早期开发期间海葵基因分型

摘要

该协议的目标是在胃化过程中基因型海葵奈马托斯特拉静脉曲张,而不牺牲胚胎。

摘要

这里描述的是基于PCR的协议基因型的胃肠阶段胚胎的蚂蚁阴极内人内马托斯特拉vesisis,而不牺牲动物的生命。在体外受精和脱胶后,酶在室温下发育24小时,达到早至中气期。然后,将胃粒胚胎放在含有海水的培养皿中的甘蔗胶床上。在解剖显微镜下,钨针用于从每个胚胎中手术分离一个腹腔组织片段。手术后胚胎可以愈合并继续发育。基因组DNA从分离的组织片段中提取,并用作位点特异性PCR的模板。基因型可以根据PCR产品的大小或存在/不存在的等位基因特异性PCR产品来确定。手术后胚胎然后根据基因型进行分类。整个基因分型过程的持续时间取决于要筛选的胚胎数量,但它至少需要4~5小时。该方法可用于识别来自基因异质胚胎种群的敲除突变体,并在发育过程中分析表型。

引言

仙人掌代表一组不同的动物,包括水母、珊瑚和海葵。它们是二叶虫,由细胞外基质(中细胞体)分离的内皮和内皮组成。Cnidaria是一个姐妹团体,以种像比拉提利亚,传统的动物模型,如果蝇和穆斯属于1。此外,被认为发生在2月2日寒武纪前,Cnidaria-Bilateria发散。因此,对仙人掌和双栖教徒的比较研究对于深入了解他们最近共同祖先的生物学至关重要。最近,比较基因组学显示,仙人掌和双子食者共享许多发育工具包基因,如notch和bHLH,这意味着他们的共同祖先已经拥有这些基因3。然而,这些发育工具包基因在Cnidaria和Bilateria的最后共同祖先中的作用相对而言,还不太了解。为了解决这个问题,研究这些深保守的基因在仙人掌中如何发挥作用是至关重要的。

新兴的仙人掌遗传模型之一是蚂蚁内马托斯特拉的维森斯。其基因组已测序3,各种基因工具,包括形态介导基因敲除,梅甘细胞介导的转基因,CRISPR-Cas9介导基因敲和敲,现在可用于这种动物。此外,内马托斯特拉的发展也相对来说也比较了解。在胚胎生成过程中,胃化发生于阴道4,胚胎发育成自由游泳的平面幼虫。之后,平面图转化为带嘴和圆角触角的环状息肉。息肉然后增长,并达到性成熟。

CRISPR-Cas9介导的靶向诱变现因现在经常用于研究内马托斯特拉维克塞西5、6、7、8、9的基因功能。为了在Nematostella产生敲除突变体,一种含有原点特异性单导RNA和内分酶Cas9蛋白的鸡尾酒首先被注射到未受精或受精的卵子中,以产生通常显示的F0创始人动物马赛克主义。F0动物随后被提升到性成熟,并相互交叉,以产生F1种群,其中一个子集可能是敲除突变体6。或者,性成熟的F0动物可以与野生型动物交叉,以产生F1杂物动物,而F1杂物携带一个敲击等位基因在兴趣点,然后可以交叉彼此产生F2后代,四分之一其中预计将被敲除突变体5。这两种方法都需要一种方法来识别来自基因异质种群的敲除突变体。息触角可用于提取基因组DNA进行基因分型6,7。然而,在研究相关基因的发育功能和突变胚胎未达到息肉阶段的情况下(即,由于与突变相关的幼虫致死性),需要在早期发现敲除突变体。这里描述的是基于PCR的方案基因型个体动物在气态阶段不牺牲动物,这使得识别从基因异质的胚胎种群敲除突变体。整个基因分型过程的持续时间取决于要筛选的胚胎数量,但它至少需要4-5小时。

研究方案

1. 诱导产卵、体外受精和脱胶

1. 在16°C的黑暗中保持海水中每千分之12的盐度(ppt),每天喂食Artemia。
2. 在产卵诱导的前一天,将动物置于温控和光控制的培养箱中。对孵化器进行编程,使动物在25°C时暴露在8小时光下。可选:在将一小块牡蛎(<1mm 3)喂给单个动物之前,再将它们放入孵化器,以提高产卵。
3. 在16°C下将动物留在孵化器中1小时。
4. 将动物从孵化器中取出,放在室温 (RT) 下带光的台面上,以便产卵。生成通常发生在接下来的 1.5–2 小时内。
5. 如果雄性与雌性位于单独的容器中,则使用转移移液器将雌性容器中的卵子包裹放入含精子的男性容器中,其尖端被切开以扩大开口,使卵子在转移。让卵子受精,将其留在雄性容器中至少15分钟。
6. 在培养皿或15 mL管中,将含有3%半胱氨酸(pH 7.4)的海水中的鸡蛋包装去果冻。轻轻搅拌摇床 12 分钟。
7. 使用塑料移液器将团块分解,并继续搅拌 2-3 分钟,直到完全脱胶。
8. 用新鲜海水更换介质至少5次,去除半胱氨酸。
9. 将受精卵放在16°C或RT的玻璃培养皿上。

2. 手术切除胃肠道胚胎的腹腔组织

1. 准备一个由10 mM Tris-HCl (pH 8)、50 mM KCl、1 mM EDTA、0.3% Tween20、0.3% NP40 和 1 mg/mL 蛋白酶 K 组成的 DNA 提取缓冲液。通过涡旋和将缓冲液等分到PCR管中进行良好混合。
2. 将1%的甘蔗在海水中溶解,倒入培养皿中,覆盖底部。在台面上冷却,使凝胶床。倒入新鲜的海水,以覆盖培养皿中的凝胶床。
3. 将24小时受精后(hpf)胚胎(早至中气期)转移到含有甘蔗胶床的培养皿中。
4. 将钨针插入针头支架,通过将针头浸入酒精中(70% 或更高)并将其置于火焰中以烧掉酒精进行消毒。
5. 在解剖显微镜下(放大倍率为20倍至40倍),使用钨针在角胶床上制造凹陷,去除一块与要操纵的胚胎大小的表面角胶,并将胚胎侧侧置于凹陷上侧朝下,以限制显微手术胚胎的运动。
6. 使用钨针手术切除位于口腔口对面的一块腹腔组织。沿着口腔-腹腔轴的胚胎组织的三分之一到四分之一通常就足够了。
7. 使用 P20 移液器将分离的腹腔组织(在 <2 mL 中)转移到含有 20 mL DNA 提取缓冲液的 PCR 管中。
8. 将手术后胚胎移植到含有至少500 mL的新鲜海水的孔中,在24或96孔的盘子里。
9. 根据需要对胚胎数量重复步骤 2.4_2.8。
10. 将含有手术后胚胎的孔板置于16°C或RT的培养箱中,直到基因分型完成。

3. 基因组DNA提取和基因分型PCR

1. 使用微型离心机(例如,在 2,680 x g处为 10 s)短暂旋转含有 DNA 提取缓冲液的 PCR 管和分离的胚胎组织。
2. 为了从单个胚胎中提取基因组DNA,在55°C下孵育PCR管3小时,涡流每30分钟孵化30秒,以确保细胞团块破裂并增强细胞分解。
3. 在95°C孵育PCR管5分钟,使蛋白酶K灭活。
4. 将gDNA提取物保持在4°C或冰上,并立即进入PCR。
   注: 通过将 gDNA 提取物放入 -20°C 冷冻箱,可以在此处暂停该协议。
5. 使用提取的gDNA作为模板建立PCR反应,以放大感兴趣的基因组位点。
   1. 如果兴趣点处的不同等位基因大小不同,以便通过角胶凝胶电泳检测出大小差异,则设计一组引体来放大整个轨迹。
   2. 或者,使用仅在存在特定等位基因的情况下生成 PCR 产品的等位基因;例如,通过设计与包含插入/删除突变的区域结合的引体。
   3. 使用典型的 20 mL PCR 反应混合物如下:5 mL gDNA 提取物、8 mL 无核酸酶水、4 mL PCR 缓冲液、0.2 mL 10m dNTP、0.6 mL DMSO、1 mL 10 mM 正向底漆、1 mL 10 mM 反向底漆和0.2 mL的DNA聚合酶(见材料表)。
      注:PCR反应中可使用多引力。例如,可以组合一个通用正向引色和两个等位基因特异性反向引色,只要两个反向引色器设计为生成不同尺寸的PCR产品,以便两个等位基因的存在/不存在可以明确由凝胶电泳确定(参见代表性结果部分)。
6. 运行阿加玫瑰凝胶电泳,以确定PCR产品的大小和存在/不存在。根据 PCR 产品的预期尺寸调整腺胶电泳(例如,胶胶百分比、V/cm 和持续时间)的状况。
7. 使用PCR关于PCR产品的大小和存在/不存在的结果为每个手术后胚胎分配基因型。例如,如果不同的等位基因需要生成不同大小的PCR产品,请使用大小信息为每个胚胎分配基因型。如果使用等位基因特异性引基,则应使用PCR产物是否存在/不存在的数据为每个胚胎分配基因型。
8. 根据基因型对胚胎进行分类。

结果

涅马托斯特拉基因组有一个单一的位点,编码神经肽GLW酰胺的前体蛋白。三个敲除突变的均位位基因在这个位子(glw-a,glw-b,和glw-c)之前已经报告5。四个携带野生型等位基因 ( + ) 和敲除等位基因的雄性在GLW 酰胺位位 ( 基因型 : + / glw^{- c}) 与携带野生型等位基因和不同敲除的杂音雌叉同?...

讨论

这里描述了一种基于PCR的协议,用于基因型单个海合明胚胎,而不牺牲动物。产卵和脱硫后,受精卵可以发育成胃卵。每个胃肠道胚胎的腹腔区域被手术切除,分离的腹腔组织用于后续基因组DNA提取,而剩余的手术后胚胎愈合并继续发育。然后,gDNA提取物用于PCR测定,以确定每个胚胎的基因型。该方法利用海葵胚胎的口腔半部分调节和发育10,11和大多数胚胎的能力(>90%)

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Peltier Refrigerated Incubator	Shellab	SRI6PF	Used for spawning induction
Instant ocean sea salt	Instant ocean	138510
Brine shrimp cysts	Aquatic Eco-Systems, Inc.	BS90
L-Cysteine Hydrochloride	Sigma Aldrich	C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500	VWR	89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0	QUALITY BIOLOGICAL	351-007-01
Potassium chloride	VWR	BDH9258
EDTA, 0.5M pH8	VWR	BDH7830-1
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Nonidet-P40 Substitute	US Biological	N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade	ThermoFisher	25530049
Agarose	VWR	710
Micro Dissecting needle holder	Roboz	RS-6060
Tungsten dissecting needle	Roboz	RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers	Eppendorf	E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530L
dNTP mix	New England BioLabs	N0447L
GLWamide universal forward primer			5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a			5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c			5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’