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摘要

介绍了制备和表征含中子、ph 响应的 siRNA 纳米粒子的物理化学特性和生物活性的方法。讨论了成功的 siRNA 纳米胺的标准, 如大小、形态、表面电荷、siRNA 负载和基因沉默。

摘要

SiRNA 作为靶向分子医学的成功取决于它对病理组织内细胞的有效细胞质传递。用 siRNA 治疗以前 "不可吸毒" 的肝病目标的临床成功已经取得。然而, 有效的肿瘤 siRNA 传递需要额外的药代动力学设计考虑, 包括长循环时间, 逃避清除器官 (如肝脏和肾脏), 以及肿瘤的渗透和保留。在这里, 我们描述了聚合物纳米粒子的制备和体外物理化学生物学特性, 设计用于高效 siRNA 传递, 特别是非肝组织, 如肿瘤。SiRNA 纳米颗粒是通过 siRNA 和多聚二块共聚物 (乙二醇-b-[2-(二甲基氨基) 甲基丙烯酸乙酯) (peg-db) (聚乙二醇-db) (聚乙二醇-db) 制备的聚离子复合物 ((即 siRNA 被隔离在多聚核中, PEG 形成亲水性、含中子电晕。此外, DB 阻滞成为膜溶解作为囊泡的内皮溶酶体途径酸化 (< pH 6.8), 触发内染色体逃逸和细胞质传递 siRNA。介绍了分析 siRNA 纳米粒子的大小、表面电荷、粒子形态和 siRNA 负载等物理化学特性的方法。以荧光素酶为模型基因, 测定了 siRNA 纳米粒子的生物活性, 并进行了快速、高通量的基因沉默检测。通过这些初步测试的设计 (如基于 Peg-dbs 的多指) 被认为适合转换为评估 siRNA 输送到肿瘤或其他病理部位的临床前动物研究。

引言

由于 sirna 抑制了蛋白质从 mrna 序列中的转化, 理论上可以用于药物治疗所有已知的疾病1,2,3,4,5。然而, sirna 在医学中的应用受到 sirna分子 6,7的综合不良药代动力学特性的限制。静脉注射时, sirna 通过肾脏迅速清除, 并被核酸酶8, 9 降解。由于其巨大的体积和负电荷, siRNA 不能进入细胞或逃避内皮溶酶体通路, 以访问存在于细胞溶胶 10,11,12中的 rna 诱导沉默复合体 (risc), 13岁因此, 广泛的努力集中在 siRNA 交付战略的设计和实施14。这项工作主要集中在开发基于脂质和聚合物的纳米粒子, 这些纳米颗粒包裹 sirna, 保护其免受体内清除和降解, 并通过可电离的阳离子胺基团启动细胞吸收和体内逃逸。临床前的许多成功已经报告, 最近, 第一个临床成功已报告纳米颗粒为基础的肝 siRNA 交付治疗遗传性转胸腺素介导 (hATTR) 淀粉样变 15.

目前有许多致癌基因被传统的药理学 (即小分子药物) "不能下药", 这些基因激励着聚合物 siRNA 纳米颗粒 (si-NPs) 的设计来治疗癌症16。然而, 对于非肝 siRNA 的传递, 必须考虑一组单独的设计参数。输送系统必须保护导致全身循环内的阳离子电荷17,18,19。具体而言, 对于肿瘤的传递, si-np 稳定性对于延长循环, 从而通过增强的渗透性和保留率 (epr) 效应20,21增加肿瘤内的积累是必不可少的。此外, 控制 si-NP 尺寸是必不可少的, 因为只有纳米颗粒直径约 20-200 nm 大小利用 EPR22, 和较小的 si-NP (~ 20–50 nm 直径) 表现出更好的肿瘤渗透比较大的纳米粒子和微粒子23。

为了解决这些额外的设计限制, 在静脉给药后的 siRNA 的系统肿瘤交付, 已经开发出了中电性强的、抗 ph 反应的 sinps (图 1)24。这些硅-nps 是聚乙二醇化的, 或最近的, Zwitter电离 25, 用于中性表面电荷和抗蛋白质吸附和在循环中的光氧化。由于他们不能仅仅依靠阳离子性质来驱动细胞内的传递, 非常有效的子宫内膜逃逸是实现强大的基因沉默的必要条件。因此, 这些 si-NPs 的核心是由一个高度内溶酶的核心, 在细胞外 pH 值 (7.4) 时是惰性的, 但在内索染色体通路的酸化条件下, 这种核心是以类似开关的方式触发的 [pH 6.8 (早期内生体)-5.0 (溶酶体)]。最后, 锡素核心中的阳离子和疏水含量的混合物提供静电和范德华稳定力, 与单纯的阳离子系统相比, 提高了血液中西诺的稳定性。

使用可逆加法-碎片链转移 (RAFT) 控制聚合来生产结构复杂、成分精确的聚合物, 可以将许多功能集成到相对简单的设计中。为了生产具有中性表面电荷、ph 响应能力和 NP 稳定性的硅-NP, RAFT 用于合成聚 (乙二醇-b-[2-[二甲基) 乙基甲基丙烯酸甲酯 (peg-db);图 1a)。PEG-DB 与 siRNA 静电络合, 形成具有 PEG 电晕和 Db/sirna 核的 Sip-nps (图 1b)。PEG 在 si-NP 日冕上形成一个惰性的、带电的亲水层。DB 块由50:50 摩尔比 2-(二甲基氨基) 甲基丙烯酸乙酯 (DMAEMA) 和甲基丙烯酸丁酯 (BMA) 组成。阳离子 DMAEMA 静电复合物负电荷 siRNA。BMA 自联内的 np 核心由范德华斯相互作用, 提高 NP 稳定性。DMAEMA 和 BMA 结合在一起, 将 ph 依赖性脂质双裂解行为传递给 db 聚合物块。在细胞外 pH 值时, DB 块被隔离到 si-NP 核, 并对脂质双层体惰性。在酸性条件下, 如在内皮酶体途径内, DB 块内的可电离 DMAEMA 促进了海绵上的原生质效应, 其中子宫内膜缓冲导致渗透肿胀和破裂26。此外, DB 块内的疏水 BMA 摩尔体积极整合和裂解脂质双层, 从而产生有效的内溶。因此, siRNA 与 PEG-DB 相结合, 形成在细胞外 pH 值时具有中子电荷和高度稳定的 sinps, 但在酸性 pH 值时会破坏脂质双层, 从而确保 siRNA 有效载荷的细胞质传递。

本文介绍了从 PEG-DB 中生产锡-Nps 的实验过程。提出并讨论了测定西-np 理化参数和生物活性的方法。为了快速评估 si-NP 的生物活性, 利用荧光素酶作为敲除研究的模型基因。萤火虫荧光素酶是导致萤火虫 "发光" 的蛋白质.因此, 用萤火虫荧光素酶基因转染的哺乳动物细胞产生一种生物发光 "辉光", 可以使用流量计来量化荧光酶表达水平。在这里, 我们使用荧光素酶来评估西 n 的生物活性, 通过传递 siRNA 来对抗荧光素酶, 并量化与接收拼接 sirna 的细胞相比, 荧光素表达细胞中生物发光的相应减少。

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研究方案

1. 西门子的制备和表征

  1. si-NP 制剂
    1. 将聚合物溶解在 10 mM 柠檬酸缓冲液 (pH 4.0) 中 3.33 mg/mL。聚合物可以首先在乙醇中的10倍浓度下溶解, 以确保溶解。
      注: 聚合物可以在较低的浓度下溶解, 但在浓度高于 3.33 Mg\ ml 的情况下使用可以防止均匀的 NP 形成。
    2. 加入 siRNA (直径为50μm), 使 n +:P-比率为 10.通过移液将聚合物和 siRNA 溶液彻底混合, 孵育30分钟。N+:P-比率表示聚合物上的正电荷胺基团的数量与 sirna 上的负电荷磷酸盐基团的数量, 并通过以下公式计算:
      figure-protocol-391
      其中, mol pol 是聚合物的摩尔量, RU 胺是每种聚合物的正电荷胺的重复单位数, mol siRNA 是 siRNA 的摩尔量, 而 bp siRNA 是每个 siRNA 分子的碱基对数。
    3. 加入5倍的过剩 10 mm 磷酸盐缓冲液 (pH 值 8.0), 通过移液或倒置管轻轻混合。为了确认最终的 pH 值是中性的 (~ 7.2-7.5), 将 sice-np 溶液的液滴10Μl 放在 pH 测试条上。
      注: 柠檬酸和磷酸盐缓冲液是根据米理多孔西格玛缓冲器参考中心图制备的。
  2. 硅-nps 的理化表征
  3. 使用动态光散射 (DLS) 记录产生的 sinps 的大小和表面电荷。通过将1毫升的 si-NPs (0.1–1.0 mg/mL) 通过0.45μm 孔大小的注射器过滤器过滤成方形石英或聚苯乙烯立方, 制备 DLS 样品。根据制造商的规格, 使用 DLS 仪器记录尺寸和表面电荷测量。
    1. 利用透射电子显微镜 (TEM) 进行成像分析, 确定 si-NPs 的大小和形态。
      1. 在 tem 栅格中加入5μl 的 si-NP 溶液, 孵育 60秒. 干3。
      2. 加入5μl 的3% 醋酸铀溶液, 孵育20秒干燥 3个月. 干燥后过夜。
      3. 根据为使用特定显微镜而建立的协议建立的图像网格。
    2. 利用琼脂糖凝胶阻滞法, 以不同的 N+:P比表征西 rna 在锡氮素中的负载。
      1. 在 pH 值8.0 时, 在 1X tae (醋酸-edta) 缓冲液中加入2克电泳级琼脂糖粉。搅拌暂停琼脂糖。微波中发现的热量, 直到所有琼脂糖溶解 (1-3分钟)。
      2. 冷却后, 加入5μl 溴化乙酯 (h2o 中的 10 mgml), 搅拌均匀。将琼脂糖倒进凝胶盘中, 放置梳子产生井, 让干燥 30分钟, 小心地取出梳子留下装载井, 用 1x tae 缓冲液将凝胶托盘填充到最大填充线。
      3. 在0、1、2、5、7、10、20和 40n +:P比率时生成 sin (根据上述程序)。将2μl 负载染料 (无 SDS 和还原剂) 放入每个 si-NP 配方的石蜡膜上。用移液器将10Μl 的 si-NP 溶液与加载染料混合在石蜡膜上。
      4. 在琼脂糖凝胶井中加入西-np加载染料溶液。在 100 V 处运行电压源 35分钟 (或直到样品穿过凝胶长度的 80%)。
      5. 根据制造商的规格, 在 UV 透射灯上可视化 sirna 带。

2. 西-np 的体外生物活性测定

  1. 模型基因荧光素酶的击倒
    1. 使用荧光素酶 siRNA 生成荧光素酶 si-NPs (根据上述程序), 并使用拼接 sirna 序列作为对照进行拼接。在相同的最终 N+:P比和琼脂糖凝胶阻滞研究确定的最佳比, formualte 都是 si-nps。示例 siRNA 序列包含在材料表中。
    2. 种子荧光素表达细胞 [Mda-mb-23er 路长酶 (Bsd) 稳定细胞] 在96孔的黑壁板上, 密度为每口 2, 000 细胞。允许在孵化器 (37°C, 5% CO 2, 95% 湿度) 中全介质 (DMEM, 10% FBS) 过夜.
    3. 将 si-NPs 稀释到完整的血清培养基中, 最终体积为每口 100μl, siRNA 浓度为 100 nM。用 si-NPs 治疗24小时细胞。
    4. 24小时后, 取出治疗, 用含有 150μgml d-荧光素的完整血清介质取代培养基。在根据制造商的规格测量板式读取器或体内光学成像系统上的发光之前, 对细胞进行5分钟的孵化。
    5. 将含荧光素的培养基更换为新鲜的、完整的血清培养基, 再孵育24小时。重复上述步骤, 去除培养基, 用含有 150μgml d-荧光素的全血清介质取代, 然后在48小时测量48小时的时间点上的发光时间前进行5分钟的孵育。
    6. 对于纵向研究, 在测量发光时, 在无菌条件下保持细胞。更换含荧光素后, 在测量之间继续在新鲜、完整的介质中培养。
      注: 适当的 siRNA 浓度会因不同的 sinp 和 siRNA 分子而异。当使用具有共锁溶解核 (例如 PEG-DB) 的中压多管时, 100 nM 通常能被细胞耐受性良好, 并产生 & gt;75% 的荧光素酶敲除。PEG-DB 与 Sirna 在 10n +:P 和100 nm sirna 处理 (假设为 26 bp sirna) 下的质量比率为 23.3, 即每 1.0 ng sirna 添加 23.3 ng peg-db。例如, 在96孔板 (每口100毫升介质体积) 中, 为 166.5 ng 的 siRNA 添加1.16μl 的 3.33 Mg/ml 聚合物, 以在 100 nm 的水平上处理一口井。

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结果

有效的 sinp 在体内 Srna 传递的一些基本特征是适当的大小 (约 20-200 nm 直径)、siRNA 包装和基因沉默的生物活性。虽然这不是一个详尽无遗的清单 (如讨论中所述), 但在考虑进一步测试某一提法之前, 应确认这些基本特征。

图 2说明了在配方时 si-NP 尺寸和表面电荷的特性。DLS 和 TEM 被用作观察 si-NP 尺寸 (两?...

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讨论

这里描述的硅-nps 是由阴离子 siRNA 和阳离子聚合物与聚离子复合物 (聚多层) 的静电结合而成的。PEG-DB 聚合物的静态络合促进了 Peg-db 聚合物的阳离子复合 (4.0)。在 pH 值4.0 时, DMAEMA 具有很高的质子化作用, 因此 DB 块的电脉冲很高。这确保了聚合物作为 unimers 溶解在溶液中, 而不是形成胶束, 并且数据库复合体高效率地与 siRNA。随后, 溶液的 pH 值调整为中性 (pH 7.4), 导致 DB 块的 "疏水化"、胶束的形成...

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披露声明

作者没有透露潜在的利益冲突。

致谢

作者感谢 Craig Duvall 博士和 Rebecca Cook 博士为开展这项研究提供了数据和实验室资源。作者感谢 Vanderbilt 纳米科学与工程研究所 (VINSE) 获得 DLS 和 TEM (NSF EPS 1004083) 仪器。作者感谢国家科学基金会支持研究生研究奖学金计划 (NSF#1445197)。提交人感谢国家卫生研究院的财政支持 (NIH R01 EB019409)。提交人感谢国防部国会指导医学研究计划提供的财政支持 (DOD CDMRP OR130302)。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm pore-size syringe filtersThermo Fisher ScientificF2513317 mm diameter, PTFE membrane
0-14 pH test stripsMillipore SigmaP4786
10x TAE bufferThermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7.7 pH test stripsMillipore SigmaP3536
96-well black walled platesCorning3603Tissue-culture treated
Agarose PowderThermo Fisher Scientific/Invitrogen16500
Citric acid monohydrateMillipore SigmaC1909
dibasic sodium phosphate dihydrateMillipore Sigma71643
D-luciferinThermo Fisher Scientific88294Monopotassium Salt
DMEMGibco11995065High glucose and pyruvate
EthanolMillipore Sigma459836
ethidium bromideThermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
FBSGibco26140079
loading dyeThermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
Luciferase siRNAIDTN/AAntisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cellsGenTarget IncSC059-BsdLuciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity
monobasic sodium phosphate monohydrateMillipore SigmaS9638
Scarmbled siRNAIDTN/AAntisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *DNA bases
square polystyrene cuvettesFisher Scientific14-955-1294.5 mL capacity
TEM gridsTed Pella, Inc.1GC50PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper
Trisodium citrate dihydrateMillipore SigmaS1804
uranyl acetatePolysciences, Inc.21447-25

参考文献

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