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摘要

紧密聚焦的飞秒激光可以结合到共聚焦显微镜中,从而对细胞提供精确的刺激,从而实现实时观察和光刺激。光刺激可以激活细胞分子事件,包括ERK信号通路和反应氧物种的线粒体闪光。

摘要

直接控制细胞定义的分子事件对生命科学很重要。最近,研究表明,飞秒激光刺激可以同时激活多个细胞分子信号通路。在此协议中,我们表明,通过将飞秒激光耦合到共聚焦显微镜中,通过紧密聚焦的激光可以精确刺激细胞。一些可以同时观察到的分子过程随后被激活。我们提出了光刺激的详细方案,以激活Hela细胞中的细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路。如果将飞秒激光脉冲聚焦到特定的线粒体管状结构上,也可以刺激活性氧物种 (ROS) 和其他线粒体事件的线粒体闪光。该协议包括光刺激前对细胞进行预处理,通过飞秒激光照射到靶上进行光刺激,以及观察/识别随后的分子变化。该协议是相关生物研究的全光学工具。

引言

控制细胞信号分子的技术是生命科学发展的重要组成部分。传统上,最常用的方法是用药物或生物材料1、2、3进行生化处理。在过去的十年里,光遗传学的发明开启了细胞分子信号调制的新时代。基因工程对光敏感蛋白的转染使光成为调节靶细胞中各种蛋白质活性的有力工具。该技术取得了令人鼓舞的进展,如激发和抑制神经信号,促进基因表达,操纵细胞信号模式,导致不同的细胞命运和病理调查4,5 ,6,7,8,9.然而,光只能通过用光遗传蛋白转染细胞来工作。在现阶段,除了光遗传学之外,还有一种罕见的使光能够直接控制细胞分子的方法。

飞秒激光在保持良好生物安全性的同时,通过提供高效的多光子激发,在生物学方面具有先进的生物学研究。通过部署多种光处理策略,它取得了多光子显微镜、微手术和多光子光遗传学应用10、11、12、13等多项成果。 ,14,15,16.近期的研究表明,飞秒激光刺激已被证明是直接诱发分子信号事件的一种高效光学方法。研究发现,对内质视网膜(ER)的紧聚焦飞秒激光照射能够耗尽ER中的钙,并激活钙释放活性钙(CRAC)通道,在细胞17中形成钙信号。这种光激活的钙信号可以在多种类型的细胞之间传播18,19,20。此外,它还能够激活细胞信号通路,如激活T细胞(NFAT)的核因子和ERK信号通路21,22。通过调整细胞中飞秒激光照射的强度和定位,例如,将激光聚焦在线粒体上,可以影响线粒体形态和分子事件23、24 25.具体来说,线粒体ROS的突发可以通过光刺激激发,光刺激被称为线粒体(线粒体)中的荧光闪烁。

因此,光刺激技术在相关生物研究中具有广泛的应用潜力。这也是一个扩大飞秒激光应用在控制细胞信号分子和功能,除了显微镜的好机会。在这里,我们提供光刺激的技术细节。光刺激是通过将飞秒激光耦合到共聚焦显微镜来实现的,从而提供具有短闪光光刺激的单靶细胞。它可以在细胞中启动高效且可控的 ERK 激活。如果光刺激位于线粒体管状结构上,线粒体膜电位、形态、ROS和渗透性过渡孔隙,都可以由光刺激控制。基于该光刺激方案,我们提供了激活ERK信号通路和影响Hela细胞中多个线粒体事件的详细方法。该协议阐明了向目标细胞提供飞秒激光刺激的过程。

光刺激系统建立在共聚焦显微镜上,带有飞秒激光耦合,可同时进行刺激和连续显微镜。飞秒激光(波长:1,040 nm,重复率:50 MHz,脉冲宽度:120 fs,最大输出平均功率:1 W)在耦合前被分成两个光束。其中一个通过由一对透镜组成的中继望远镜进行引导。然后,它直接反射到目标的后孔径(60x,N.A. = 1.2,水浸)中,形成衍射极限聚焦(Stim-A)。另一种被反射到共聚焦显微镜的扫描光学路径上,作为双光子扫描模式(Stim-B)工作。Stim-A 在视场中心 (FOV) 中显示一个固定焦点。Stim-B 是 FOV 中预先设计的部分共聚焦扫描区域。如图1A所示,显示了 Stim-A 和 Stim-B。二色镜 (DM) 下的 CCD 摄像机提供明场成像,用于监控飞秒激光对焦。

以下实验有一些关键要点。在此协议中,使用飞秒光纤激光源(1040 nm、50 MHz、120 fs)作为示例。在实践中,大多数商用飞秒振荡器可以使用,只要脉冲宽度短于200fs,峰值功率密度应高于10 11~1012 W/cm 2的水平。例如,通常用于多光子显微镜的 Ti: 蓝宝石激光能够取代图 1B所示的飞秒激光。激光功率和其他一些光刺激参数需要调整,因为光学参数(脉冲宽度、波长和重复率)在不同的飞秒激光器中变化很大,从而产生不同的多光子激发效率。

与飞秒激光刺激一起,共聚焦显微镜提供连续细胞成像,以Stim-A和Stim-B模式实时监测分子动力学。两种光刺激方案(Stim-A 和 Stim-B)均由具有毫秒分辨率的机械快门控制(图 1)。

在Stim-A模式下,激光对焦的位置固定在FOV的中心。继电器望远镜用于通过调整垂直方向的两个透镜之间的距离(激光传播方向,垂直到共聚焦成像平面,如图 1.通过CCD相机的明场成像,可以测量激光对焦的直径(+2μm,图2B)。刺激持续时间和曝光时间在共聚焦成像过程中由快门控制。

在 Stim-B 模式下,刺激区域可以在共聚焦成像控制软件中手动预分配给任何形式,如直线、多边形或圆。快门与共聚焦扫描过程同步。它在通过共聚焦成像控制软件设置的预设计时间打开。然后,用飞秒激光扫描刺激区域作为共聚焦显微镜。因此,当共聚焦扫描过程进入给定的成像帧时,只有飞秒激光刺激样品。

根据实验对象,可在倒置和直立冶金显微镜上建立光刺激系统。培养在培养皿中的体外细胞更适合倒置显微镜。动物,特别是活体动物的大脑,更适合使用直立显微镜。在这项研究中,我们以倒置显微镜为例。需要注意的是,在整个实验过程中,培养皿的盖子没有打开。

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研究方案

警告:下面介绍的协议涉及使用近红外飞秒激光和有毒化学品。请注意实验程序引起的所有可能的损害。使用前请阅读所有相关化学品或其他材料的安全数据表。在操作激光源之前,请遵循激光设施的安全说明或咨询专业人士的指导。

1. 实验准备

  1. 设置光刺激系统
    注:该系统由飞秒激光和激光(荧光激发的可见范围)扫描共聚焦显微镜组成。在图1中,光纤飞秒激光器(1,040 nm、50 MHz、120 fs、1 W)用于耦合。参数不是固定的或必要的。它可以被 TI: 蓝宝石激光器或 NIR 范围内的其他商用飞秒振荡器所取代。
    1. 调谐在飞秒激光和共聚焦显微镜上。
      注:在调整光路的过程中,请将飞秒激光功率设置为低电平(±50 mW)。
    2. 使用反射镜(图1B所示的RM1和RM2)通过机械快门引导飞秒激光束。打开快门。
    3. 设置 50/50 光束分路器(BS,图 1B),将飞秒激光束拆分为两个独立的光束(传输光束和反射光束)。引导RM2和BS,使飞秒激光束与扫描激光束重合。
      注:(1) 长通二色镜(DM,700nm切入波长,图1B)后面的参考虹膜(虹膜1,图1B)用于定位扫描激光路径。(2) 系统只能在 Stim-A 或 Stim-B 模式下分别工作。对于 Stim-A 模式,可以删除 BS。对于 Stim-B,BS 可以替换为 RM。
    4. 设置由一对透镜组成的中继望远镜,以扩大透射光束宽度,该宽度与目标的后孔组成。
      注:(1) 参考虹膜2和3(图1B)被设置为对飞秒激光束进行准直合(图1B)。(2) 中继望远镜的放大倍数取决于飞秒激光束的原始直径和目标的后孔径。
    5. 引导 RM (RM 3-5,图 1B) 将膨胀的光束对准显微镜。引导 RM 4 和 RM 5,将飞秒激光对焦调谐到 FOV 中心。
    6. 测量飞秒激光目标的传输效率。
      注:由于这两种模式下激光的穿透路径不同,请分别测量Stim-A和Stim-B的激光功率。它将使用样本中的力量来说明下面的相关实验过程。
    7. 调谐快门,飞秒激光和共聚焦显微镜,直到实验开始。
      注:在下面的实验中,Stim-A 和 Stim-B 不协同工作。如果使用 Stim-A,则需要阻止 Stim-B 的飞秒激光束。另一方面,如果系统在 Stim-B 模式下工作,则应阻止 Stim-A 的光束。
  2. 制备培养基:Dulbeco的改性鹰培养基(DMEM)高葡萄糖与10%胎儿牛血清(FBS)。
  3. 制备ERK2-GFP DNA质粒、Mito-GFP DNA质粒和线粒体基质靶向循环渗透黄色荧光蛋白(mt-cpYFP)DNA质粒。将质粒保持在-20°C,直到使用。
  4. 制备四甲基氨基胺(TMRM,100 μM)和聚乙烯胺(PEI 1mg/mL)。将它们保持在-20°C,直到使用。
  5. 制备5%甲醛,0.5%Triton X-100,抗eIF4E(真核转化起始因子4E),抗体(磷S209,1mg/mL),抗巴克斯抗体(1毫克/升),抗细胞色素C抗体(1毫克/升,二次抗体(抗兔IG H&L,Alexa 氟 488,1 毫克/mL),和 1% BSA 与 0.1% Tween20。将这些试剂保持在4°C,直到使用。
  6. 准备无菌材料:细胞培养瓶、带玻璃滑动底的培养皿(图3A)、带玻璃底的培养皿、印有500μm的细胞位置网格(图3B,用于定位光刺激细胞)、1.5 mL和10 mL管,以及1mL、100 μL 和 10 μL 移液器和吸头。
  7. 制备标准细胞培养实验室设备:一个细胞培养培养培养室,设定在5%CO2和37°C,以及一个生物安全柜。

2. 细胞培养和转染

注:Hela细胞(从1951年2月8日从Henrietta Lacks中提取的子宫颈癌细胞中提取的细胞系)26作为本协议中的例子。

  1. 细胞通道
    1. 从含有足够细胞的细胞培养瓶中取出培养基。
    2. 用2 mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗瓶子。拆下 PBS。
    3. 缓慢加入1 mL的胰蛋白酶,然后轻轻敲击瓶子。将瓶子放回培养箱中,在37°C下孵育细胞3分钟。
    4. 取出胰蛋白酶。添加 2-3 mL 的培养基。多次移液介质以帮助细胞分离。将带细胞的介质转移到 10 mL 管中。
    5. 从管中抽取10μL的样品进行细胞计数。
    6. 种子 +25,000 细胞放入培养皿 (图 3A),并添加培养基高达 1 mL.
    7. 将培养皿中含有的细胞放回培养箱中。在转染前,在37°C下孵育细胞24小时。
  2. 细胞转染
    1. 使用0.5 μg的DNA质粒(ERK2-GFP,Mito-GFP或mt-cpYFP)进行每盘转染。在1.5 mL管中加入0.5μg质粒和2.5μgPEI至50μL的DMEM中。在室温下孵育混合介质10分钟。
    2. 从培养箱中拿出细胞。将培养基用 1 mL 的 DMEM 替换。
    3. 将DNA/PEI混合培养成一滴一滴的细胞。将细胞放回培养箱中。
    4. 在37°C下孵育细胞3小时,用1mL培养基取代DMEM DNA/PEI混合培养基。
    5. 在光刺激实验前,在37°C下孵育转染细胞24小时。

3. 通过飞秒激光的光刺激激活ERK2

  1. 打开飞秒激光并确保快门关闭。
  2. 打开激光扫描共聚焦显微镜并打开显微镜软件。将激励激光设置为 488 nm。将 488 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素。将每个像素的间隔时间设置为 2.4 μs。将两帧之间的间隔时间设置为 6 秒,以尽量减少光漂白和对细胞的光损伤。将总成像帧设置为大约 300 帧,在单个实验中提供 ±30 分钟的连续显微镜。
    注:可根据实验要求调整两个相邻帧的间隔、总成像帧和连续显微镜的成像时间。如果单个实验持续超过 2 小时,请将第 3.3 步中的显微镜 CO2 孵育系统(如图 4所示)设置为提供 5% CO2和 37 °C 的环境,以保持细胞活力。如果单个实验限制在 2 小时内,则不需要CO2孵育系统。
  3. 打开 CO2孵育系统,打开所有加热器,并将工作温度设置为 37°C。等待温度达到37°C,CO2浓度达到5%。将培养箱阶段放在显微镜舞台上,如图4A所示。
  4. 如步骤 2 所述,制备用ERK2-GFP转染的希拉细胞。
    注:在单个实验中,应用Stim-A或Stim-B方案向细胞提供光刺激。步骤 3.5 和 3.6 分别介绍了 Stim-A 和 Stim-B 下的详细步骤。
  5. 使用 Stim-A 模式向目标细胞提供飞秒激光刺激
    注:在光刺激程序之前,请确保对焦的直径约为2μm。步骤 3.5.1 和 3.5.2 中介绍了此过程。
    1. 从培养箱中取用ERK2-GFP转染的含有细胞的培养皿,并将该菜放在显微镜台上。
    2. 通过显微镜操作软件启动快速扫描模式。调整目标以获得细胞的清晰荧光图像。停止快速扫描。由 CCD 相机切换到亮场成像模式 (图 2A)。打开快门并调整继电器望远镜两个透镜之间的距离,以确保飞秒激光对焦的直径为 ±2 μm(图 2B)。关闭快门以完成调整。
      注:可以标记参考箭头以指示激光对焦 (图2)。同时,还可以在荧光成像窗口的中心设置参考箭头,以指示飞秒激光对焦的位置。
    3. 将飞秒激光的功率设置为 15-40 mW(810 nm、65 fs、80 MHz)或 20-60 mW(1040 nm、120 fs、50 MHz)的试样。将快门的打开时间设置为 0.05-0.2 s。
    4. 使用快速扫描模式选择目标细胞,该细胞表达良好 ERK2-GFP。
    5. 移动舞台,以便在CCD相机的明亮场成像下定位FOV中心选定目标细胞的细胞溶剂区域(图2A)。
    6. 单击"开始底部"以开始连续显微镜成像进度。
    7. 在任何预定义的时隙打开快门,将步骤 3.5.3 中设计的飞秒激光刺激传递到目标单元。
      注:(1) 光刺激可以在由快门控制的共聚焦显微镜序列中随时执行。(2) 光刺激可以在共聚焦显微镜序列期间在同一位置多次传递。
    8. 等待,直到成像过程完成。保存成像数据以进行进一步的数据分析。
  6. 使用 Stim-B 模式向目标细胞提供飞秒激光刺激
    1. 将飞秒激光的功率设置为 15-40 mW(810 nm),在试样处设置 20-60 mW(1040 nm)。
    2. 从培养箱中取用ERK2-GFP转染的含有细胞的培养皿,并将其放在显微镜台上。
    3. 使用快速扫描模式选择目标细胞,该细胞表达良好 ERK2-GFP。
    4. 将共聚焦成像过程设置为步骤 3.2。将特殊扫描帧定义为成像过程中的刺激帧。定义模拟帧的参数。
      1. 在靠近目标细胞细胞核的细胞溶胶区域设置扫描区域(2 x 2-3 x 3 μm2)。
      2. 将总扫描时间设置为 0.1-0.2 秒。根据预定义的光刺激区域将飞秒激光快门与共聚焦扫描同步,该区域仅在激光扫描落在刺激帧中时打开,并在激光扫描停止时立即关闭走出去。
        注:(1) 光斑区域可设置为任意大小。(2) 光刺激可以在共聚焦显微镜序列中的任何预定义时隙进行。(3) 光刺激可以在该共聚焦显微镜序列中的FOV中相同或不同的预定义区域进行多次。
    5. 单击"开始底部"以开始连续显微镜成像进度。
    6. 等待,直到成像过程完成。保存成像数据以进行进一步的数据分析。
  7. 实验后,关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。

4. 通过倍秒激光模拟激活eIF4E(ERK基板)

  1. 赫拉细胞制剂
    1. 按照步骤 2.1.1-2.1.5 操作。
    2. 将+20,000个细胞种子放入具有细胞位置网格的培养皿中(图3B),以定位光刺激细胞。添加培养介质,高达 1 mL。
    3. 将带细胞的盘子放回培养箱中。在飞秒激光治疗之前,在37°C下孵育细胞24小时。
  2. 打开飞秒激光并确保快门关闭。
  3. 打开激光扫描共聚焦显微镜并打开显微镜软件。
  4. 作为步骤 3.3 中的陈述,准备 CO2孵育系统。
  5. 使用 Stim-A 模式向目标细胞提供飞秒激光刺激
    1. 将飞秒激光的功率设置为 15-40 mW(810 nm),在试样处设置 20-60 mW(1,040 nm)。将快门的打开时间设置为 0.05-0.2 s。
    2. 从培养箱中取取带细胞的培养皿,并将其安装在显微镜的舞台上的CO2培养箱中。
    3. 在CCD相机的明场成像下以垂直方向移动目标以定位成像平面。以水平方向移动试样阶段,以确保没有细胞位于 FOV 中心。打开快门并调整继电器望远镜两个透镜之间的距离,以确保以 ±2 μm 为单位的飞秒激光对焦直径。关闭快门以完成调整。
    4. 移动显微镜阶段以随机选择 5~10 个网格。在CCD相机的明亮场成像下,通过培养皿底部的网格来指示和本地化。标记/记录盘中选定网格的坐标。
    5. 在 CCD 相机的明亮场成像下,手动刺激选定网格中的所有单元。
  6. 把盘子放回孵化器里。在免疫荧光显微镜前,在37°C下孵育细胞24小时。在拍照程序后,关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。
  7. 具有光刺激的细胞中磷酸化eIF4E的免疫荧光显微镜,用于确认ERK活化
    1. 将含有光刺激治疗的细胞的培养皿从培养箱中拿出来。删除培养基。用PBS清洗一次细胞。删除 PBS。
    2. 在盘中加入1 mL的5%甲醛(4°C)。用5%的甲醛固定细胞10分钟,取出甲醛缓冲液。用PBS清洗细胞5分钟两次。删除 PBS。
    3. 在菜中加入 1 mL 的 0.5% Triton X-100。在室温下孵育细胞15分钟。拆下 Triton X-100 缓冲液。用PBS清洗细胞5分钟两次。删除 PBS。
    4. 在盘中加入 1 mL 的 1% BSA 缓冲液。在室温下孵育细胞30分钟。卸下 BSA 缓冲区。
    5. 在1mL的PBS中稀释抗eIF4E抗体(磷S209),1%BSA,最终浓度为1μg/mL。将缓冲液加入盘中。在4°C下孵育细胞10-12小时。删除缓冲区。
    6. 用PBS清洗细胞5分钟两次。删除 PBS。
    7. 用1%BSA稀释PBS1 mL中的二级抗体抗兔子IgG H&L,最终浓度为2微克/mL。将缓冲液加入盘中。在室温下孵育细胞2小时。删除缓冲区。
    8. 用PBS清洗细胞。删除 PBS。
    9. 在盘中加入 1 mL 的 PBS。
    10. 打开激光扫描共聚焦显微镜。打开显微镜软件。将激励激光设置为 488 nm。将 488 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素。将每个像素的间隔时间设置为 2.4 μs。
    11. 将带有免疫荧光染色细胞的盘子放在显微镜台上。在 CCD 相机的明亮场成像下找到所选框。
    12. 开始单帧共聚焦扫描。保存光刺激细胞的荧光图片。
    13. 随机移动舞台以定位没有飞秒激光刺激的区域。开始单帧共聚焦扫描。保存无刺激细胞的荧光图片作为控制数据。
  8. 实验后关闭共聚焦显微镜。

5. 通过光刺激激活线粒体事件和其他线粒体事件

注:为了观察线粒体形态动力学,在步骤5.1中用Mito-GFP转染Hela细胞,以荧光表示线粒体。为了观察线闪光,在步骤5.1中用mt-cpYFP转染Hela细胞。

  1. 按照步骤2,准备用Mito-GFP或mt-cpYFP转染的希拉细胞。
  2. 打开飞秒激光并确保快门关闭。
  3. 打开激光扫描共聚焦显微镜。将激励激光设置为 488 nm。将 488 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素。将每帧的总成像时间设置为 2.2 s。将两帧之间的间隔时间设置为 0 s。将总成像帧设置为 200 帧,以在单个实验中提供 ±440 s 的连续显微镜。
    注:可根据实验要求调整两个相邻帧的间隔、总成像帧和连续显微镜的成像时间。
  4. 如果需要,请按照步骤 3.3 中所述准备 CO2孵育系统。
  5. 使用 Stim-A 模式将飞秒激光刺激传递到目标线粒体
    1. 从培养箱中取用Mito-GFP或mt-cpYFP转染的含有细胞的培养皿,并将该菜放在显微镜台上。
    2. 检查飞秒激光的状态,作为步骤 3.5.2。确保飞秒激光的对焦位于 FOV 中心。在荧光成像窗口的中心设置参考箭头以指示焦点的位置。
    3. 将飞秒激光的功率设置为 5-30 mW(810 nm),在试样处设置 10-40 mW(1040 nm)。将快门的打开时间设置为 0.05-0.1 s。
    4. 使用快速扫描模式选择目标细胞,该细胞表达良好 Mito-GFP 或 mt-cpYFP。
    5. 在靶细胞中随机选择一个线粒体作为实验对象。移动显微镜阶段,以便通过快速扫描模式定位 FOV 中心的目标线粒体管状结构(通过参考箭头指示)。
    6. 单击"开始底部"以开始连续显微镜成像进度。
    7. 在任何预定义时间打开快门,将步骤 5.5.3 中设计的飞秒激光刺激传递到目标线粒体管状结构中。
      注:(1) 线粒体管状结构上的飞秒激光照射可在共聚焦显微镜期间随时由快门控制。(2) 在一个实验中只进行一次飞秒激光照射,因为一个飞秒激光刺激可能会长期干扰线粒体状态。
    8. 等待,直到成像过程完成。保存成像数据以进行进一步的数据分析。
  6. 实验后,关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。

6. 乘月激光刺激对希拉细胞中靶线粒体细胞的线粒体膜电位振荡

  1. 按照步骤 2.1.1-2.1.6 准备希拉细胞。
  2. 在实验前,在37°C下孵育细胞24小时。
  3. 制备 TMRM 染色溶液:用 10% FBS 将 TMRM 稀释到 1 mL 的 DMEM 中,最终浓度为 100 nM。
  4. 将步骤 5.2.1 和 5.2.2 中制备的细胞从培养箱中取走。删除培养基。将步骤 6.3 中制备的 TMRM 染色溶液添加到盘中。在培养箱中37°C下染色15-20分钟。去除染色溶液。用PBS清洗一次细胞。在菜中加入1mL的培养基。
  5. 打开飞秒激光并确保快门关闭。
  6. 打开激光扫描共聚焦显微镜。打开显微镜软件。将激励激光设置为 532 nm。将 532 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素,帧生成时间设置为 2.2 s。将两帧之间的间隔时间设置为 0 s。将总成像帧设置为 200 帧,以在单个实验中提供 ±440 s 的连续显微镜。
    注:可根据实验要求调整两个相邻帧的间隔、总成像帧和连续显微镜的成像时间。
  7. 如果需要,准备步骤 3.3 中描述的 CO2孵育系统。
  8. 使用 Stim-A 模式将飞秒激光刺激传递到目标线粒体。按照步骤 5.5.1-5.5.8 完成实验。
    注:在步骤 6.8 中,选择一个与 TMRM 很好地染色的线粒体作为目标线粒体。
  9. 实验后,关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。

7. 通过倍秒激光刺激,在希拉细胞中靶线粒体上发生巴克斯和细胞色素C的变化

注:在这个实验中,用细胞位置网格(图3B)在培养皿中播种细胞,以定位由飞秒激光处理的细胞。用TMRM染色细胞,以本地化被选择由飞秒激光刺激的线粒体。

  1. 如步骤 4.1 所述,在具有细胞位置网格的培养皿中制备 Hela 细胞(图 3B)。
  2. 如步骤 6.3 和 6.4 所述,使用 TMRM 染色细胞。
  3. 打开飞秒激光并确保快门关闭。
  4. 打开激光扫描共聚焦显微镜。打开显微镜软件。将激励激光设置为 532 nm。将 532 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素,帧生成时间设置为 2.2 s。将两帧之间的间隔时间设置为 0 s。将总成像帧设置为 50 帧,以在单个实验中提供 ±110 s 的连续显微镜。
  5. 使用 Stim-A 模式将飞秒激光刺激传递到目标线粒体
    1. 将飞秒激光的功率设置为 5-30 mW(810 nm),在试样处设置 10-40 mW(1040 nm)。将快门的打开时间设置为 0.05-0.1 s。
    2. 从培养箱中取取含有染色细胞的培养皿,并将盘子放在显微镜台上。
    3. 使用快速扫描模式选择与 TMRM 沾染良好的目标细胞。
    4. 移动舞台,以便使用快速扫描模式定位 FOV 中心的目标线粒体管状结构。标记所选像元在亮场成像下所在的网格的坐标。
    5. 单击"开始底部"以开始连续显微镜成像进度。
    6. 在显微镜成像进度的任何预定义时间打开快门,将步骤 7.5.1 中设计的飞秒激光刺激传递到目标线粒体管状结构中。
    7. 等待,直到成像过程完成。标记由飞秒激光模拟的所选线粒体。保存成像数据以进行进一步的数据分析。
    8. 实验后,关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。在实验细胞上制备Bax或细胞色素C的免疫荧光显微镜。
  6. Bax 或细胞色素 C在飞秒激光治疗线粒体。
    1. 从显微镜阶段拿出盘子。
    2. 完全免疫荧光染色的Bax或细胞色素C遵循步骤4.7.1-4.7.9。
      注:在步骤 4.7.5 中使用抗 Bax 或抗细胞色素 C 代替抗 eIF4E,完成步骤 7.6.2 中 Bax 或细胞色素 C 的免疫荧光染色。
    3. 打开激光扫描共聚焦显微镜并打开显微镜软件。将激励激光设置为 488 nm 和 532 nm。将 488 nm 和 532 nm 激光的功率电平设置为 0.1 mW。将成像大小设置为 512 x 512 像素,将帧生成时间设置为 2.2 s。
    4. 将带有免疫荧光染色细胞的盘子放在显微镜台上。在 CCD 相机的明亮场成像下找到所选网格。找到由飞秒激光处理的细胞。
    5. 开始单帧共聚焦扫描。定位由飞秒激光刺激的线粒体。保存光刺激细胞的荧光图片,以便进一步数据分析。
  7. 实验后关闭共聚焦显微镜。

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结果

光刺激可以同时进行连续共聚焦扫描显微镜。光刺激可以从延时共聚焦显微镜序列中的任何预定义的时隙开始。共聚焦显微镜可以通过荧光成像监测细胞分子。光刺激和其他动力学的分子反应可以这样识别。从理论上讲,如果ERK被激活,它将从细胞质磷酸化移动到细胞核27。特定的细胞命运可以由这个ERK信号28的某些模式调节。在最近的研?...

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讨论

我们将飞秒激光与激光扫描共聚焦显微镜系统相结合,演示了光刺激策略。光刺激可以通过相应地定义Stim-B直接作为双光子显微镜。我们提供了一个详细的协议,利用短闪光的飞秒激光触发ERK信号或线闪光的目标细胞。不同的刺激模式可以根据不同的实验目的和系统进行。基于共聚焦显微镜可轻松设置 Stim-A。飞秒激光可以在FOV中心的衍射极限水平聚焦。亚细胞目标需要手动移动到飞秒激光对焦位置,...

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披露声明

作者声明没有相互竞争的利益。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金(81571719和81661168014、81673014、81870055)、上海市科学技术委员会(18QA1402300和16XD1403100)和国家重点研发计划(2017YFA01046000)的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Inverted microscopeOlympus
Femtosecond laserFianium
CO2 incubation systemOlympusMIU-IBC
Petri dishNEST801002
Petri dish with imprinted gridIbidi81148
ERK-GFPaddgene37145A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFPA gift from Heping Cheng's lab
mito-GFPInvitrogenC10508
Tetramethylrhodamine (TMRM)InvitrogenT668Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI)Sigma-Aldrich9002-98-6Dilute in PBS
ParaformaldehydeSolarbioP8430Dilute in PBS
Triton X-100SolarbioT8200Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8Dilute in PBS
Tween20Sigma-Aldrich9005-64-5
anti-eIF4E antibodyabcamab76256
anti-Bax antibodyabcamab53154
anti-cytochrome C antibodyabcamab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488)abcamab150077

参考文献

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