从外周单核细胞生成诱导神经干细胞,分化至多巴胺能神经元前体,用于移植研究

摘要

该协议提出了外周血单核细胞的重新编程,以诱导神经干细胞由仙台病毒感染,将iNSCs分化为多巴胺能神经元,将DA前体移植到单方面病变帕金森病小鼠模型,并评价iNSC衍生DA前体用于PD治疗的安全性和有效性。

摘要

帕金森病 (PD) 是由心内脑素 (VM) 中基拉多巴胺能 (DA) 神经元的退化引起的。细胞替代疗法对PD的治疗大有希望。 最近,诱导神经干细胞(iNSCs)由于肿瘤形成的风险降低和可塑性增加而成为细胞替代治疗的潜在候选者。区域特定的神经元和胶质。iNSCs可以从自体体细胞源(如成纤维细胞、外周血单核细胞(PBMC)和各种其他类型的细胞)重新编程。与其他类型的体细胞相比,PBMC是一个有吸引力的起始细胞类型,因为易于访问和扩展的培养。仙台病毒(SeV),一种RNA非整合性病毒,编码重新编程的因素,包括人类OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC,具有负感,单链,非分段基因组,不集成到宿主基因组,但仅在受感染细胞的细胞质中复制,为重新编程提供了高效和安全的工具。在本研究中,我们描述了一种协议,其中通过重新编程PBMC获得iNSC,并通过两阶段方法分化成专门的VM DA神经元。然后DA前体被移植到单方面的6-羟基多巴胺(6-OHDA)病变PD小鼠模型中,以评估PD治疗的安全性和有效性。该方法为研究患者特异性DA神经细胞在体外和体内的功能和治疗效果提供了一个平台。

引言

帕金森病 (PD) 是一种常见的神经退行性疾病,由心内脑素 (VM) 的底状尼格拉帕压实 (SNpc) 的多巴胺能 (DA) 神经元退化引起,60 岁以上人群的患病率超过 1%^1,2.在过去十年中,细胞疗法,旨在取代退行性或受损的细胞,或滋养退化神经元周围的微环境,在PD3的治疗中显示出潜力。同时,重新编程技术也取得了显著进展,为替代疗法提供了有前途的细胞源。人类诱导多能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞(ESCs)已被证明能够分化成DA神经细胞,当移植到大鼠和非人类灵长类动物PD模型中时,这些神经细胞可以存活、成熟,并改善运动^{功能5 ,6,7,8}.iPSC是细胞再编程技术的一个里程碑,在细胞移植方面有着巨大的潜力;然而,人们仍然担心肿瘤从不完全分化的细胞形成的风险。细胞移植的替代细胞来源是通过直接重新编程获得的系世型成人干细胞,如诱导神经干细胞(icCS),可以从不稳定的中间体中提取,绕过多能性阶段9,^10,11.

iPSC 和 iNSCs 都可以从自体细胞源(如成纤维细胞、外周血单核细胞 (PBMC)和各种其他类型的细胞12、13、14)重新编程,从而减少移植细胞的免疫原性在很大程度上。此外,与iPSCs相比,iNSCs是固有的,肿瘤形成和系骨的可塑性风险降低,只能分化成神经元和胶质11。在最初的研究中,人类或小鼠iPSC和iNSCs是由从皮肤活检中获得的成纤维细胞产生的,这是一个侵入性程序14,15。在这方面,PBMNCs是一个有吸引力的起始细胞源,因为侵入性较小,并且易于在短时间内获得大量的细胞扩展^时间16。初始重新编程研究采用综合输送系统,如慢病毒或抗逆转录病毒载体,这些系统在多种细胞中高效且易于实施17;然而,这些传递系统可能导致突变和残留转基因的重新激活,这提出了临床治疗目的的安全问题12。仙台病毒(SeV)是一种非整合性RNA病毒,具有负感的单链基因组,不集成到宿主基因组中,但只在受感染细胞的细胞质中复制,为重新编程提供了高效和安全的工具 ^,19.可组合SeV向量,包含重新编程的因素,包括人类OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC在其开放阅读帧。此外,通过引入温度敏感突变,可以进一步改善SeV病毒载体,以便在培养温度升高至39°C²⁰时迅速去除。在本文中,我们将介绍一种使用 SeV 系统将 PBMC 重新编程到 iNSC 的协议。

许多研究已经报告从人类ESCs或iPSC衍生的DA神经元使用各种方法6,8,21。然而,在细节上描述DA神经元与iNSCs分化的协议很缺乏。在此协议中,我们将使用两阶段方法描述从 iNSC 高效生成 DA 神经元。DA神经元前体可移植到PD小鼠模型的纹状体中,用于安全性和有效性评估。本文将介绍一个详细的方案,涵盖从仙台病毒生成诱导神经干细胞,将iNSCs分化为DA神经元,建立小鼠PD模型,到将DA前体移植到纹状体的各个阶段PD 模型。使用该协议,人们可以从患者和健康捐赠者生成iNSC,并得出安全、标准化、可扩展和均匀的DA神经元,用于细胞移植目的,或用于在培养皿中建模PD和研究机制潜在的疾病开始和发展。

研究方案

所有程序都必须遵守机构人类研究伦理委员会的指导方针。采血前必须征得患者或健康志愿者的知情同意。该协议由该机构的人类研究伦理委员会批准,并根据该机构的虐待和使用动物指南执行。

1. PBMC的收集、隔离和扩展

1. PBMC 的收集
   1. 收集10-20 mL的供体的外周静脉血,用肝素钠防腐剂小瓶进行静脉穿刺。
      注:血液样本应在室温(RT)下储存或运送。在24小时内处理血液样本。
2. 培养媒介的准备
   1. 通过组合以下成分制备无血清介质(SFM):245 mL 的 Iscove 改良 Dulbeco 介质 (IMDM),240 mL 的火腿的 F-12,5 mL 的胰岛素转移素-硒-X 补充剂 (ITS-X),5 mL 的 100x 谷氨酰胺库存溶液(表材料),5 mL化学定义的脂精,2.5克胎儿牛血清,0.025克抗坏血酸和9μL的1-硫甘油。过滤介质并将其存储在 4°C。
      注意:抗坏血酸和1-硫甘油对皮肤接触和吸入有毒。
   2. 要制备单核细胞(MNC)介质,补充SFM介质10纳克/mL人白细胞介素3(IL-3),2 U/mL红细胞生成素(EPO),100纳克/mL人类干细胞因子(SCF),40纳克/mL人类胰岛素样生长因子1(IGF-1),100微克/mL霍洛转移素和1_M 地塞米松。过滤介质并将其存储在 4°C。
      注:在使用前立即准备介质。
3. 多溴联苯醚的隔离
   1. 使用前,请对干净的工作台进行紫外线消毒。用 75% 的酒精对所有表面和设备进行消毒。使用高压灭菌器消毒所有提示。
   2. 将外周血 (PB) 转移到 50 mL 锥形管中,用同等体积的无菌 Dulbeco 的磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS) 稀释 PB。
   3. 在另一根50 mL锥形管中制备15 mL的灭菌密度梯度介质(材料表)。
      注:在RT处保持密度梯度介质和PB,以更好地隔离PBMC。
   4. 将含有密度梯度介质的锥形管以 45° 角倾斜,然后缓慢小心地将 30 mL 的稀释 PB 倾斜到密度梯度介质上。
      注:小心,让PB缓慢地从锥形管的一侧运行到密度梯度介质层上。红血球会沉积在管的底部。仔细倾斜管,以尽量减少层界面的中断。
   5. 在 RT 处以 800 x g将管离心 15 分钟,将离心机制动器设置为"关闭"位置。吸出黄色,上层的血浆层,并丢弃它。然后,将含有 MN 的含有 MN 的 10 mL 移液器的白色云薄膜层转移到新的 50 mL 锥形管中。
      注:关闭离心制动器对于隔离 MNC 非常重要。
   6. 在管中加入 30 mL 的 D-PBS,在 600 x g 下以 600 x g进行 10 分钟,在 4°C 下使用。丢弃上清液,然后添加45 mL的D-PBS来重新悬浮细胞。在 4°C 下 400 x g下离心 10 分钟。
      注:本台离心制动器应为此和以下离心步骤打开。由于细胞颗粒是密集的,加入1-2 mL的D-PBS轻轻重新悬浮颗粒,然后将D-PBS添加到45 mL。
   7. 丢弃上清液,用5 mL的D-PBS重新悬浮细胞,用锥体蓝色排除法对活细胞进行计数。
   8. 在预留扩展所需的 MMC 后,冻结剩余的电池以供将来使用。
      注:至少5 x 10⁶ MNC可冷冻在一个瓶中,冷冻介质为1 mL(材料表)。可以在此处暂停该协议。
4. 扩大跨国公司
   1. 在第14天,种子MNC的密度为每毫升2-3 x 10⁶细胞,在一口六孔板中,预加热(37°C)MNC介质为1.5 mL。在37°C下孵育,5%CO₂孵育2天。
   2. 在第11天,用消毒移液器收集细胞和介质,并转移到新的15 mL锥形管中。在RT下以250 x g将细胞离心5分钟。丢弃上清液,在1mL的预加热(37°C)MNC培养基中重新悬浮细胞。
   3. 用锥蓝色计算可行的细胞。在预加热的MNC培养基中,以每毫升1 x10⁶细胞的密度将MNC播种,并在37°C、5%CO₂下孵育3天。
      注:预计在第-11天,细胞总数可能会减少。
   4. 在第 8 天,重复步骤 1.4.2-1.4.3 并培养细胞 3 天。
   5. 在第-4天,重复步骤1.4.2-1.4.3,并培养细胞3天。
      注:经过14天的文化,同等数量或更多的跨国公司应留在文化中。

2. 通过SeV感染将PBMC重新编程到iNSC

1. 解决方案和文化介质的准备
   1. 通过溶解 100 mL 的 PDL 100 mL H₂O,以 1 mg/mL 的浓度,制备多 D-溶酶 (PDL) 库存溶液。储存在-20°C在1 mL等分。
   2. 在0.01 N HCl的20 mL中溶解100mg胰岛素,以5mg/mL的浓度制备胰岛素储存溶液。储存在-20°C在1 mL等分。
   3. 要制备 200 mL 的 iNSC 基础介质,请将 96 mL 的 DMEM-F12 和 96 mL 的基本介质(材料表)与 2 mL 的 100x 谷氨酰胺库存溶液、2 mL 的非必需氨基酸 (NEAA)、2 mL 的 N2 补充剂和 2 mL 的 B27 补充剂相结合。在使用前添加10纳克/mL重组人类白血病抑制因子,3μM CHIR99021和2μM SB431542。过滤介质并将其存储在 4°C。
      注意:在 2 周内使用介质。在使用前加入重组人类白血病抑制因子CHIR99021和SB431542。
2. 通过SeV感染对PBMC的重新编程
   1. 使用前,请对干净的工作台进行紫外线消毒。用 75% 的酒精对所有表面和设备进行消毒。使用高压灭菌器消毒所有提示。
   2. 在第0天,收集MNC培养基中的细胞并转移到15 mL锥形管中。在200 x g下将细胞离心5分钟。吸气上清液,用预加热的MNC培养基1mL重新悬浮细胞。
   3. 用锥蓝色计算可行的细胞。在24孔板中,用预加热(37°C)MNC培养基重新悬浮至每孔2 x 10⁵个细胞的浓度。
   4. 从 -80°C 存储中取出 SeV 管后,在 37°C 水浴中解冻含有 SeV 的管 5-10 s,然后允许它们在 RT 解冻。一旦解冻,立即将它们放在冰上。
   5. 将SeV编码人类Klf4、Oct3/4、SOX2和c-MyC添加到井中,感染(MOI)的倍数为10。带板在1,000 x g的离心细胞30分钟,以方便细胞的附着。将细胞和上清液留在板中。将板置于培养箱中的 37°C,CO₂5%。
      注意:所有涉及 SeV 的程序都必须在安全柜中进行,所有吸头和管在处置前均应使用乙醇或漂白剂处理。
   6. 在第1天,将介质和细胞转移到15 mL的离心管中。用 1 mL 的 MNC 介质冲洗油井。将细胞悬浮液在200 x g下离心5分钟。在24孔板中用500μL的新鲜预加热MNC培养基吸气,将上清液吸气,重新悬浮细胞。
      注:在PDL/层宁电镀之前,使用低附件24孔板防止任何电池附着。
   7. 第2天,将1毫克/mL PDL稀释1mL,D-PBS浓度为19 mL,浓度为50微克/mL。在 RT 处涂上 50 μg/mL PDL 的 6 孔板,至少 2 小时。
   8. 用20 mL的D-PBS稀释200 μL 0.5毫克/mL层宁,浓度为5微克/mL。在 6 孔板中吸气 PDL,在垂直清洁的长凳上干燥。
   9. 用5μg/mL层宁涂覆6孔板,在37°C下孵育4-6小时。使用前用 D-PBS 清洗。
   10. 第3天,在PDL/层宁涂层6孔板上的iNSC介质中,将步骤2.2.6中获得转导的细胞板。
       注:将细胞放在PDL/层宁涂层板上后,如果需要,轻轻移动板,尽量不要干扰电池的附着。
   11. 在第5天,在每个孔中轻轻在6孔板中加入1mL的预加热(37°C)iNSC介质。
       注:预计细胞将经历剧烈死亡(>60%)。
   12. 在第7天,在每个孔中轻轻在6孔板中加入1mL的预加热(37°C)iNSC介质。
   13. 从第 9 天到第 28 天,每天用新鲜的预加热 (37 °C) iNSC 介质替换废介质。监测iNSC菌落的出现。挑选并传输 iNSC 克隆,在大约 2-3 周内进行扩展。使用燃烧的玻璃移液器,使用燃烧的玻璃移液器,去除具有适当形态的菌落,排除任何可能污染的细胞,并用 200 μL 吸头吸出菌落。
       注:特征的iNSC可以冷冻,以便将来在一个小瓶中使用2-5个菌落。冷冻培养基包括无血清基础培养基(材料表)和二甲基硫酸盐混合,比例为9:1,应在使用前立即制备。可以在此处暂停该协议。

3. iNSC与多巴胺能神经元的分化

1. 解决方案和文化介质的准备
   1. 通过将 192 mL 的 DMEM-F12 与 2 mL 的 100x 谷氨酰胺库存溶液、2 mL 的 NEAA、2 mL 的 N2 补充剂和 2 mL 的 B27 补充剂相结合,制备 200 mL 的 iNSC 分化基底介质。
      注意:在 2 周内使用介质。
   2. 通过用1μM SAG1和100 ng /mL FGF8b补充iNSC分化基础介质,制备iNSC分化阶段I介质。
      注意:在 2 周内使用介质。
   3. 通过补充iNSC分化基底介质,补充0.5 mM环腺苷单磷酸(cAMP)、0.2 mM抗坏血酸、10μM DAPT、10纳克/mL脑衍生神经营养因子(BDNF)、10纳克/mL胶质衍生物,制备iNSC分化II介质中营养因子(GDNF)和1纳克/mL转化生长因子+III(TGF-+III)。
      注意:在 2 周内使用介质。
2. 涂覆文化菜肴
   1. 使用前,请对干净的工作台进行紫外线消毒。用 75% 的酒精对所有表面和设备进行消毒。使用高压灭菌器消毒所有提示。
   2. 对于 PDL 涂层,至少在重新电镀电池前一天,将 1 mL 的 1 mg/mL PDL 稀释 19 mL 的 D-PBS,浓度为 50 μg/mL。在 RT 下用 50 μg/mL PDL 的 24 孔板中用 75% 酒精对 12 mm 玻璃盖唇进行消毒,至少 2 小时。
   3. 对于层宁涂层,将 200 μL 的 0.5 mg/mL 层压,与 20 mL 的 D-PBS 稀释至 5 μg/mL 的浓度。吸气 PDL,在干净的长凳中干燥水井。用 5 μg/mL 层宁涂抹 12 mm 盖玻片,并在 37°C 下孵育 4-6 小时。使用前用 D-PBS 清洗。
3. 用于分化的通道细胞。
   1. 当培养的iNSCs的汇合达到70-90%时,从培养板上吸出培养基,并加入1mL的D-PBS来洗涤细胞。每孔加入1mL的预加热(37°C)细胞分离试剂(材料表),在37°C孵育3分钟,分离细胞。
   2. 孵育3分钟后,细胞变为半浮;每孔加入3mL的预加热(37°C)DMEM-F12介质,上下移液细胞将分离细胞颗粒分解到单个细胞中。
   3. 将细胞转移到15mL锥形管中,并在250 x g下离心3分钟。 释放上清液,根据细胞数量,用适当体积的预加热(37°C)iNSC培养基重新悬浮细胞。
   4. 使用锥蓝色排除方法计算单元格。板 5 x 10³细胞每 12 毫米玻璃盖板在 24 孔板和孵育在 37°C, 5% CO₂.
4. 将 iNSCs 分化为多巴胺能神经元。
   1. 将细胞重新镀在PDL/层膜涂层盖玻片上后,24小时开始分化。吸气培养基,用D-PBS洗涤细胞一次,然后在24孔板中每孔加入600μL的预加热分化阶段I培养,并在37°C,5%CO₂孵育。
   2. 在分化的第一阶段,每天从第 1 天更改为第 10 天。
   3. 在第10天,吸出培养基,用D-PBS清洗细胞一次。在24孔板中每孔加入600μL的预加热(37°C)分化II介质,并在37°C、5%CO₂下孵育。
   4. 在分化的第二阶段,每隔一天从第11天改为第25天更换介质。分化的细胞可以在不同时间点通过甲醛固定进行分析。
   5. 对于免疫荧光染色,在分化日11至25号选择的时间点用D-PBS轻轻清洗细胞三次。
   6. 将非离子表面活性剂(材料表)移液300μL放入100 mL的PBS中,在PBS中制造0.3%的非离子表面活性剂。
      注意:非离子表面活性剂对皮肤接触和吸入有毒。
   7. 在RT处用4%的甲醛固定细胞10分钟。然后在PBS中用0.3%洗涤三次。
      注意:甲醛因皮肤接触和吸入而有毒。
   8. 在RT处将细胞块2小时,将3%的驴血清块。
   9. 以适当的浓度稀释1%驴血清中的原抗体,然后轻轻三聚物混合。在24孔板的每个孔中加入300μL的初级抗体溶液。在4°C孵育细胞过夜。用0.3%的非离子表面活性剂在PBS中清洗细胞三次。
   10. 以适当的浓度稀释1%驴血清中的二级抗体,然后轻轻三聚物混合。在24孔板的每个孔中加入300μL的二级抗体溶液。在RT下孵育细胞2小时,防止光线照射。
   11. 用0.3%的非离子表面活性剂在PBS中清洗细胞三次。稀释 4',6-二酰胺-2-苯酚 (DAPI),带 PBS,稀释 1:500。在RT处用300μL稀释的DAPI孵育24孔板的每个孔中的细胞15分钟,防止光线照射。用0.3%的非离子表面活性剂在PBS中清洗细胞三次。
   12. 用钳子轻轻地从板的井中拿出盖片。在荧光显微镜下在RT.Mount的黑暗中干燥过夜。

4. 建立单方面6-羟基多巴胺(6-OHDA)病变PD小鼠模型

1. 要生成用于细胞移植的 PD 小鼠模型,请使用体重为 20-25 g 的成年雄性 SCID-米色小鼠进行 6-OHDA 注射。
2. 手术药物的准备
   1. 通过将 0.2 克抗坏血酸溶解到 100 mL 的灭菌盐水中(0.9%) 制备 0.2% 抗坏血酸溶液并储存在-80°C,直到使用。在手术当天,将0.2%抗坏血酸溶液稀释10倍,获得0.02%抗坏血酸溶液。
      注:加入抗坏血酸,以防止6-OHDA氧化为非活性形式。
   2. 要制备 6-OHDA 溶液,将适量的 6-OHDA 称重到灭菌的 1 mL 管中,然后加入 0.02% 抗坏血酸的体积,以制造 5 μg/μL 6-OHDA 溶液。涡旋混合物,直到它溶解。将 6-OHDA 放在冰上,直到使用。
      注:6-OHDA 是温度和光敏。小心保护溶液免受光线照射,并在使用前将其保持在冰上。
3. 手术前通过高压灭菌准备消毒手术设备。设置立体框架时,使用乙醇清洁所有设备和表面积。在加热灯下设置鼠标回收笼。
4. 进行手术以建立单侧6OHDA病变小鼠模型。
   1. 称量每只老鼠,记录重量并计算需要施用的药物量。每只小鼠在手术前20分钟收到0.5毫克/千克阿托品。用80毫克/千克氯胺酮和10毫克/千克木氨酸麻醉小鼠。
   2. 通过腹内注射施用0.5毫克/千克阿托品。
   3. 在注射阿托品20分钟后,通过腹内注射,用80毫克/千克氯胺酮和10毫克/千克木氨酸麻醉小鼠。
   4. 将鼠标放入封闭的密室中。3-5分钟后,小鼠将被深度麻醉,而对后腿捏合没有反应。
      注:预计接受麻醉的小鼠将经历一个激励期。
   5. 切毛小鼠头部,在小鼠眼睛上涂抹红霉素眼膏,以防止角膜溃疡。
   6. 将鼠标放在立体装置上。首先用切口杆固定鼠标。正确插入耳罩,使鼠标头处于平坦且固定的位置。
   7. 用波维酮碘和等丙醇对小鼠头部进行消毒。用手术刀切下垂(约1.5厘米)的头部皮肤,并露出头骨。调整切口杆和耳杆,将胸膜和羊肉之间的高度差减小到 0.1 mm 以下。
      注: 小鼠胸膜位于冠状和下垂缝合线的交汇处,而 lambda 位于羔羊和下垂缝合线的交汇处。
   8. 慢慢移动并降低针尖朝向胸膜,并将胸针视为零点。将尖端移到坐标为 A/P ±0.5 mm、M/L -2.1 mm 的位置。收回尖端并标记点。在头骨上挖一个小洞
   9. 将2μL的5μg/μL 6-OHDA溶液提取到微注射器(材料表)。将针头返回到标记的点,并将针头插入 D/V -3.2 mm。
   10. 以1μL/min的速率注入2μL的5μg/μL 6-OHDA溶液(共10微克)。注射6-OHDA后,将针头留在原位5分钟。然后慢慢缩回注射针。
   11. 用缝合线关闭切口,并在小鼠眼睛上涂抹红霉素眼药膏。提供0.5 mL盐水皮下,以防止脱水,并直接在缝合皮肤上应用抗生素膏。
   12. 将鼠标从立体设备中取出,放入恢复笼中。把鼠标放回去,让食物和水进入,直到它恢复意识。在手术后每天在饮用水中用镇痛药治疗小鼠2-3天,推荐的布洛芬剂量为每天0.03毫克/克的体重。
   13. 手术后每天检查鼠标。

5. 单边6-OHDA病变后的行为评估

1. 手术后两到三周,进行行为评估以估计PD症状。称量每只小鼠,记录其重量并计算应施用的药物量(评估前0.5毫克/千克阿波吗啡)。
2. 在评估前,通过皮下注射施用0.5毫克/千克阿波坦,并将小鼠放入玻璃缸中。
3. 在5分钟的习惯期后,计算每分钟相对于病变方的反向和侧边旋转次数,并用摄像机记录其活动。
4. 反向减边旋转 >7 rpm/min 的小鼠被视为成功病变,并被选为细胞移植实验的候选对象。休息30分钟后,将老鼠送回外壳笼。
   注:如果小鼠成功病变,6-OHDA注射小鼠将表现出更大的偏置转向反向侧,因为DA激动剂主要激活病变侧的超敏感变性纹状体。
5. 在细胞移植后一周和2、4、6、8、12、16周进行行为评估。

6. DA前体的细胞移植

1. 准备细胞悬浮液进行移植。对于细胞移植,在移植缓冲液的平衡盐溶液(材料表)中,以1:7在4μL的5g^L-1葡萄糖中以1:7的比例将D10和D13 DA前体混合在2 x10⁵ DA前体。
2. 按照第4.4节所述的程序进行细胞移植手术,但6-OHDA被DA前体细胞悬浮液或缓冲液所取代。
3. 按照第5节所述程序,在DA前体细胞移植后2、4、6、8、12、16周进行行为评估。计算每分钟相对于病变侧引起的反侧旋转数,并用摄像机记录其活动。
   注:移植后,反向旋转速度降低表明运动功能有所改善。
4. 在细胞移植后的4、8、12和16周,在深度麻醉下用4%的甲醛将小鼠注入,直到小鼠身体变硬,小鼠肝脏变苍白。
5. 轻轻地分离小鼠的大脑,在4°C处将大脑放入4%的甲醛中过夜。
6. 第二天,将大脑放入30%的蔗糖中脱水,直到大脑下沉到底部。
7. 使用冷冻的缩微托姆将大脑切成40微米厚度。
8. 执行免疫染色,如步骤 3.4.5-3.4.12 中所述。

结果

在这里,我们报告一个协议,涵盖iNSC-DA细胞治疗的不同阶段,以治疗PD模型。首先,对PBMC进行分离和扩展,并通过SeV感染重新编程为iNSC。图1显示了使用PBMNC扩展和iNSC感应的过程的示意图。在-14日,使用密度梯度介质(材料表)对PBMC进行隔离。离心前,用PBS稀释的血液和密度梯度介质被分成两层。离心后,出现四个梯度层(从下到上):底层包含粒细胞和红细胞;第二层包含密度?...

讨论

在这里,我们提出了一个协议,涵盖了PD模型的iNSC-DA细胞治疗的不同阶段。该协议的关键方面包括:(1) PBMC 的隔离和扩展,以及通过 SeV 感染将 PBMC 重新编程到 iNSC;(2) 将 iNSC 分化为 DA 神经元,(3) 建立单方面 6-OHDA 病变 PD 小鼠模型和行为评估,以及(4)DA前体的细胞移植和行为评估。

在此协议中,第一部分涉及在无血清介质(MNC介质)中收集和扩展PBMC,该介质优先扩展红细胞,不支持淋巴细胞?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15-ml conical tube	Corning	430052
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate	Corning	3337
50-ml conical tube	Corning	430828
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381
6-well plate	Corning	3516
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Cell dissociation reagent
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A92902	Toxic with skin contact
B27 supplement	Invitrogen	17504044
BDNF	Peprotech	450-02	Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin	BD	367871
BSA	yisheng	36106es60	Fetal bovine serum
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2	ZENOAQ	100ml	Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate	Invitrogen	11905031
CHIR99021	Gene Operation	04-0004
Coverslip	Fisher	25*25-2
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417-10mg
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
DMEM-F12	Gibco	11330
DMEM-F12	Gibco	11320
Donkey serum	Jackson	017-000-121
EPO	Peprotech	100-64-50UG	Human Erythropoietin
FGF8b	Peprotech	100-25
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	P=1.077, density gradient medium
GDNF	Peprotech	450-10	Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12	Gibco	11765-054
HBSS	Invitrogen	14175079	Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor	Millpore	LIF1010
Human recombinant SCF	Peprotech	300-07-100UG
IGF-1	Peprotech	100-11-100UG	Human insulin-like growth factor
IL-3	Peprotech	200-03-10UG	Human interleukin 3
IMDM	Gibco	215056-023	Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin	Roche	12585014
ITS-X	Invitrogen	51500-056	Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement	Gibco	10828028	Serum free basal medium
Laminin	Roche	11243217001
Microsyringe	Hamilton	7653-01
N2 supplement	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	Non-essential amino acid
Neurobasal	Gibco	10888	Basic medium
PDL	Sigma-Aldrich	P7280	Poly-D-lysine
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Gene Operation	04-0010-10mg	Store from light at -20?
Sendai virus	Life Technologies	MAN0009378
Sucrose	baiaoshengke
TGFβ?	Peprotech	100-36E	Transforming growth factor  β?
Transferrin	R&D Systems	2914-HT-100G
Triton X 100	baiaoshengke		Nonionic surfactant
Trypan blue	Gibco	T10282
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126