用于量化 iPSC 衍生内皮孕激素的血管生成潜力的体外 3D 模型和计算管道

摘要

来自诱导多能干细胞(iPSC-EP)的内皮祖子有可能彻底改变心血管疾病的治疗,并能够创建更忠实的心血管疾病模型。本文介绍了iPSC-EP在三维(3D)胶原蛋白微环境中的封装,并对这些细胞的血管生成电位进行了定量分析。

摘要

诱导多能干细胞(iPSCs)是一种患者特异性增殖细胞源,可分化成任何体细胞类型。双能内皮祖细胞(EP),可以分化成组装成熟、功能性血管所必需的细胞类型,从胚胎和诱导多能干细胞中提取。然而,这些细胞在三维环境中尚未得到严格评估,其血管生成潜力的定量测量仍然难以实现。在这里,首先概述了通过荧光激活细胞分类生成和分离 iPSC-EP,然后介绍了 iPSC-EP 在胶原蛋白水凝胶中的封装和培养。这种细胞外基质(ECM)模拟微环境鼓励强健的血管反应;血管网络形成后一个星期的文化。使用开源软件量化此血管反应的计算管道的创建进行了划定。此管道专为保留毛细管丛的 3D 体系结构而设计,以以最少的用户输入可靠地识别分支数、分支点和总网络长度。

引言

人类脐带静脉内皮细胞(HUVECs)和其他原发内皮细胞类型已经使用了20年,以模型血管发芽和在体外发育1。这种血管平台有望阐明心血管疾病的分子和组织级机制,并可能为原始血管网络2、3的发展提供生理见解。尽管血管建模领域取得了显著进展,但能够定量建模和评估生理血管发育的"金本位"测定仍然遥遥无期。大多数已公布的协议没有充分重述血管利基,以鼓励成熟、功能性血管的形成,或者没有方法在三维上定量比较评估细胞类型的血管生成电位(3D)。

许多目前的血管模型是有限的,他们的能力,模仿生理血管利基。最常用的体外平台之一是胶状蛋白混合物的管形成测定。简单地说,HUVECs被播种为单细胞,在薄薄的凝胶层上,由从肉瘤细胞外基质(ECM)中采集的蛋白质组成;在一至两天内,HUVECs自组装成原始管4。然而,这个过程发生在双维(2D)和内皮细胞(ECs)用于这个测定不形成封闭的,空心流明,从而限制了这些研究的生理意义。最近,EC和支持细胞(例如,中生干细胞(MSCs)和围细胞)在模拟原生ECM纤维结构的3D微环境中共同培养,如胶原蛋白或纤维蛋白水凝胶5。为了模拟这种微环境下的血管发育,通常采用涂有EC的聚合物珠^子。加入其他细胞分泌的外源生长因子和/或生长因子,这些细胞间质嵌入在水凝胶中,可以诱导ECs,涂覆聚合物珠子,发芽并形成单流明;然后可以计算芽和容器的数量和直径。然而,这些芽是奇异的,不形成一个封闭的,连接的网络,如在生理条件下看到,因此更让人想起肿瘤血管模型。微流体装置也被用来模拟血管利基,并促进在EC载水凝胶7,8的血管的形成。通常,血管生成生长因子梯度应用于循环细胞培养基,以诱导EC迁移和发芽。构成发达容器流明的ECs对通过微流体装置的流体流动引起的剪切应力敏感;因此,这些微流体装置捕获静态模型中不可访问的关键生理参数。但是,这些设备需要昂贵的微制造能力。

最重要的是,所有三种血管模型(2D、3D、微流体)绝大多数使用初级EC以及主要支持细胞类型。原发性细胞不能发展成有效的心血管治疗,因为细胞在植入后会产生免疫反应;此外,HUVEC 和类似的原发性细胞类型不是患者特异性的,并且不会捕获遗传倾向或预先存在的健康状况(如糖尿病)患者发生的血管异常。诱导多能干细胞(iPSCs)在过去十年中已经作为一种患者特异性增殖细胞源出现,可以分化成人体中的所有体细胞9。特别是,已经发布了协议,概述了iPSC衍生的内皮祖子(iPSC-EP)10、11的生成和隔离。iPSC-EP 是双能的,因此可以进一步分化为内皮细胞和平滑肌细胞/细胞,成熟、功能性血管的构建基块。只有一项研究令人信服地详细说明了iPSC-EP在3D微环境中的初级毛细管丛的^发育12;尽管本研究对于了解iPSC-EP总成和天然和合成水凝胶的分化至关重要,但它没有定量地比较所产生血管的网络拓扑。另一项最近的研究使用聚合物珠模型比较了HUVECs和iPSC衍生的EC5的发芽。因此,显然需要进一步阐明调节iPSC-EP血管生成的物理和化学信号机制,并确定这些细胞是否适合缺血治疗和心血管疾病建 模。

在过去十年中,开发了不同的开源计算管道和骨架化算法,以量化和比较血管网络长度和连接性。例如,Charwat等人开发了一种基于Photoshop的管道,从纤维蛋白基^质13、14中脂肪衍生干细胞和生长EC的共同培养中提取出一个过滤的、双光化的血管网络图像。也许最广泛使用的拓扑比较工具是AngioTool,一个由国家癌症^研究所15在线发布的程序;尽管该计划被广泛采用和充分记录保真度,该计划仅限于分析两维的容器状结构和其他程序,包括AngioSys和Wimasis,共享相同的维数^限制16。开发了强大的软件套件,如 Imaris、Lucis 和变形,以分析工程微血管的网络拓扑;但是,对于大多数学术实验室来说,这些套件成本高昂,并且限制了对源代码的访问,这可能会妨碍最终用户根据特定应用程序自定义算法的能力。3D切片机,一个开源磁共振成像/计算机断层扫描包,包含一个血管建模工具包,可以有效地分析3D血管网络的^拓扑17;但是,分析依赖于用户手动放置网络的端点,这在分析大型数据集时可能会变得单调乏味,并且可能受用户潜意识偏见的影响。在本手稿中,详细介绍了一个可量化 3D 血管网络的计算管道。为了克服上述限制,此开源计算管道利用 ImageJ 预处理获取的共聚焦图像,将 3D 卷加载到骨架分析器中。骨架分析仪采用平行中轴变薄算法,最初由Kerschnitzki等人开发,用于分析骨细胞^网络18的长度和连通性;该算法可有效地描述工程微血管的长度和连通性。

总之,该协议概述了在3D微环境中微血管网络的创建,并提供了一个开源和用户偏差自由计算管道,以随时比较iPSC-EP的血管电位。

研究方案

1. 培养介质和涂层解决方案的准备

1. 要制备体外内丁涂层溶液,在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中稀释体外奈丁1:100。
   注意:一旦稀释,不建议存储此解决方案供将来使用。
2. 从制造商处收到无苯酚红、生长因子减少的胶状蛋白混合物(见材料表)后,在4°C的冰上解冻,直到混合物透明且流畅。将混合物放在冰上,放在层流罩中,将混合物75 μL移液器放入1.8 mL微离心管中,并立即在-20°C冷冻。这些等分可以存储长达一年。
   注意:这种胶状蛋白质混合物在室温下保持时变得非常粘稠,并在较高温度下凝固。保持此解决方案冷。
3. 要准备这种混合物进行涂层,在冰上解冻 75 μL 等分,用 6 mL 的冰冷 Dulbeco 的改性鹰介质:营养混合物 F-12 (DMEM/F12) 稀释。这个准备好的体积足以涂覆12孔板。
4. 在超纯水中制备抗坏血酸镁-2-磷酸盐(一种白色冻干粉)的100mg/mL库存溶液,在10 mL玻璃闪烁小瓶中加入500毫克粉末至5mL水中。用搅拌棒搅拌,直到溶液完全透明(这可能需要一个小时)。此溶液可在-20°C下储存长达一年。
5. 在15mL锥形离心管中溶解1.9928 ml二甲基亚硫酸盐(DMSO)中的10mg冷冻粉,在37°C珠(或水)浴中加热,直到溶液透明。创建CHIR99021(CHIR)10 mM库存。与1.8 mL微离心管中的无二分,在-20°C下储存长达一年。
6. 在15mL锥形离心管中溶解3.1225mL二甲基亚硫酸盐(DMSO)中的10mg-27632(ROCK抑制剂(ROCKi),在37°C珠(或水)浴中加热,直到溶液透明。与1.8 mL微离心管中的无二分,在-20°C下储存长达一年。
7. 要准备基本 8 (E8) 介质,解冻冷冻补充剂,加入 500 mL 瓶的基础培养基,并过滤灭菌。此溶液可在 4°C 下存储长达两周。
   注意:在37°C时不要加热这种介质是非常重要的,因为介质配方中的蛋白质可能会因长时间使用而降解。相反,在使用前,将这种介质保持在室温下15至30分钟。
8. 要制备分拣缓冲液,在DPBS中加入1.33 mL的7.5%牛血清白蛋白(BSA),在DPBS的48.5 mL中加入200μL的0.5 m二胺四乙酸(EDTA),以创建0.5%BSA和2mM EDTA的最终溶液。
9. 要制备 LaSR Basal,请添加 300 μL 的 100 mg/mL 抗坏血酸镁-2 磷酸盐和 5 mL 的谷氨酸MAX 到 500 mL 的高级 DMEM/F12。此溶液可在 4°C 下存储长达一个月。
10. 准备内皮细胞生长介质-2(EGM-2),解冻补充剂,并加入500 mL瓶基底培养基。此溶液可在 4°C 下存储长达一个月。
11. 要制备阻断缓冲液,将500毫克冻干牛血清白蛋白(BSA)和50μL乳化试剂(见材料表)加入48 mL的DPBS。在37°C下孵育至少15分钟,以确保BSA不会结块,随后与溶液分离。

2. iPSC 的解冻、维护和传递

1. 在解冻冷冻的iPSC小瓶之前,用1mL的体外内蛋白溶液涂覆6孔板的单孔(如步骤1.1所述)。在室温下孵育1小时。在将 E8 介质添加到板中之前,不要让此涂层风干。
2. 要解冻 iPSC,从液氮储存容器中取出一个冷冻的 iPSC 小瓶,并在 37°C 下解冻,直到残留一小小团冰。小心(滴滴)将解冻小瓶的含量转移到含有8 mL的冷冷DMEM/F12的15 mL锥形离心管中。用1 mL的冰冷的DMEM/F12清洗解冻小瓶,以尽量减少细胞损失。在300 x g下离心5分钟。
3. 在等待离心机时,将体外内分他进液吸出,并将1mL的E8介质(如步骤1.6中所述)加入井中。然后,从离心锥管中取出DMEM/F12上清液,并在1mL的E8介质中重新悬浮颗粒。将细胞转移到新涂层的板中,确保搅拌悬浮液,以防止菌落在播种时结块。
4. 解冻后通常有大量的细胞死亡。第二天早上,取出介质,用新鲜的 E8 介质更换。
   注:即使在最佳条件下,iPSC 也往往从低温保存中恢复不良。建议冷冻一个接近汇成的6孔,以便将来播种到单6孔。细胞碎片在细胞恢复期间的前2-3天正常。
5. 每天更换 E8 培养基,直到细胞准备好通过(70%-80% 汇合)。
6. 要通过,首先准备体外镀膜涂层井(如步骤 2.1 中所述)。
   1. 一旦体外内膜涂层井准备就绪(约1小时),从井中吸出E8介质,通过并洗涤两次,用1mL的DPBS。在37°C下孵育1 mL 0.5 mM EDTA5~7分钟。孵育时,从新涂布的井中取出体外内丁溶液,用1~2 mL的E8介质代替。
   2. 从要通过的井中取出 EDTA 溶液,用 1 mL 的 E8 轻轻清洗一次或两次,分离菌落。将 75-200 μL 的细胞悬浮液转移到新涂层的含 E8 的孔中,搅拌板以确保均匀覆盖,并立即放入培养箱中。
      注意:iPSC分离的孵育时间是细胞系依赖;建议该协议的用户在充分扩展接收/生成的 iPSC 线路时测试一系列时间。75 μL细胞悬浮液一般在通道之间4天内产生;150 μL 或更多会导致通道之间的 2~3 天。

3. 生成 iPSC 衍生的内皮祖子 (图 1)。

1. 在维护 iPSC 时,请确保菌落被很好地压缩,并且培养中的分化细胞数量很少。如果菌落开始相互接触,细胞很可能过于汇入,需要立即通过。
2. 当 iPSC 为 70%-80% 的混通时,用胶状蛋白混合物涂覆 24 孔板(如 1.2/1.3 中所述)。将这种混合物移液250 μL放入每个井中,并在室温下保持1小时。
3. 在上述1小时孵育期间,分别从冰箱和冰柜中取出E8介质和Y-27632。一旦E8介质和Y-27632达到室温,在15mL圆锥形离心管中加入13μL的10μM Y-27632至13 mLE8,制备E8+ROCKi。
4. 从 iPSC 井中取出 E8 介质,用 1 mL DPBS 洗涤两次,然后在 37°C 下用 0.5 mM EDTA 孵育 5-7 分钟。孵育期后,取出EDTA并迅速将细胞剪切成单细胞悬浮液,带有1mL的E8+ROCKi培养基。
5. 用血细胞计计算细胞。对于可能包含数百万个iPSC的悬浮液,将20μL的细胞悬浮液添加到180μL的试盘蓝色中。确定单细胞悬浮液中的总细胞数。
6. 将 0.432 x 10⁶到 1.296 x 10⁶细胞 (10⁴到 3 x 10⁴细胞/cm²⁾转移到剩余的 E8 + ROCKi 培养基。从新涂覆的 12 孔板中取出胶状混合物涂层,并在每个孔中加入 500 μL 的细胞悬浮液,确保细胞分布良好,不会形成小团块。
   注:此密度范围最适合CD34阳性细胞的分化;但是,这些种子密度与细胞系相关,可能需要由该协议的用户进行优化。
7. 培养24小时后,用500μL的新鲜E8介质更换介质。在相同的条件下,再孵育24小时。
8. 拆下 E8 介质,并更换带有 6-12 μM 的 CHIR99021 的 LaSR Basal。此时间点定义为 D0 的微分。培养24小时后,用相同的细胞培养基替换。
   注: 如前所述,添加到此介质的 CHIR99021 数量取决于所使用的 iPSC 线路。请测试一系列CHIR99021浓度,以确保最佳结果。
9. 使用CHIR99021孵育48小时后,用1mL的LaSR Basal替换。
10. 每天用 2 mL 的 LaSR Basal 更换介质,再延长 2-3 天。此时(D5的分化),这些细胞中有很大一部分会表达CD34,并可定性为内皮祖子。此协议的示意图在图 1中具有代表性的结果进行了概述,并由首次发布此方法 11、19 的调查人员进行了完整描述。
    注:这些内皮祖子可以沿着内皮沿系进一步区分(35%~99%)或平滑的肌肉血统(1%~65%)。差别化效率因ECM涂层的类型和微^分20期间使用的细胞培养培养基而异。

4. 内皮祖子FACS

1. 在分离 D5/D6 分化细胞之前,请按照步骤 1.8 中所述准备分选缓冲液并保持在冰上。
2. 在37°C下用每孔250μL的细胞分离溶液孵育分化细胞(见材料表)10分钟。
3. 使用P1000移液器尖端将细胞分离到细胞分离溶液中的单个细胞悬浮液中。将细胞分离溶液混合物在15 mL锥形离心管中,在300 x g下将离心机5分钟。
4. 取出上清液,在 200 μL 的冷分拣缓冲液中重新悬浮(如步骤 1.7 所述)。将5μL的浓缩CD34-PE抗体加入细胞分拣缓冲液悬浮液中,并在4°C下孵育10分钟。
5. 在 5 mL 的冷冷分拣缓冲器中重新悬浮。在放置分拣机之前,通过带有 40 μm 盖的电池过滤器过滤此悬浮液。
6. 在适当的荧光通道上,对10,000个未标有荧光抗体的细胞进行分类。以高荧光强度,不包含这10,000个细胞中的任何一个区域(图1D)。这将作为负控制。
7. 运行含有带有荧光溶液标记的 iPS-EP 的样本,然后开始排序。CD34在这些内皮祖体中高度表达,很容易与主要人群分离。分拣后,将溶液转移到15mL锥形离心管和离心机5分钟,300 x g。拆下上清液。
   注:如果溶液位于大于微离心管的管中(例如,许多 FACs 协议中常用的 5 mL 聚苯乙烯管),则将分拣缓冲液中的分拣细胞颗粒重新悬浮,并将此溶液转移到微离心管中。在 300 x g下离心 5 分钟,并去除上清液。
   1. 可选:如果需要进一步的 iPSC-EP 表征,可同时添加其他初级抗体(例如 CD31-APC)与 CD34-PE。确保将不同荧光通道之间的串扰最小化。

5. iPSC-EP含胶原蛋白水凝胶的封装和长期培养

1. 通过在 1.8 mL 微离心机中加入 40 μL 的 10x 培养基 199 至 400 μL 的内皮生长培养基 (EGM-2),辅以 10 μM Y-27632,制备播种介质,并将管放在冰上。
   注意:虽然不鼓励使用抗生素用于干细胞培养和分化细胞的维护,但建议在分拣后使用 Pen/Strep 进行给灭,因为很难保证分拣环境中的不育性(这更多如果分拣机在许多实验室之间共享)势在必行)。
2. 从细胞悬浮液中取出所有上清液,加入200μL的EGM-2,并辅以10μM Y-27632。将细胞悬浮液转移到播种介质,并大力混合。
3. 将 350 μL 胶原蛋白添加到步骤 5.2 中制备的溶液中,并混合均匀。溶液将变成淡黄色。
   注:胶原蛋白的最终浓度对毛细管丛的形成有显著影响。该协议假定胶原蛋白以10mg/mL提供,水凝胶的最终浓度为3.5mg/mL。调整这些体积,以达到其最终的胶原蛋白浓度;建议将最终胶原蛋白浓度从2毫克/mL限制在4毫克/mL。
4. 在 5.3 中制备的溶液中加入 5 μL 的 1M NaOH,并混合良好,避免引入气泡。解决方案将变成明亮的粉红色。
5. 将中和胶原细胞溶液制备5.4至96孔超低附件U-底部细胞培养板的单独孔中。在37°C孵育30分钟。在添加介质之前,使用明场显微镜检查样品,检查细胞是否均匀分布。
6. 通过在微离心管中加入1μL的每种库存溶液,制备1 mL的培养基,包括EGM-2,辅以10μM Y-27632和50纳克/mL血管内皮生长因子(VEGF)。混合良好后,将这种细胞培养基的移液器100μL移液器输送到含细胞水凝胶中。将板转移到 37°C 进行长期培养。
7. 每天更换培养培养基,根据研究目标增加额外的血管生成生长因子或小分子抑制剂。为了最佳地去除介质,倾斜板并使用 P100 尖端轻轻吸气介质,而不会干扰水凝胶。

6. 基于EP的血管网络的修复、免疫染色和可视化

1. 经过一周的培养后,在48孔板中加入250μL的4%甲醛(PFA)溶液。填补尽可能多的水井,因为有水凝胶。从水凝胶 (PFA) 中取出介质,并使用细尖钳子将水凝胶转移到含有水凝胶的井中。在室温下孵育10分钟,用PBS快速清洗,取出PFA。
2. 在室温下加入非离子表面活性剂的250 μL(见材料表)5分钟,进行渗透。用250 μL的PBS洗涤两次,辅以300 mM甘氨酸。在每个洗涤步骤的室温下孵育5分钟,以确保去除多余的洗涤剂。将水凝胶浸入250μL的阻隔缓冲液中30分钟。
3. 在4°C的阻断缓冲液中一夜,用所需的原抗体孵育。例如,如果免疫染色与phalloidin和VE-卡他林,分别稀释1:40和1:200,在阻塞缓冲液。
4. 第二天,取出原抗体溶液,用DPBS中的0.5%乳化试剂洗涤两次。用铝箔盖住,在室温下用物种特异性二级抗体(例如,PBS 中的 1:200 Alexa Fluor 488)孵育 2 小时。
5. 取出二级抗体溶液,用DPBS中的0.5%乳化试剂洗涤两次。在每个洗涤步骤的室温下孵育5分钟,以确保去除游离的荧光。
6. 要可视化细胞核,在PBS中稀释4'、6-二酰胺-2-苯林多尔(DAPI)1:10000,并添加到样品中。
   1. 在室温下孵育2分钟,用PBS洗涤两次。在每个洗涤步骤的室温下孵育5分钟,以确保去除游离的荧光。
7. 将样品转移到血管生成型+-Slide或玻璃底部培养皿,使用细尖钳子。确保水凝胶下方没有气泡。
8. 通过获取从样品底部延伸到顶部的 z 堆栈,在共聚焦显微镜上进行图像。确保探测器未饱和,且可用最小放大倍率正在使用中(需要使用大型视场)。
   注:对于将来的处理,请确保以最小的压缩(例如 .czi)保存 z 堆栈。

7. 利用计算管道分析和比较血管网络拓扑

1. 检查每个 z 堆栈,以确保切片仅包含容器。在 ImageJ 中打开 z 堆栈,通过单击"图像 >调整>亮度/对比度"来增强对比度。船只边界现已明确划定,背景水平最小化。通常,z 尺寸与 x/y 尺寸不匹配。要纠正这种情况,请单击"图像> 调整>大小"并更改 z 切片数,以便每个切片之间的距离等效于 x/y 中的一个像素。 如果此步骤未正确执行,则最终 3D 卷将显示为压缩。
   注意:EC会向凝胶的边缘迁移,形成小的鹅卵石菌落。虽然这些对于估计水凝胶的边界很有用,但它们会干扰最终图像分析,应删除。
   注:ImageJ是由美国国家卫生研究院和光学和计算仪器实验室共同开发的基于Java的开源图像分析软件。建议下载斐济,这是简单的ImageJ捆绑有用的插件(https://fiji.sc/)。
2. 在 ImageJ 中,在 3 维单击"过程>滤镜>高斯模糊 3D"中模糊图像,然后将所有 3 个维度中的西格玛值设置为 2.0(此值可能需要由最终用户调整)。
3. 在 ImageJ 中,单击"处理>二进制>制作二进制",然后选择适当的阈值算法。李等人开发的交叉熵阈值算法能有效地将血管与^背景21分离出来。计算每个图像的阈值,并将背景设置为"默认"。
4. 在 ImageJ 中,通过单击"处理>噪声>消除异常值"来消除杂散噪声并填充流明中的"孔"。
   注:删除"明亮"异常值将填充连接容器中的小孔;去除"暗"异常值将删除死细胞。拆卸半径的大小会因容器的放大倍数和尺寸而异。对于以 512 x 512 像素的宽场目标获取的图像,半径通常范围为 4-6 像素。
5. 在继续执行步骤 7.6 之前,处理所有原始文件(例如 czi 扩展名)并转换为 .tif 文件。为了协助此处理,本手稿上附加了 ImageJ 脚本"Binarize 和 Filter.ijm"。
6. 将处理过的 .tif 文件与"BatchProcessSkeleton.m"文件保存在同一文件夹中,可在手稿中下载。这个脚本,由作者开发,调用由菲利普·科尔曼^斯伯格22发布的函数,并执行一些额外的文件操作。
7. 下载并解压缩与两个主要功能"Skel2Graph3D"(https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d)和"Skeleton3D"(https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d)相关的所有文件。将所有函数保存到与打开的处理 z 堆栈相同的文件夹中。
8. 打开一个多范式数值计算环境(参见材料表),并导航到保存上述所有文件的文件夹。
9. 通过在命令窗口中键入BatchProcessSkeleton或打开脚本并点击编辑器中的"运行"按钮(面向右的绿色箭头)来运行"BatchProcessSkeleton.m"。
   注: 要使用单个命令分析大型数据集,请确保第 6 行dir函数内的字符串包含星号(例如,"*.tif")。否则,如果需要分析单个文件,请将星号替换为文件名。
10. 此脚本执行的时间长度将因可用的计算能力而有很大差异。建议在具有至少 8 GB RAM 的计算机上执行此分析,以便用户可以在脚本运行时访问其他程序。
    注意:虽然不是绝对必要的,但绘制原始共聚焦采集(灰色)并与骨架矩阵(红色)叠加,有助于评估骨架化算法的性能。此外,读者还可以创建由科尔曼斯伯格等人实现的节点图,以评估网络分析的准确性。创建这两个图形虽然有用,但会大大增加脚本的运行时,并需要额外的内存;如果用户只需要最终拓扑分析,并且不想可视化数据集,只需注释掉 44 到 61 行(骨架图)和行 104 到 143(拓扑图)。
11. 完成后,在工作区中可见的数据矩阵现在包含已处理的数据。双击"数据"并在变量编辑器中打开此单元格。
    1. 请注意,此矩阵将包含从左到右:1) 文件名,2) 节点数(分支点 + 端点),3) 分支点,4) 链路(即容器),5) 网络长度(包括隔离容器),以及 6) z 堆栈中包含的切片数。将这些数据另存为 .csv 文件并导出以进行进一步分析,以用于任何选择的软件。

结果

分化(图1),FACS和iPSC-EP封装在胶原蛋白水凝胶中,细胞通常会保持四舍五入24小时,然后开始迁移并形成初始流明。经过大约6天的培养后,当用明场显微镜观察时,水凝胶中可以看到一个原始的毛细管丛(图2)。在共聚焦显微镜(电影1,补充电影1)上成像固定、染色的含细胞水凝胶后,预先处理的图像将转换为骨架,从而能够分析...

讨论

该协议涉及三种细胞培养基基中细胞的长期培养:E8、LaSR巴塞尔和EGM-2。因此,应非常小心,适当地消毒所有材料。此外,在实验室的层流罩中工作时,应始终佩戴实验室外套和乙醇清洁手套。建议经常检测支原体污染;如果在 iPSC 培养期间观察到大量碎屑或观察到分化效率突然下降,则支原体污染是可能的原因。使用该协议生成的 iPSC-EP 往往会沉积大量的 ECM,从而延长分离时间,并导致单个细胞悬浮液分离?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile	Corning	7007	Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	The base media for iPSC-EP differentiation.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture	Fisher Scientific	A8412	To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg	VWR	354249	Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	To wash monolayer cultures
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011	Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)	Fisher Scientific	356231	Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	VWR	87003-294	Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein	R&D Systems	293-VE	Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin	Themo Fisher Scientific	R415	To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent)	Fisher Scientific	BP337	Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded