用于筛查绝经后心血管功能障碍的外源雌激素治疗的活体雌激素缺乏小鼠模型

摘要

临床上,更年期妇女雌激素缺乏可能加重脂质紊乱和动脉粥样硬化的发生率。我们通过在apoE-/-小鼠的双背侧切口,通过双边卵巢切除术建立了体内雌激素缺乏模型。小鼠模型适用于绝经后心血管功能障碍的外源雌激素治疗。

摘要

绝经后妇女患心血管疾病的风险比绝经前妇女大。与卵巢功能完整的雌性小鼠相比,雌性小鼠在失异时出现卵巢切除术(OVX)增加了主动脉动脉粥样硬化的病变。然而,缺乏涉及雌激素缺乏小鼠的实验室模型,这些小鼠具有动脉粥样硬化的易发性状态。这种缺陷是至关重要的,因为更年期妇女的临床雌激素缺乏可能加剧先前存在的或持续的脂质紊乱和动脉粥样硬化的发生率。在这项研究中,我们通过双背侧切口在脂蛋白E(apoE)-/-小鼠中通过双边卵巢切除术建立了体内雌激素缺乏小鼠模型。然后,我们比较17°-雌二醇和伪原蛋白素(PPD)(植物雌激素)通过薄杉醇传播的内给的影响。我们发现,虽然PPD对降低OVX apoE^-/-小鼠的最终体重和血浆TG有一定作用,但它具有抗动脉粥样硬化和心脏保护能力,与17°雌二醇相当。PPD是一种植物雌激素,已报告发挥抗肿瘤的特性。因此,该方法适用于通过口服给雌激素筛选植物雌激素,以取代绝经后妇女的传统激素替代疗法,据报告,这种疗法具有潜在的有害肿瘤遗传能力。通过木耳传播的口服给政是无创的,使其广泛适用于许多患者。本文包含通过 apoE^-/-小鼠和 Peroral 17°-雌二醇或植物雌激素激素通过薄荷传播的双背侧切口进行双边卵巢切除术的逐步演示。血浆脂质和心血管功能分析使用超声心动图跟踪。

引言

流行病学和临床研究显示,绝经后妇女患心血管疾病的风险比绝经前妇女1、2要大得多。激素替代疗法(HRT)可降低心血管疾病的相对风险至0.37-0.79 3。在其他并发症中,由心血管疾病引起的动脉粥样硬化^{是全世界4.}然而,缺乏涉及雌激素缺乏小鼠出现动脉粥样硬化倾向状态的实验室模型。该协议提供了一个体内雌激素缺乏小鼠模型,用于筛查绝经后心血管功能障碍的外源性雌激素治疗。

先前的研究表明,在高胆固醇饮食中应用OVX在动脉粥样硬化啮齿动物中可以模仿绝经后妇女患有动脉粥样硬化5、6、7、8。一种类似更年期女性动脉粥样硬化状态的可重复和方便的动物模型是外源雌激素研究的基础。在这里,双侧侧切口的双边卵巢切除术被应用于动脉粥样硬化易脂蛋白E敲除(apoE^-/-)小鼠9,10。与中腹或背侧切口相比,双背侧切口是一种更容易、更省时的方法,可以避免严重的腹腔粘附和炎症。通过薄荷传播(见材料表)的渗透管理是非侵入性和方便的,使其广泛适用作为一个长期管理^模式11。慢释放颗粒植入也很受欢迎6。然而,植入物可能会加重感染的发生率,特别是在接受OVX的小鼠中。其他非侵入性管理模式,如口腔口和供水管理,也有许多缺点。口腔食道通常对小鼠造成压力,并可能导致食管损伤。通过饮用水管理激素是非常有益的;然而,添加DMSO作为乳化剂是不可避免的,因为外源雌激素不溶于水。在这里,我们选择通过长期给政用的薄荷替代17°-雌二醇或植物雌激素激素。

最近,HRT对绝经后妇女心血管系统的有益作用在妇女健康倡议(WHI)^试验12中受到质疑。一方面,仅外源雌激素对心血管系统有有益的影响;另一方面,它可以与醋酸甲酰乙酰丙酮结合,增加心血管事件的风险。更严重的是,HRT可能导致乳房和子宫肿瘤进展,这种效果已经明显限制了其使用13,14。更多的兴趣集中在肿瘤细胞15、16、17中缺乏线粒体活性的外源雌激素的心血管保护作用上。对人类和动物的多项研究表明,具有与雌激素结构相似的植物雌激素在心血管保护方面可以发挥有益的^作用。

因此,本工作的目标是(i) 通过双背侧切口在 apoE^-/-小鼠中通过双边卵巢切除术建立体内雌激素缺乏小鼠模型,以及 (ii) 比较血管保护作用施用17°-雌二醇和伪丙二醇(PPD),通过薄荷传播。17°-雌二醇是一种外源雌激素,属于女性性激素6,11,19。PPD,一种来自迪奥斯科卡植物的类固醇皂苷和植物雌激素,以前曾被报道具有抗肿瘤的特性20。

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研究方案

所有动物护理和实验规程均经中国医学科学院动物护理与使用委员会和北京协和医学院批准(许可号:SYXK(北京)2013-0023)。apoE-/-小鼠的起源是C57BL/6J9,10。

1. 通过 apoE 中的双侧切口进行双边卵巢切除术^-/-小鼠

1. 在产间(年龄28天),用避免素(三溴二苯醚乙醇;200毫克/千克;腹内)麻醉雌性apoE-/-C57BL/6J小鼠。
   注:32个apoE-/-小鼠被随机分为4组:SHAM、OVX、OVX/E2和OVX/PPD组(n = 每组8个)。
2. 将动物置于加热垫上的易发位置。在麻醉期间涂抹眼部润滑剂,保护眼睛。
3. 将体温保持在36~0.5°C以内。将镇痛卡洛芬的5mg/kg体重分皮下至小鼠颈部的侧向。
4. 从 iliac 峰顶上切下 3 x 5 cm²小鼠区域头象。在用3 x 5 cm²孔径手术片覆盖动物之前,用碘彻底清洁剃光区域,然后使用70%乙醇清洁。在实验过程中使用无菌仪器和手套。
5. 使用剪刀和钳子使切口1厘米横向到中线和1厘米侧到成本肋骨。
6. 用钳子模糊地解剖皮下组织。
7. 使用解剖护目镜(见材料表)识别腹腔内的白色脂肪组织。
8. 使用微剪刀和微钳通过筋膜进行0.5-1厘米切口,直到腹腔到达。
   注:对于假操作的团体,直接关闭伤口。使用单丝缝合线分别缝合肌肉层和皮肤。
9. 当可以看到腹腔内的白色脂肪组织时,用微钳抓住脂肪组织,然后轻轻地将其拉出。可以看到一个粉红色的桑形卵巢,包裹着腹腔的脂肪组织。
10. 使用单丝缝合线将 0.5-1 厘米近端容器和子宫角倾斜。使用微剪刀取出卵巢,并将剩余的组织放回腹腔。
    注:OVX手术的主要不良症状是输尿管结扎,导致OVX手术小鼠死亡率高。这可以通过使用解剖护目镜识别组织来避免。
11. 把伤口关上使用单丝缝合线分别缝合肌肉层和皮肤。
12. 使用剪刀和钳子使另一个切口 1 厘米横向到中线和 1 厘米横向到另一侧的成本肋骨。重复上述步骤(1.5 至 1.11)。
13. 让动物从麻醉中醒来。另外,在手术后的第一天保持鼠标。
14. 在恢复阶段经常清洁或更换保持架。
15. 手术后约24小时,再施用5毫克/千克的镇痛卡洛芬皮下体重。

2. 通过黑桃传播对17°-雌二醇或PPD的口服管理

1. 彻底溶解芝麻油中的17°-雌二醇或PPD,然后将芝麻油与薄荷粉混合(见材料表)。每只30克小鼠的每日份量包含3μg的17μ-雌二醇或15μg的PPD,4μL的芝麻油,和60毫克的薄荷传播。准备安慰剂每30克小鼠含有4μL芝麻油和60毫克的薄荷蔓延。
   注:17-雌二醇或PPD的每日分管部分基于先前的研究6、11和初步实验。
2. 在OVX一周后,用高胆固醇饮食(1.25%胆固醇,0%的乔拉)喂小鼠12周。本研究中使用的一种典型的实验治疗方案如图1所示。
3. 在第4周,在2-5只小鼠的口服前5天,训练小鼠食用含有约30毫克薄荷的安慰剂,为2-5只小鼠传播5天。在头3天,在家里的笼子里对老鼠进行分组训练。在训练的第四天和第五天将小鼠放在单独的笼子里,每天提供与实验情况相似的部分。
4. 在过去9周中,将小鼠放入单独的笼子,然后每天为每个喂食场合提供薄荷的扩散部分。
   注:每日份量含有17μ-雌二醇(0.1毫克+千^克-1)或PPD(0.5毫克+千^克-1),分别通过OVX/E2和OVX/PPD组传播的栗子;每日份量含有无激素的薄荷,在SHAM和OVX组传播。

3. 使用微超声系统测定Intima-媒体厚度和心脏功能障碍

1. 超声学生物显微镜
   1. 终止前一天,使用微超声系统(见材料表)检查宫内介质厚度和心脏功能障碍,如前^所述21。
   2. 在检查之前,给每只小鼠注射200毫克/千克的腹内注射,作为麻醉剂(n = 每组8只小鼠)。
   3. 小心地细细地把每只老鼠的颈毛洗过。自由应用暖超声传输凝胶,以确保最佳的图像质量。
   4. 以 12.7 mm 对焦和 40 μm 的分辨率,通过 30 MHz 扫描头获取主动脉根和上升主动脉的基线超声图像。
   5. 使用带铅 II 配置的心电图进行监测。
   6. 在 systole 的一个平面中捕获上升主动脉、主动脉拱和胸腔头动脉分支的右半身长轴图像(图 3)。
2. 内蒂玛介质和最大斑块厚度的测量
   1. 轻松调整传感器与动脉部位之间的距离,以获得清晰的图像。
   2. 将 10 s cine 循环以数字方式存储,以便离线检查在图像分析系统上。
   3. 手动选择最佳的冻结帧超声图像,以便进行进一步测量。检查升序主的次要曲率中的图像。如果可以看到上升主塔中的斑块,则测量最大斑块厚度。如果无法看到上升主塔中的斑块,则测量最大 IMT。
   4. 测量 IMT(血管发光-中间接口和中间-机会界面之间的距离)。测量最大斑块厚度(血管流明和冒险层边界之间的最粗距离)。
   5. 来自三个病变部位的平均数据(图3)。
3. 使用超声心动图确定心脏功能障碍
   注:使用微超声系统通过超声检查心脏功能,如前^所述22。
   1. 将超声波束指向心脏,靠近毛细管肌肉。
   2. 实现基于二维心电图的千赫兹可视化。
   3. 使用 30 MHz 扫描头在左心室进行体内异胸超声心动图。
   4. 从 M 模式跟踪以数字方式测量与心脏功能相关的参数。
   5. 平均三到五个心脏周期的数据(表1)。
4. 观察员内和观察员间变异性
   1. 要验证观察者内变异性,请由一个操作员在两个不同场合分析数据。
   2. 要评估观察者间的可变性,请由不同的运算符分析数据。

4. 每周体重测量和血浆总胆固醇 (TC) 和甘油三酯 (TG) 测定

1. 每周体重测量
   1. 从 -1 周到第 12 周,每周测量一次体重。
      注:n = 每组8只小鼠。
2. 等离子体制备
   1. 在通过心脏内穿刺采集血液样本之前,准备注射器和管子。使用 EDTA 作为抗凝剂。将 10 μL 的 0.5 m EDTA 添加到每 2 mL 注射器中,并在每根 1.5 mL 管中加入 8 μL 0.5 m EDTA。
   2. 在第12周,在一夜禁食后,用苯(三溴二苯乙醇;200毫克/千克;腹内)对小鼠进行麻醉。
      注:n = 每组3个小鼠。
   3. 用70%乙醇准备腹腔胸腔区域。
   4. 使用剪刀和钳子打开胸腔,切断肋骨,直到跳动的心脏暴露。
   5. 将 25 G 针头插入右心室。缓慢吸气,直到血液开始流入注射器。
      注:我们使用一次性注射器在无菌条件下与25G针(见材料表)。
   6. 继续吸气,稳定,均匀的压力。如果没有血,重新定位针头并重复吸入。
   7. 在收集所需的血量之前,让小鼠进行深度麻醉。通常,可以采集高达 1 mL 的血液。在这种深层麻醉条件下,通过宫颈错位使小鼠安乐死。
   8. 将血液样本放入1.5 mL管中,彻底倒置血液,以确保将EDTA混合到血液中。然后立即将血液样本放在冰上。
   9. 在收集后 30 分钟内在 4°C 下 400 x g下进行 20 分钟的离心样品。
   10. 仔细收集上清液。将等离子样品储存在-80°C。
3. 为 TC 或 TG 内容测量构建标准曲线
   1. 对于 TC 标准曲线,准备各种浓度的胆固醇标准:0 mmol/L、0.52 mmol/L、1.03 mmol/L、2.07 mmol/L、4.14 mmol/L、6.20 mmol/L、8.27 mmol/L 和 10.34 mmol/L. 测量每个胆固醇标准。为每个胆固醇标准设置平均 O.D.。作为垂直 (Y) 轴值,将浓度设置为水平 (X) 轴值。使用统计软件创建标准曲线。
   2. 对于 TG 标准曲线,准备各种浓度的 TG 标准:0 mmol/L、0.45 mmol/L、0.90 mmol/L、1.81 mmol/L、3.62 mmol/L、5.42 mmol/L、7.23 mmol/L 和 9.04 mmol/L. 测量 O.将每个 TG 标准的平均 O.D. 设置为垂直 (Y) 轴值;将浓度设置为水平 (X) 轴值。使用统计软件创建标准曲线。
      注:本研究对标准曲线构造采用了四参数物流曲线拟合(4-pl)。在测量等离子样品之前,请检查标准曲线,并确保 r²大于 0.995。
4. TC 含量测量
   1. 将 TC 测定试剂盒中的彩色试剂瓶 (25 mL) 标记为"TC 工作解决方案"。
   2. 短暂涡旋冷藏样品。在蒸馏水中制备稀释:在80μL蒸馏水中20μL的血浆。短暂涡旋稀释。
   3. 在 96 孔板的适当孔中加入 2.5 μL 的胆固醇标准(5.17 mmol/L)或稀释血浆的 2.5 μL 或 2.5 μL 蒸馏水(空白)。建议进行三次处理。
   4. 对所有油井添加250μL的颜色试剂。
   5. 在37°C孵育10分钟。
   6. 打开微孔板读卡器,让 10 分钟预热。
   7. 从培养箱中取出板,并在 510 nm 处读取微孔板读片器。确保微小井或板底部分别无气泡或灰尘。
   8. 计算 TC 浓度如下:
      TC con. = 胆固醇标准= (血浆样本 O.D.-空白 O.D)/(胆固醇标准 O.D.空白 O.D.
5. TG 含量测量
   1. 将 TG 测定试剂盒中的彩色试剂瓶 (25 mL) 标记为"TG 工作解决方案"。
   2. 短暂涡旋冷藏样品。
   3. 将 2.5 μL 的 TG 标准 (2.26 mmol/L) 添加到稀释的等离子体或 2.5 μL 的蒸馏水(空白)中,以至 96 孔板的适当孔中。建议进行三次处理。
   4. 对所有油井添加250μL的颜色试剂。
   5. 在37°C孵育10分钟。
   6. 打开微孔板读卡器,让 10 分钟预热。
   7. 从培养箱中取出板,并在 510 nm 处读取微孔板读片器。
      注:确保微小井或板底部没有气泡或灰尘。
   8. 计算 TG 浓度如下:
      TG 公司 = TG 标准= (等离子样品 O.D.空白 O.D)/(TG 标准 O.D.空白 O.D)

5. 主动脉动脉粥样硬化病变的面分析

1. 大数隔离和切除
   1. 在第12周,在一夜禁食后,用苯(三溴二苯乙醇;200毫克/千克;腹内)对小鼠进行麻醉。在这种深层麻醉条件下,通过宫颈错位使小鼠安乐死。
      注:我们每组使用3只老鼠。
   2. 用70%乙醇准备腹腔胸腔区域。使用剪刀和钳子打开胸腔,切断肋骨,直到跳动的心脏暴露。
   3. 在pH 7.4处用磷酸盐缓冲盐水填充50 mL注射器(见材料表)。将 25 G 的针头插入左心室,并切割右心房,以避免灌注产生的高压。
   4. 以0.05-0.08 mL/min的流速在原位灌注。用组织吸收灌注液。
   5. 用剪刀和钳子切除胸腔的肋骨和肺。然后,打开腹腔,取出里面的器官,以更好地查看主塔。
   6. 用微钳固定心脏,用微剪刀将主干从脊柱上分离,直到脊柱分叉,从而去除主干。
      注:解剖肾脏心房支附近时,使用微剪刀切开,以避免主塔损伤。
   7. 修复心脏和主塔48小时在4%的甲醛。主数在室温下或2-8°C将主数储存在盐水中几个小时。
      注:此过程将促进清洁。
2. 大数的准备
   1. 取出心脏。在立体显微镜下,使用微钳和微剪刀小心地从主间中取出新食组织。在清洁过程中使用盐水保持组织湿润。
      注:小心不要撕裂或刻痕主动脉和一些重要的分支,如不分大动脉,左普通胡萝卜动脉,左下环动脉。
   2. 留下1毫米的内分,留下常见的胡萝卜动脉,切断整个左下腺动脉。
   3. 通过不分动脉切开外曲率,然后切至左侧常见的胡萝卜动脉,然后切至左侧亚克隆动脉。
   4. 沿着上升部分的内部曲率切开腹部底部。
   5. 将主盘固定到黑色塑料布上,并涂抹盐水,防止主干干燥。
3. 主塔内点区域的图像
   1. 用立体显微镜拍摄面部大数的照片。在图像中包括一毫米刻度标尺以校准测量值。
   2. 在同一图像中包括弓形和胸腔区域,在另一个图像中包括腹部区域。将图像另存为 JPEG 或 TIFF。
      注:拱区是从心肌的交界处到3毫米远端从左下环动脉,胸区域是3毫米远至左下环动脉到最后一个间动脉,腹部区域是最后一个成本间动脉到伊利亚克分 岔。
4. 动脉粥样硬化病变面法的定量
   1. 校准
      1. 使用图像分析软件打开图像(参见材料表),转到空间校准并按照说明进行操作。
      2. 通过将标尺定位在线条上,将参考单位更改为 mm。
   2. 测量
      1. 为每个图像设置正确的校准。
      2. 在尺子上测量 3 mm。
      3. 拱形和胸腔区域测量:从心肌结点到3毫米远端,从左下瓣动脉和胸腔区域从3毫米远端到左下尾动脉到最后一条间动脉,勾勒出拱区。在拱门和胸腔区域跟踪病变,并通过显微镜观察主塔。
      4. 腹部区域测量:勾勒出从胸腔区域末端到腹腔分叉的腹部区域。腹部区域的痕量病变,并通过显微镜观察主塔。
      5. 计算相对于主塔内表面的病变面积。
      6. 通过对研究组视而不见的第二个观察者验证定量。

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结果

本研究中使用的一种典型的实验治疗方案如图1所示。在产间(年龄28天),雌性apoE-/-C57BL/6J小鼠用非他林(三溴二苯醚乙醇;200毫克/千克;腹内)进行麻醉。小鼠通过1厘米背切口进行双边OVX或假手术。在双边OVX一周后,小鼠被喂食高胆固醇饮食(1.25%胆固醇,0%乔拉)12周。17°-雌二醇(0.1毫克+千^克-1)或PPD(0.5毫克+kg-1)在治疗的最后9周内通过薄桃传播?...

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讨论

这里描述的方法类似于在更年期妇女看到的脂质紊乱和动脉粥样硬化的小鼠模型。有充分证据表明,绝经后妇女的雌激素缺乏会加重先前存在或持续的高胆固醇血症的发病率,并逐渐复杂和广泛地出现动脉硬化病变1。为了模拟临床上容易发生动脉粥样硬化的情况,应用了缺乏动脉硬化的小鼠,这是一种可重复和方便的动物来源,用于研究23、24、25。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
17β-estradiol, >98%	Sigma-Aldrich	E8875-250MG	Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles)	Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd	0.5*19TWLB	Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet	Huafukang Bio-Technology	N/A	1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System	VisualSonics	Vevo®770	Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463-250ML	Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd	R413	Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella)	Ferrero	N/A	Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier	Dohegan Optical Company Inc.	N/A	Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4	SIGMA	P3813	Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader	Tecan	Infinite M1000	Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin	Shanghai Winherb Medical S & T Development	W-0427	CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL	Pfizer Pharma GmbH	462986	Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-1L	Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel	Menarini, Solco Basle Ltd.		Eye protection during anesthesia
Stereo microscope	MCALON	MCL-6STV	Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge	SIGMA	1-14K	Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm)	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm)	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm)	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm)	Kanghua Medical Equipment Co., Ltd		Surgical tools
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-5G	Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit	Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering	A110-1	Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit	Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering	A111-1	Plasma TC determination