利用 PiggyBac 载体将人诱导的多能干细胞 (Ipsc) 转化为功能性脊柱和颅内运动神经元

摘要

该协议允许诱导多能干细胞快速有效地转换为具有脊柱或颅内身份的运动神经元, 通过从诱导的 piggyBac 载体的转录因子的异位表达。

摘要

我们这里描述了一种方法来获得功能性脊椎和颅内运动神经元从人类诱导的多能干细胞 (Ipsc)。直接转化为运动神经元是通过转录因子的替代模块, 即 Ngn2、Isl1 和 Lhx3 (NIL) 或 Ngn2、Isl1 和 Phox2a (NIP) 的异位表达而获得的。NIL 和 NIP 分别指定脊柱和颅内运动神经元的身份。我们的协议从生成修改后的 iPSC 线开始, 在这些线路中, NIL 或 NIP 通过 piggyBac 转座子载体稳定地集成到基因组中。然后由多西环素诱导转基因基因的表达, 并在5天内导致 Ipsc 转化为 MN 祖细胞。随后的成熟, 7天, 导致脊柱或颅内 Mna 的同质种群。与以前的协议相比, 我们的方法有几个优点: 它非常快速和简化;它不需要病毒感染或进一步 MN 分离;它允许产生不同的 MN 亚群 (脊椎和颅骨) 与显著的成熟程度, 这证明了火训练的动作电位。此外, 大量的运动神经元可以获得没有纯化从混合人群。ipsc 衍生的脊髓和颅内运动神经元可用于肌萎缩侧索硬化症和运动神经神经元的其他神经退行性疾病的体外建模。均匀运动神经元群可能是细胞类型特异性药物筛选的重要资源。

引言

运动神经元 (MN) 变性在肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和脊髓肌萎缩 (SMA) 等人类疾病中起着致病作用。建立合适的体外细胞模型系统, 总结人类 MN 的复杂性, 是朝着发展新的治疗方法迈出的重要一步。诱导多能干细胞 (ipsc) 具有显著的多系分化特性, 目前已从一些受运动神经元疾病 1^,2 的患者中提取。从控制 "健康" 多能干细胞3开始, 基因编辑产生了更多携带与 MN 疾病相关的致病突变的 iPSC 系^.这些生产线是体外疾病建模和药物筛选的有用工具, 前提是有适当的 iPSC 分为 Mn 的方法。这种方法发展的基本原理是为对 MN 疾病感兴趣的科学界提供快速有效的分化协议, 从而产生成熟的功能 Mn。此方法的第一个优点是其执行时间范围。另一个相关的强项来自于任何净化步骤的消除。最后, 该协议可用于生成两个不同的运动神经元群。

生成不同子类型的 mn 的可能性与 MN 疾病的建模特别相关。并非所有的 MN 亚型在 ALS 和 SMA 中都同样脆弱, 不同运动单位的症状出现对预后有很大影响。在 ALS 中, 脊柱出现症状开始于上肢和下肢, 导致死亡约 3-5年 4.相反, 球囊发作, 从颅骨 MNs 的退化开始, 有一个最坏的预后。此外, rna 结合蛋白 FUS 和 TDP-43 突变患者的球状发病百分比明显高于 SOD1 突变⁵患者。几乎所有的替代 mn 分化协议依赖于维甲酸 (ra) 的活性, 这赋予了脊椎字符分化 ipsc^6,7,8。这限制了研究内在因素的可能性, 而内在因素可能对^特定的 mn 亚型^{9、10 具有}保护作用。

与以前在小鼠胚胎干细胞¹¹中的研究一致, 我们最近已经表明, 在人类 Ipsc 中, Ngn2、isl1 和 Lhx3 (nil) 的异位表达诱导了脊柱 mn 的身份, 而 Ngn2 和 isl1 加 phox2a (nip) 则指定了颅内 mn12。因此, 我们开发了一个高效的协议, 导致在12天的周转时间内生产具有功能特性的人类 MNs。这种方法的目的是在很短的时间内, 在不需要纯化的情况下 (例如, 通过流式细胞仪), 获得具有脊柱或颅内身份的 MNs 高度丰富的细胞群。

研究方案

1. 人类 Ipsc 的维护

1. 基质涂层板的制备
   1. 在4°C 下连夜解冻一个5毫升的基质 (见材料表)。原始的基质库存在不同的库存浓度下, 并根据数据表上显示的稀释系数进行。重要的是要保持小瓶和管冰凉, 以防止过早的胶凝矩阵。在冰上预先冷却的低温管中, 将基质分配到等价物中。在-20°c 时冻结未使用的脂肪。
   2. 将一个放在冰上大约2小时才能解冻。
   3. 用20毫升的冷 dmmmm·f12 将基体的脂肪体稀释在一个50毫升的锥形管中。
   4. 混合好, 将稀释后的基质1毫升放入35毫米盘子 (其他菜品表面面积相当的量)。
   5. 将含有稀释基质的盘子在室温下保存 1小时, 以便涂布。
      请注意:用副封闭密封的菜肴可在4°c 下存放长达2周。
2. 温和细胞离解试剂的库存溶液 (20 毫升) 和1x 工作量的制备(请参见材料表)。
   1. 在 PBS (Ca^{2 +}mgg^{2 +}游离) 中溶解粉末至 10 mgml。
   2. 滤清器通过0.22μm 滤膜进行灭菌。
   3. 准备20个等价物 (每种1毫升), 并储存在-20°c。
   4. 使用前, 在 PBS (Ca^{2 +}mg^{2 +}免费) 中稀释一个 aliquot 至 1 mg/ml (1x 工作的 aliquot)。
      注: 1x 工作的等价物可在4°c 下存放长达2周。
3. 通过人的 Ipsc。
   1. 开始前: 如果在4°c 下储存, 在37°c 的孵化器中预热基质涂层板 20-30, 在室温下预热所需的人体 iPSC 介质 (见材料表)。预热 DMMM/F12。
   2. 吸种培养基。
   3. 用 PBS 冲洗 Ipsc (Ca^{2 +}/mg^{2 +}免费)。
   4. 加入1x 温和离解溶液 (35 毫米盘子 0.5 mL)。在37°c 时孵化, 直到菌落边缘开始从板上分离, 通常为3-5分钟。
   5. 渴望温和的离解解决方案, 注意不要分离 iPSC 菌落。
   6. 用 DMEMM/F12 (35 毫米盘子为2毫升) 清洗细胞, 并小心不分离细胞。重复此步骤一次。
   7. 加入人工 iPSC 介质 (35 毫米盘子为1毫升)。
   8. 用细胞提升器轻轻分离菌落, 转移到15毫升管中。
   9. 用 P1000 移液器向上和向下移液3-4 次, 轻轻打破细胞团块。
   10. 从基质涂层板中吸收上清液。
   11. 将细胞播种在人体 iPSC 培养基的适当培养量中。分割率可以因线而异, 大约为 1:4-1: 8。每天更换介质。

2. NIL 和 NIP 工业 iPSC 线路的生成

1. 细胞转染。
   1. 用 PBS 冲洗细胞 (Ca^{2 +}mg^{2 +}免费)。
   2. 加入细胞离解试剂 (见材料表)(35 毫米盘0.35 毫升), 在37°c 孵育, 直到单个细胞分离 (5-10)。
   3. 使用 P1000 移液器向上和向下移液3-4 次, 轻轻完成细胞分离。
   4. 收集在一个15毫升管, 并添加 PBS (Ca^{2 +}/mL^{2 +}免费) 到10毫升。数一数单元格。
   5. 颗粒 10^{6 个}细胞, 并在100Μl 的缓冲区 r 中重新悬浮 (包括在细胞电穿孔试剂盒中, 请参见材料表)。
   6. 为转染添加质粒 DNA: 4.5 微克的转座子载体 (epB-Bsd-TT-NIL 或 EpB-Bsd-TT-NIL¹²) 和0.5 微克的 piggybac 转座子质^粒13。
   7. 根据制造商的说明和前面描述的3进行电池电穿孔系统的转染 (见材料表), 其参数如下: 1, 200 v 电压、30毫秒宽、1个脉冲。在一个6毫米的基质涂层盘中播种人的 ipsc 介质中的细胞, 并辅以 10μm y-27道理 (rock 抑制剂, 见材料表)。
2. 用抗生素进行选择。
   1. 转染两天后, 在培养基中加入5μgml。
   2. 大多数未转染的细胞将在选择杀菌素48小时内死亡。将细胞保持在闪电分裂中至少 7-10, 以反选择尚未整合基因组中转基因的细胞。
   3. 将稳定转染的细胞作为混合群体, 由具有不同转基因数量和不同整合位点的细胞组成, 或分离单个克隆。
   4. 用 RT-PCR 与 ngn2 的转基因特异性引物 (前进: tatgccccccccccccccccccccaccaccactag) 制备一个额外的盘子, 以检查转质的有效表达, 在诱导后;相反: GAGGGGGGGCTCACT), 如上文所述^.
   5. 在这一阶段, 将新型 NIL-IP-IP-IPSC 生产线的库存冻结在人类 Ipsc 的冷冻介质中 (见材料表)。

3. 电机神经元分化

1. 如所述 (步骤 2.1.1 2.1.3), 将细胞与细胞离解试剂分离。收集离解细胞在一个15毫升管和稀释与5卷 DMM/F12。将细胞颗粒状, 并在人的 iPSC 介质中重新悬浮, 辅以 10μm ROCK 抑制剂。以62,500 细胞的密度计算细胞和种子在基质涂层的菜肴上.
2. 第二天, 用 dmm函数 f12 取代培养基, 辅以1x 稳定的 l-谷氨酰胺类似物、1x 非必需氨基酸 (NEAA) 细胞培养补充剂和0.5倍青霉素-链霉素, 并含有1μgml 多西环素。这被考虑作为区别的第0天。在第1天, 刷新培养基和多西环素。
3. 第2天, 将培养基改为神经碱/b27 培养基 (神经基底培养基, 补充 1x B27, 1x 稳定的 l-谷氨酰胺类似物、1x NEAA 和 0.5倍 penicillin/streptomycin), 含有 5μm DAPT、4μm 0.5X 和 1μgml dox十胺 (见材料表).每天刷新培养基和多西环素, 直到第5天。
4. 第5天: 细胞离解试剂与细胞离解(请参见材料表)。
   1. 用 PBS 冲洗细胞 (Ca^{2 +}mg^{2 +}免费)。
   2. 加入细胞离解试剂 (35 毫米盘0.35 毫升), 在37°c 孵育, 直到整个细胞单层与盘分离。请注意, 单个细胞在孵育过程中不会被分离。
   3. 加入1毫升的 dmemmsf12, 并将细胞收集在一个15毫升的管中。
   4. 使用 P1000 移液器进行10-15 次移液, 向上和向下移液, 轻轻完成细胞分离。
   5. 加入4毫升的 dmmmsf12, 并对细胞进行计数。
   6. 在此阶段, 根据制造商的说明, 将运动神经元祖细胞冻结在细胞冷冻介质中 (见材料表)。
   7. 将细胞颗粒并重新悬浮在神经中 (Neurobasal/B27 培养基, 辅以 20 ng/mL bdnf, 10 ng/mL GDNF 和 200 ngml l-抗坏血酸, 见材料表) 补充 10μm rock 抑制剂。
   8. 在 100, 000 细胞的密度下, 在多鸟-层压膜上或在基质涂层支撑上播种细胞.使用Μ-滑动塑料支架与聚合物盖板 (见材料表) 进行免疫染色分析。
5. 第6天, 用不含 ROCK 抑制剂的新鲜神经元培养基改变培养基。在接下来的几天里, 每3天刷新一次一半的培养基。培养介质必须非常小心地改变, 以防止从表面脱落。

4. 免疫染色分析

1. 细胞固定。用 PBS 冲洗细胞 (用 Ca^{2 +}mg^{2 +}), 在室温下在 pbs 中培养4% 的甲醛 15分钟 (用 ca^{2 +}/mg^{2 +})。
   注意事项:对苯二甲醛有毒, 怀疑会致癌。避免接触皮肤和眼睛, 并处理下的化学烟雾罩。
2. 在室温下使用 PBS (ca^{2 +}mg^{2 +}), 含有 0.1% triton x-100 5分钟。
3. 在室温下在抗体阻断溶液中培养 30分钟 (ABS: 3% BSA 在 PBS 中加 CA^{2 +}/mg^{2 +})。
4. 在室温下与 abs 的原生抗体培养 1小时: 抗 TUJ1 (1xy1000; 兔子) 和抗八角 4 (1x:200; 鼠标) 或抗 chat (抗胆碱乙酰基转移酶; 1: 150; 山羊)。请参阅材料表。
5. 在室温下用适当的驴二级抗体对在 abs 中培养 45分钟: 抗鼠亚历克莎 Flor 647 (1:250)、抗兔子亚历克莎福陆 594 (1:250) 和抗山羊亚历克莎福陆 488 (1:250)。请参阅材料表。
6. 在室温下在 0.4Μgml DAPI 中培养 5分钟, 以标记细胞核。
7. 用安装介质 (见材料表) 安装电池, 以便在荧光显微镜下进行成像。

5. 通过补丁夹具记录的功能表征

1. 准备 Hepes-平衡的外部溶液 (NES) 如下: 140 mM ncl、2.8 mM kcl、2 mM ccl 2、2 mm MGCL 2、10 Mm hepes 和 10 mm 葡萄糖_.将渗透度设置在 290-300 mΩ之间。使用 1N NaOH 将 pH 值调整为 7.3, 并将溶液存放在4°c。
2. 准备内部溶液: 140 mM K-glucoinate, 2 mM 氯化钠, 5 mm Bapta, 2 mM MgCl 2, 10 mMmm hepes, 2 mm mg-atp, 0.3 mm Na-GTP。使用 1M KOH 将 pH 值调整为 7.3, 并检查渗透度是否设置在 290 mΩ左右。将溶液冻结在-20°c 的小等价物中。
3. 在进行实验之前, 将水浴中的 NES 溶液预热至28-30 左右。
4. 拉一些硼硅酸盐微移液器 (ID 0.86 毫米;OD 1.5 mm) 轴承尖端电阻: 5-6 MΩ, 并在安装到移液器支架之前用细胞内溶液填充。
   请注意:记住用共用的银丝记录电极和参考电极在漂白剂中至少 30分钟, 以便在金属丝表面形成均匀的 AgCl 层。
5. 将培养皿转移到记录室, 并让室与 NES 溶液在 1-2 mL/min。让流经在30°c 温度下设置的内联加热器的流量, 以保持溶液的温度。
6. 将电生理记录室置于直立显微镜下。使用膜片钳放大器记录膜电流, 并使用适当的软件获取数据。
7. 打开放大器控制软件, 将信号增益设置为值 1, 将贝塞尔滤波器设置为10千赫。确保贝塞尔滤波器比采样频率低2.5倍。
8. 在记录软件中设置电压夹和电流夹实验的实验协议。
9. 在协议设置中, 勾选插曲式刺激模式, 并将采样频率设置为25千赫。然后, 移动到波形选项卡, 并键入电压或电流步长振幅和长度, 如下所示。
10. 对于电压门控钠电流, 使用15个电压步骤 (每个50毫秒的持续时间)-100 mV 到 + 40 mV (10 mV 增量)。在通过放大器向补丁细胞施加-60 mV 的保持电位后, 运行协议。同样, 电压门控钾电流通过电压步长 (每个250毫秒) 从-30 mV 到 + 50 mV (10 mV 增量), 将记录的电池保持在-40 mV。
11. 为了研究 ipsc 衍生的颅骨和脊柱 MV 的燃烧特性, 在-70 mV 的膜电位下, 在电流夹紧模式下, 夹紧细胞的膜电位为-70 mV, 并使用4个增加振幅的电流脉冲 (每个频率) (从 + 20 pA 到 + 80 pA; 20 p a 增量)。
12. 获取每个电池电压激活电流、诱发燃烧活动和三种无源特性, 如全细胞膜电容 (Cm)、细胞膜电阻 (Rm) 和休息膜电位 (RMP)。

结果

图 1显示了微分方法的示意图描述。人体 Ipsc (WT I线 3) 通过 epB-Bsd-TT-NIL 或 EpB-Bsd-TT-NIL 进行转染, 在选择无菌性细胞线¹²后生成稳定和诱导细胞系, 以下分别称为 Ipsc-nil 和 ipsc-nip。对分化细胞的多能性标记 OCT4 和泛神经元标记 TUJ1 的表达进行了表征。免疫染色分析显示, 在没有 TUJ1 阳性的情况下, 在第0天, OCT4 在所有细胞中的表达均匀 (

讨论

由于谱系特异性转录因子的异位表达, 该协议可以有效地将人的 Ipsc 转化为脊柱和颅内运动神经元。这些转基因是由多西环素诱导和稳定地集成在基因组中感谢一个 piggyBac 转座子基载体。在混合人群中, 一个或多个携带 Bac 载体的副本将随机整合到单个细胞的基因组中, 从而增加基因组完整性改变的风险。此外, 随着时间的推移, 可能会逐步选择 iPSC 亚克隆, 可能会对分化以及疾病和控制细胞系的比?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	chemicals for electrophysiological solutions
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Cell dissociation reagent
anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594	Immunological Sciences	IS-20152-1	Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF	PreproTech	450-02	Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin	Sigma-Aldrich	203350	Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software	Molecular Devices	Clampex 10	Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder	Roche	10236276001	4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Gamma secretase inhibitor
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit	Omega bio-tek	R6834-02	Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	chemicals for electrophysiological solutions
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid	LKT Laboratories	A7210	Used in cell culture as an antioxidant
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope	Olympus	iX83 FluoView1200	Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium	Ibidi	50001	Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier	Molecular Devices	700B	Membrane currents recording system
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	chemicals for electrophysiological solutions
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	chemicals for electrophysiological solutions
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8	Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope	Olympus	BX51VI	Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera
Y-27632  (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Support for high–end microscopic analysis of fixed cells