以血管内炎组织调节为重点, 利用肠系膜孤立动脉评价血管张力

摘要

该协议描述了使用线状成像来评估从小鼠分离肠系膜动脉的神经间等距张力, 特别考虑的是内皮细胞和血管周围脂肪组织释放的因素的调节。

摘要

血管张力改变对病理生理刺激的反应有助于广泛的心血管和代谢疾病的发展。内皮功能障碍是减少血管舒张和增强动脉血管收缩的主要元凶。动脉周围的脂肪组织在调节血管平滑肌细胞内皮依赖性松弛和/或收缩方面发挥着重要作用。内皮和血管周围脂肪组织之间的交叉谈话可以通过线断层成像系统在体内使用安装的血管进行评估。然而, 应建立从不同物种、年龄、遗传背景和/或病理生理条件的动物中获得的动脉的最佳设置。

引言

动脉扩张和收缩分别是通过血管平滑肌细胞的松弛和收缩来实现的。小动脉血管反应性的变化有助于自主神经和血液中存在的激素 (如儿茶酚胺、血管紧张素 II.、血清素、加压素) 对动脉血压的稳态调节。在局部一级, 平滑肌细胞的血管反应被来自内膜内皮细胞和动脉周围脂肪组织的信号所调节 (图 1)。

内皮不仅是一个被动屏障, 而且还作为一个表面, 以交换血液和潜在的血管平滑肌细胞之间的信号。通过释放各种血管活性物质, 内皮细胞在血管张力反应1的局部控制^中起着至关重要的作用。例如, 在对乙酰胆碱的反应中, 内皮一氧化氮合酶 (eNOS) 在内皮细胞中被激活, 产生一氧化氮 (NO), 通过激活可溶性利尼环化酶 (sGC)^{诱导下血管平滑肌的松弛。2}. 其他血管活性物质包括环氧合酶 (如前列腺素和血栓素 a₂₎、脂氧合酶 (如 12-羟基磷酸四烯酸、12-hete) 和细胞色素 p450 单胞酶 (hetes 和环氧血尿酸、Eet)、活性氧种类 (ros) 和血管活性肽 (如内皮素-1 和血管紧张素 II.) 和内皮衍生的超极化因子 (EDHF)³。内皮衍生血管扩张剂和血管收缩剂之间的微妙平衡保持局部血管运动张力^4,5。

内皮功能障碍的特点是内皮依赖性血管舒张6的损伤, 血管老化的标志 7.随着年龄的发展, 内皮促进血管舒张的能力逐渐降低, 主要原因是 NO 生物利用度下降, 以及血管平滑肌细胞内皮细胞和 sGC 中 eNOS 的异常表达和功能^8,9,10. no 的生物利用度降低, 可促进内皮依赖性血管收缩剂^11,12的产生。在老年动脉中, 内皮功能障碍会导致介质增生, 这反映在壁厚、内侧细胞核数量的显著增加上, 这让人想起了高血压和动脉粥样硬化中观察到的动脉增厚。病人^13,14。此外, 肥胖、糖尿病或高血压等病理生理条件加速内皮功能障碍的发展^15,16。

血管周围脂肪组织 (PVAT) 释放大量脂肪因子, 以调节血管结构和功能¹⁷。Pvat 的抗收缩作用是由放松因子介导的, 如脂联素、no、过氧化氢和硫化氢 18^{,19, 20}。然而, 根据位置和病理生理条件, PVAT 也可以提高不同动脉的收缩反应²¹。Pvat 产生的亲收缩物质包括血管紧张素 ii、瘦素、抵抗素和 ros²²、²³。 在大多数关于孤立血管的研究中, PVAT 被认为是血管的简单结构支撑, 因此在准备血管环段的过程中被切除。由于脂肪功能障碍是高血压和相关心血管并发症的一个独立的危险因素^24,在调查血管的血管反应性时, 应考虑血管周围的 PVAT。不同的动脉。

多线肌瘤系统已被广泛用于研究各种血管的血管运动功能, 包括主动脉、肠系膜、肾、股、脑和冠状动脉 25^,26。本文描述的协议将使用线断层成像来评估从转基因小鼠模型中分离出的肠系膜动脉中的血管反应性, 并特别关注 PVAT 的调节。

研究方案

所有用于以下研究的动物均由香港大学医学院实验动物组提供。获得了省实验室动物用于教学和研究委员会的道德认可 (CULATR, 编号: 4085-16)。

1. 准备工作

1. 药物的制备
   1. 按照材料安全数据表 (MSDS) 中的规定, 在收到药物后立即妥善储存药物。将粉末形式的药物作为高浓度库存溶液溶解在溶剂中, 然后在-20°c 下储存。
      注: 大多数药物溶解在蒸馏水中, 以制备库存溶液;某些药物可能需要加热或超声检查。如果药物不能完全溶于水, 可以添加 1 M NaOH, 而对于基本药物, 可以使用 1 m HCl。疏水药物可以溶解在二甲基亚硫酸 (DMSO) 或绝对乙醇中。在后一种情况下, 应知道最后的浴浓度 (m), 并应进行适当的控制, 以排除溶剂的影响。
   2. 在实验之前溶解克鲁克斯-林格碳酸氢盐溶液 (krebs) 中含有 115 mm 氯化钠、4.6 mm KCl、2.5 Mm ccl 2、1.17 Mm mgso₄、1.17 mm kh Po 4、25 mm nhco 3、11.1 mm d-葡萄糖和 0.01 mM EDTA, pH 值7.4。
   3. 对于累积浓度-反应曲线, 用连续稀释剂制备不同药物的库存和工作解决方案 (表 1)。
2. 设置仪器
   1. 在每天使用仪系统之前, 或每次移动系统时, 都要校准所有通道的力传感器。
      注: 详细的校准过程因型号而异。一般情况下, 双克重量适用于下颌, 相应的力应为 9.81±0.1 mN。如果读数关闭超过 0.1 mN, 则应重新校准传感器。对于本协议中使用的系统 (见材料表), 校准期间力传感器的工作值应在3000至3500之间。如果传感器的值较高或较低, 则必须更换力传感器。
   2. 调整和调整每个腔内的安装支架。连续和反复使用牙线室可能会导致安装支架的一些错位, 这需要在实验前偶尔进行调整, 以确保下颌正确对齐。
      注: 在调整安装支架时需要特别注意, 因为力传感器非常敏感和脆弱。
   3. 在实验前至少30分钟打开加热器和气体 (95% o2 和 5% co₂), 使腔和缓冲器加热到 37±0.1°c, 并与气体混合物平衡。
      1. 检查温度计上的温度, 以确保加热器的准确性。温度可以修改, 以进行冷却或加热实验。如果温度不正确, 请应用机器的偏移功能来增加或减少设置以达到所需的温度。
   4. 在实验结束时, 清洁所有的房间, 关闭加热器以及运行到设置的气体。
      1. 在吸入系统中的所有液体之前, 不要关闭气体, 否则酸蒸馏水可能会在下次使用时反流并到达有机室。
      2. 要清洁线状仪的腔室, 最有效的方法是使用稀释的醋酸溶液进行酸洗。用棉签清洁房间的边缘和内部。
      3. 洗涤后, 用蒸馏水彻底冲洗房间。用湿布擦拭房间外, 去除干盐。如果在实验中使用了疏水药物, 也可以使用乙醇。
      4. 清洗过程的一个例子如下所示。用8% 的醋酸溶液填充室内, 孵育 2分钟. 使用棉签喷头对钢室表面进行机械清洁。避免与肌电仪的铝部分接触。
      5. 吸入醋酸, 清洗菌丝室, 并支持几次与蒸馏水和干燥表面使用吸收纸或棉尖施药。
3. 肠系膜动脉环的解剖
   注: 用于目前研究的动物是高脂肪饮食喂养雄性 ADIPO-SIRT1 小鼠和野生类型的垃圾伙伴作为对照。在实验时, 每只动物的体重约为45克。
   1. 用腹腔注射戊巴比妥钠 (50 mg/kg) 对小鼠进行安乐死。
   2. 用手术剪刀和钳子, 进行中线剖腹手术, 以揭示腹部内容。
   3. 收集肠系膜拱廊成一个硅涂层培养皿。
   4. 在培养皿中展开和固定肠系膜网络, 揭示肠系膜和结缔组织的分支。
   5. 在显微镜下 (10倍), 用细剪刀和钳子, 仔细解剖周围的结缔组织。避免损坏外层。或者, 周围的脂肪组织可以保留在血管周围进行实验 (如果需要)。
   6. 使用精细的剪刀和钳子, 切除肠系膜动脉的二级分支在冰冷的克雷布缓冲液。
      注: 每个研究人员都应该有自己的一套解剖套件、弦和马刺。这些工具应该在实验结束后每次都要妥善保管和清洗, 因为有些药物很难洗掉, 残留物可以粘在上面。
      1. 保持血管在冷克雷布缓冲液, 同时分离周围的结缔组织, 包括 PVAT。在处理血管的过程中, 要温和, 以防止对内皮细胞造成不必要的损害。
      2. 如果实验涉及 PMAT 的研究, 请在血管周围保留一个1.5 至2毫米直径的 PVAT 球体。或者, 可以在每个腔中添加相同数量的脂肪组织进行实验。
   7. (可选)从解剖的血管中取出内皮细胞作为一种对照, 以评估反应的内皮依赖性。对于肠系膜动脉, 轻轻滚动在电线马刺或头发上的内皮。
   8. 将上述准备的血管切割成小圆环 (~ 2 毫米长), 放入充满曝气 (95% o2 和 5% CO 2) 的塑料盘中, 以便随后安装到电线肌室27中.
   9. 将血管环转移到放置在显微镜下的真菌室中。戒指应均匀放置, 上、下马刺应平行放置。由于药物可能与弦结合, 因此应重新制备连接线 (40μm)。
   10. 将血管环固定在合适长度 (2 厘米) 的电线上, 并通过拧紧固定位置固定在安装腔的一个下巴上。
   11. 通过环和锚的对面下巴的第二根电线。
   12. 用环状螺纹固定在室的下颚, 将腔内安装在仪上, 并顺时针旋转千分尺螺钉, 将电线彼此靠近, 直到与安装的腔室相对应的用户界面上的力读数为零或只是下面。
       注: 连接在上颌的电线长度应为最小, 以确保张力可以完全传输到探测器。
   13. 在第一次使用可调千分尺之前, 在37°c 下平衡制剂至少30分钟。
   14. 评估 115 mM 高钾 (氯化钠在摩尔基础上被 Kcl取代) 的 krebs 含有 4.6 mM Ncl、115 mM Kcl、2.5 mm Ccl 2、1.17 mmmso₄、1.17 mm Kh po 4、25 mm nhaco 3 的krebs和 11.1 mM d-葡萄糖在 ph 值7.4。
       注: 如果在成像系统的数据记录软件中, 将收缩力转换并记录为基线以上的偏转超过其静止音的 40%, 则认为隔离容器是可行的, 以响应收缩剂。如果动脉没有适当收缩, 那么要么最佳的基部张紧壁压力没有得到适当调整, 要么动脉可能在血管隔离或安装过程中受损。
   15. (可选)通过应用苯乙胺诱导血管收缩到 KCl 初始反应的 50% (如力传感器在数据记录软件中记录的那样), 评估内皮细胞的完整性, 然后添加1μm 乙酰胆碱。
       注: 良好的血管准备是获得一致和准确的结果至关重要的。如果内皮完整性测试不满意或对 KCl 没有反应, 则不应将制剂用于实验, 这表明内皮功能或血管平滑肌收缩性分别不令人满意。在这种情况下, 应将制剂替换为来自同一血管的新环或新血管。

2. 正常化, 以确定最佳的初始张力

注: 归一化程序允许确定血管经历适当的静息经膜压力 (100 毫米汞柱或13.3 千帕为肠系膜动脉) 并产生最大活性的动脉的最佳内径 (IC)对血管活性物质的反应。

1. 打开计算机并打开数据记录软件 (请参阅材料表)。
2. 将实验另存为具有新名称的 "LabChart 数据文件", 以避免覆盖原始设置文件。
3. 打开规范化设置窗口, 并将k因子设置为1。接受目镜校准的默认值 (0.3, 如果容器长度未知, 如果已知容器长度, 则为 1)、目标压力 (13.3)、在线平均时间 (2) 和延迟时间 (60)。单击"确定"保存设置。
4. 选择感兴趣的通道并输入导线直径 (40 微米)、组织端点 (a1: 0; a2: 测量的组织长度)、归一化窗口中的初始千分尺读数。
5. 通过对血管施加第一个被动拉伸 (逆时针旋转千分尺螺钉), 启动归一化过程。
6. 等待容器稳定 (3分钟), 并在归一化窗口中输入新的千分尺读数。墙体张力是自动计算的, 并显示为图形上的一个点。
   注: 在被动拉伸过程中使用的千分尺 "步骤" 不需要相同。前几段伸展运动的每延伸可以是20μm。当拉伸接近等距线时, 台阶可以减少到10μm、5μm、2μm 甚至更小。在调整千分尺设置时打开主图表窗口--如果在纵向张力图 (指示与预定值相对应的压力点) 上出现超过等距线的大尖峰, 则可以降低张力。
7. 每次被动拉伸后, 用含有 115 mm Kcl 的等渗透高钾 Krebs 取代控制的 Krebs。当收缩达到高原 (约 3分钟) 时, 通过从钾激活力的每一段中减去被动力来记录主动力 (F)。计算墙体张力以及内部周长 (IC) 值。
   1. 测量活动张力作为基线以上的偏转。活动张力 (T) 是根据方程 F (mN) = T (Mn/2) x 2 x 容器长度 (mm) 计算的。内部周长 (IC) 值是根据微米数据 (IC = 205.6 微米 + 2 x "间隙") 计算的。
8. 用新鲜的克雷布代替, 去除高钾状况。重复清洗3次超过5分钟。
9. 重复步骤2.5 至 2.8 (通过诱导被动拉伸, 然后交替收缩), 直到主动张力开始降低 (图 2)。
10. 经过多轮交替拉伸, 被动加长张力曲线给出 IC100 的值, 在100毫米汞柱的横截面压力下, 容器的内部周长, 作为与等深线的交叉点。
    注: 被动拉伸过程中的每个千分尺值都是在软件"归一化模块" 中手动引入的。该程序自动记录相应的力测量, 以生成被动长度张力曲线, 该曲线给出了 IC100 作为与等距线的交叉点的值 (图 2, 右面板)。最后一点是离等深线更近, 但就在较好的正常化之上, 是在不损坏船只的情况下。距离等高线太远的一点可能会对安装的船只造成物理伤害, 在实验过程中造成不可靠的结果。
11. 创建有源长度张力曲线, 以确定 IC1 值, 并计算归一k 因子作为 ictuic100 的比率, 这将用于这种类型的血管在随后的断层扫描实验。
    注: 活动长度张力曲线是通过绘制由 x 轴上的微米数据和 y 轴上的活动张力计算的 IC 值而创建的。IC1 是位于高原峰值区域内的值 (图 2中的红色轨迹, 右面板)。在绘制了主动长度张力曲线并确定 IC1 后, 将归一化k因子计算为 icinic100 的比率。基于归一k 因子, 基准的最优 ic (称为 ic1) 将显示在被动加长张力曲线上。此 IC 的千分尺设置显示在曲线下, 应用于设置微定位器进行后续的断层扫描实验。初始张力 (T) 等于目标压力 (Pi) x ic2, 施加于容器的最佳力 (F) 等于 T x 2 x 容器长度。
12. 彻底冲洗高钾克雷布和平衡的准备工作, 再 30至45分钟, 重置基础张力为 "零", 以便在随后的实验中只记录主动收缩反应。

3. 苯乙胺引起的收缩

注: 可选择诱导血管收缩反应的药物包括非特异性肾上腺素、非特异性肾上腺素、肾上腺素和肾上腺素反应源性肾上腺素、肾上腺素 a 型肾上腺素、苯甲肾上腺素、肽激素血管紧张素 II 和单胺神经递质 5-羟色胺。本协议中使用苯乙胺进行检查 (材料表)。

1. 准备和安装配对动脉环, 如第1.3 节所述, 一个与 PVAT 完整, 另一个与 PVAT 删除, 从每个动脉的相邻部分进行实验。
2. 归一化后 (见第2节), 通过在含有克雷布的腔中添加 115 mM KCl 溶液, 将动脉段与高钾 Krebs 缓冲液预收缩。
3. 等待收缩到高原 (3分钟), 洗掉高钾, 取而代之的是新鲜加气的克雷布缓冲液。在5分钟内重复清洗三次。
4. 重复 KCl 刺激和洗涤三次, 并记录最大收缩反应张力到 KCl 通过减去基线张力的张力, 从 KCl 刺激。
5. 最后一次收缩和清洗后, 用温暖的、加气的克雷布斯缓冲液填充腔, 让动脉恢复约 30分钟, 然后再执行下一项任务。
6. 在每个腔中, 添加苯基酚的累积量 (半原木增量从^10-10到 10-4 m) , 以诱导静态制剂的等距张力增加。
7. 首先在室中加入低浓度的激动剂。在有足够的时间进行稳定收缩 (3-5分钟) 后, 添加下一个浓度。重复这些步骤, 增加苯乙胺的浓度。
8. 加入最后一剂激动剂 (苯乙胺) 后, 彻底冲洗药物, 并用新鲜的克雷布缓冲液填充腔内。将浓度相关响应绘制为 kc 诱导的最大收缩百分比的增加 (图 3)。
9. (可选)为了评估 NO 的贡献, 在添加苯乙胺之前, 用 NO 合酶抑制剂 L-NAME (^10-4 m) 孵育制剂30分钟。L-NAME 增强肠系膜动脉静止制剂中苯肾上腺素引起的收缩 (图 4)。
   注: 抑制剂或拮抗剂必须有足够的时间来实现平衡, 通常为 30-45分钟 (对于任何一组实验都是一致的)。
10. 为了按顺序执行第二个浓度-响应曲线, 请彻底和反复地清洗腔内, 以去除所有以前的激动剂, 直到没有观察到语气的进一步变化。
    注: 平行实验将从同一血管获得的至少两个环暴露在激动剂身上, 一个在控制条件下, 一个在抑制剂的存在下;在每个环中, 集中响应曲线将只执行一次。它更倾向于进行平行实验, 因为这为药物的作用和血管敏感性提供了更好的控制。串行实验得到了一个单一环中激动剂的浓度-响应曲线;将其清洗干净, 改变实验条件 (例如, 添加抑制剂), 然后在同一环上重复浓度响应曲线。在这种情况下, 需要时间控制来表明药物反应不是由于组织随时部的变化。在接触集中反应实验后, 人们永远无法确定组织处于完全相同的状态。必须给予足够的时间 (至少 30-60分钟), 以允许血管段恢复其休息 (基础) 紧张, 虽然在某些情况下, 这可能不会立即发生后, 高亲和力激动剂从受体分离。此外, 在累积浓度-反应曲线之间还可以应用高钾克雷布, 以减少脱敏 28.记住, 大多数拮抗剂不能完全被冲走, 因此在接下来的实验中不断添加它。

4. 内皮依赖松弛/收缩

1. 预承包刚安装的动脉段 (如步骤3.2 至3.5 所述)。再次, 记录最大收缩响应张力到 KCl 的减去基线张力的张力, 从 KCl 刺激。
2. (可选)在加入 U46619 之前, 用 NO 合酶抑制剂 l-name (^10-4 m) 对制剂进行培养30分钟。
3. 将初步计算的 U46619 浓度添加到腔内, 使动脉段持续收缩。
   注: 肠系膜动脉中的血管舒张反应在对 115 mM KCl 的最大反应中预收缩约 80%, 不同的激动剂可通过激活其特定受体来诱导收缩。在这里, 有或没有 PVAT 的血管段预承包与 U46619 (1-3 x 10-8 m ;材料表), 血栓素 a2 受体激动剂, 诱导稳定和持续的平滑肌收缩。
4. 在器官腔中加入乙酰胆碱的累积浓度 (^10-10至^10-4 m)。动脉段的浓度依赖性血管舒张反应是以 U46619 诱导的收缩反应的百分比表示的 (图 5)。
   注: 在大多数实验中, 当观察到高原时, 应立即添加放松激动剂的下一个浓度, 以防止张力反弹。动脉段的浓度依赖性血管舒张反应按 U46619 诱导的收缩反应的百分比进行归一化, 以适应动脉段之间神经支配和直径的微小差异 (图 5)。当一组六个或更多的实验进行统计分析时, 从同一血管获得的单个环之间的响应性的微小变化变得最小。当将反应表示为单个组织自身最大收缩的百分比时, 最好使用配对分析 (例如, 配对学生的 t 测试) 来比较来自不同动物的相同类型组织的反应, 以进行比较干预前后单个组织的反应。在分析 PVAT 的影响时, 采用双向方差分析, 然后进行多重对比试验。
5. 加入放松激动剂的最后剂量后, 将药物从每个腔中取出, 并补充新鲜的克雷布缓冲液。用克雷布缓冲液彻底清洗腔内, 让动脉稳定至少 45分钟, 然后再进行任何额外的实验。

结果

检查纵向/张力关系, 以获得归一化因子k

应用于血管段的拉伸量会影响阿克林-肌球蛋白相互作用的程度, 从而产生最大的作用力。因此, 对于每一种类型的血管, 确定最大活跃力所需的拉伸量是适当的脊髓造影研究所必需的。在这里, 对从小鼠模型中分离出的肠系膜动脉进行了纵向张力关系的归一化 (

讨论

除了内皮细胞外, PVAT 产生的信号在调节平滑肌张力反应^{性 30}方面发挥着重要作用。健康的 pvat 释放 no 和抗炎脂联素, 对动脉产生抗收缩作用, 在肥胖和代谢综合征等病理条件下丢失 31,³²。在疾病状态下, pvat 有助于内皮功能障碍和其他心血管异常的发展^33,34。据报道, 肥胖动物的动脉

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma-Aldrich	A6625	Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)	Sigma-Aldrich	N5751	Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M
Phenylephrine	Sigma-Aldrich	P6126	Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)	Enzo	BML-PG023-0001	Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myograph	Danish MyoTechnology (DMT)	620M
PowerLab 4/26	ADInstruments	ML848
Labchart7	ADInstruments	-
Adipo-SIRT1 wild type mice	Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong	CULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishes	Danish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wires	Danish MyoTechnology (DMT)	300331
Surgical tools