Bioscience	5511	CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%)	Dr. Ehrenstorfer	20625	CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%)	Solarbio Science & Technology	T8170	CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%)	Guangzhou Saiguo Biotech	D8100	CAS No: 94-75-7
chiral column	Agilent CYCLOSIL-B	112-6632	Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC)	Shimadu	2010-Plus	Paired with Flame Photometric Detector (FPD)
High-performance liquid chromatography (HPLC)	Agilent	1260	Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 column	Waters	186003539	Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)	Agilent	1290-6545	Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)	Thermo Scientific	Ultimate 3000-Q Exactive Focus	Connected to a Orbitrap mass spectrometer