从E14-E16斯普拉格·道利大鼠胚胎分离的混合原发希马和皮质神经元生成神经球

摘要

这里介绍的是一个协议，用于从高密度镀电神经元中神经祖细胞中富集的神经球的自发生成。在同一实验中，当神经元以较低的密度被镀层时，该协议也会导致长期原发性大鼠神经元培养。

摘要

初级神经元培养是神经科学领域必不可少的技术。为了获得对大脑的更深层次的机械洞察力，必须有一个强大的体外模型，可用于各种神经生物学研究。虽然原始神经元培养（即长期海马文化）为科学家提供了模型，但它还不能完全代表大脑网络的复杂性。在这些限制之后，一个新的模型出现了使用神经球，这与脑组织有更密切的相似之处。本协议描述了从胚胎第14-16天斯普拉格道利大鼠胚胎中分离出来的混合皮质和海马神经元的高密度和低密度的电镀。这允许产生神经球和长期初级神经元培养作为两个独立的平台进行进一步研究。这个过程非常简单且经济高效，因为它最大限度地减少了以前被认为对神经元培养至关重要的几个步骤和试剂。这是一个强大的协议，具有最低要求，可以执行与可实现的结果，并进一步用于与神经科学相关的各种研究。

引言

大脑是神经元和非神经元细胞的复杂回路。多年来，科学家们一直试图深入了解这种复杂的机器。为此，神经科学家最初利用各种转化的神经基细胞系进行调查。然而，这些克隆细胞系无法形成强突触连接和适当的斧子或树突，转移了科学兴趣的主要神经元培养1，2。原始神经元文化最令人兴奋的方面是，它创造了观察和操纵活神经元的机会3。此外，与神经组织相比，它不太复杂，因此成为研究各种神经元蛋白质的功能和传输的理想候选者。最近，显微镜、基因组学和蛋白质组学领域的一些发展为神经科学家创造了利用神经元培养的新^机会。

初级文化使神经科学家能够探索神经发育背后的分子机制，分析各种神经信号通路，并发展对突触的更连贯的理解。虽然许多方法已经报告了来自主神经元的培养物（主要来自海马起源5，6，7），但具有化学定义的介质的统一协议是，使神经元的长期培养仍然需要。然而，在低密度下镀层的神经元最常被观察到，这些神经元不能长期存活，这可能是由于缺乏营养支持8，而营养支持是由相邻的神经元和胶质细胞提供的。一些方法甚至建议与胶质细胞共同培养主神经元，其中胶质细胞用作^第9层的供料层。然而，胶质细胞由于过度生长而引起许多问题，有时会覆盖神经元^的生长。因此，考虑到上述问题，需要一种更简单、更具成本效益的初级神经培养方案，神经生物学家和神经化学家都可以用于研究。

初级神经元文化本质上是一种二维文化形式，并不代表大脑的可塑性、空间完整性或异质性。这就产生了一个更可信的3D模型，称为神经球11，12的需要。神经球为神经科学家提供一个新颖的平台，与真正的、^{体内的大脑更}相似。神经球是富含神经干细胞（NSC）、神经祖细胞（NPC）、神经元和星形细胞的非粘附性3D细胞簇。它们是神经干细胞和神经祖细胞分离的极好来源，可用于研究各种神经元和非神经元谱系的分化。同样，使用先前报告的协议产生的神经圈培养物的变异性对制定统一的神经圈培养^方案14构成了障碍。

本手稿提出了一个协议，通过从混合皮质和海马培养中交替细胞电镀密度，可以生成 2D 和 3D 平台。据观察，在7天内，自由浮动的神经球是从从E14-E16斯普拉格道利大鼠胚胎中分离出来的高密度镀层神经元中获得的，这些神经元在进一步培养后，通过径向胶质状的延伸形成桥梁和互连。同样，在低密度镀层神经元中，通过每周两次改变维持介质，可以维持长达30天的主要神经元培养。

研究方案

涉及动物的所有实验程序都经印度化学生物学研究所的机构动物伦理委员会（IICB/AEC/会议/2018/1年4月）批准。

1. 试剂和介质制备

1. 聚D-莱辛（PDL）溶液:在去离子水中以0.1mg/mL的浓度制备PDL溶液，并储存在4°C中，直到使用。
2. 分离介质:至1 L的无菌、过滤脱离子水，在相应浓度中结合以下组分:氯化钠（8毫克/升）、氯化钾（0.4毫克/升L）、磷酸钾单基（0.06毫克/升）、D-葡萄糖（1毫克/升）磷酸钠二基（0.479毫克/升，和1 M HEPES [4-（2-羟基）-1-烟酸乙酸;10 mM]。涡旋所有组件，以帮助适当的混合和存储在4°C，直到使用。
   注:在解索过程中，但在室温（RT）下，使用冷冰形式的解散介质进行清洗和其他用途。
3. 电镀介质:电镀介质包括:最小必需介质（MEM）Eagle与Earle的平衡盐溶液（BSS;88.4%），D-葡萄糖（0.6%），马血清（10%）和青霉素/链霉素（1%）。将组件组合成各自的比率，并在无菌条件下在发动机罩内执行该过程。
   注:始终使用新鲜制备的电镀介质，以避免任何组件降解。
4. 维持介质:在各自的比率中结合以下组合来制备维持介质:神经巴基培养基（97%）、0.5 mM商业获得的谷氨酰胺样品、B27无血清补充剂（2%）和青霉素/链霉素（1%）。将组件组合成各自的比率，并在无菌条件下在发动机罩内执行该过程。确保所有部件都新鲜准备。

2. 准备盖玻片

1. 取一个直径为 12 mm 的圆形玻璃盖玻片，并将其浸泡在 1 M 盐酸 （HCl） 中 4 小时。
2. 使用一对钳子将盖玻片转移到蒸馏水中，轻轻旋转以完全去除酸。
3. 将洗过的盖玻片转移到含有 100% 乙醇的烧杯中进行额外一轮清洁。
4. 在使用盖玻片之前，将它们放在纸巾上，在层罩中干燥。

3. 为神经元培养制备多D-莱辛涂层板

1. 取两个 24 孔板:一个用于高密度电镀，另一个用于低密度电镀。仅在层罩内打开无菌包。
2. 转移 24 个孔板中的 12 mm 无菌玻璃盖玻片。
3. 将 300 μL 的 PDL 溶液（0.1 mg/mL 在去离子水中）倒入每口井中，使其完全覆盖盖玻片表面。
4. 用铝箔包裹板材，防止干燥，并放在CO2孵化器中过夜。
5. 第二天（电镀前），吸出PDL溶液，用300μL无菌脱离子水正确清洗两到三次。
6. 加入200 μL新鲜制备的电镀介质，将板体返回到培养箱，直到电镀。

4. 胎儿的切除和斩首

注:在高压灭菌器中，在121°C（15 psi）下，用铝箔包装的所有手术器械消毒30分钟。这包括一对钝端剪刀、钳子、细钳子、两把细剪刀和一把动脉钳，用于整个过程。

1. 对于生成神经元和神经球，使用时间怀孕的斯普拉格道利大鼠，用阴道塞检测标记为 E0 标记这一天。
   注: 必须在 E14-E16 之间执行区域性。
2. 在养殖日，将无菌玻璃石化板放在冰上，用冷汉克的平衡盐溶液（HBSS）填充。
3. 麻醉E14-E16怀孕大鼠，注射90毫克氯胺酮/千克体重和10毫克木氨酸/千克的腹肌内（即p.），然后通过进行宫颈脱位来牺牲。
   注:大鼠也可以安乐死过量的五巴比妥或过量氯胺酮与木兰辛或安定。
4. 通过喷洒 70% 乙醇对大坝的腹部进行消毒，并使用无菌钳和一把钝端剪刀在腹部区域进行 V 形切口。
5. 用冷HBSS溶液小心地在Petri板上取胚胎囊。
   注意:不要使用与皮肤相同的钳子和剪刀，因为这将污染内脏器官。对内脏使用另一套剪刀/钳子。
6. 将胚胎从新鲜、寒冷的哈佛心囊中取走。
7. 用无菌剪刀头斩首。

5. 去除大脑和用海马切除皮层

1. 出发前，用冷、无菌的 HBSS 填充 90 mm 无菌培养皿。
2. 使用无菌、钝端敷料钳将头转移到无菌的盘子中。
3. 在立体显微镜下，用无菌、锯齿状的钳子将头部从鼻孔区域抱住，并通过切开皮肤和头骨来取出大脑。
4. 在 HBSS 溶液中以同样的方式收集所有胚胎大脑。
5. 通过按住脑干从半球和中脑去除所有脑筋。
6. 小心地去除完整的半球，类似于蘑菇帽，包含海马和皮层。
7. 在含有10 mL解结介质的15 mL锥形管中收集包含皮层和完整海马的半球。

6. 皮质和海马组织分裂为单神经元

1. 允许收集的组织稳定下来，吸出分离介质，在其中留下5%-10%的介质。
2. 向组织添加10 mL的新鲜解散介质，并重复步骤6.1两次。
3. 加入4.5 mL的解毒介质和0.5 mL的0.25%（1x）胰蛋白酶EDTA（乙烯二胺四乙酸酯）溶液。
4. 将组织保持在37°C的培养箱中20分钟，以便继续消化。
5. 吸气介质，连续向消化组织添加10 mL解散和电镀介质。
6. 允许消化的组织稳定下来，吸出分离介质。加入 2.5 mL 的电镀介质，倒入 90 mm 无菌盘的底座中。
7. 使用 1，000 μL 移液器尖端对盘角底的消化组织进行三聚，以占据最小体积。
8. 通过获得细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器，不包括任何组织块。
9. 使用锥蓝色染料排除方法确定活细胞的密度，并计算自动细胞计数器中的细胞数。
   1. 对于试青染料排除方法，采用10μL的细胞悬浮液和10μL的0.4%锥体蓝色染色，彻底混合，并在一次性室幻灯片的两个封闭腔室之一中加入10μL的混合物。
   2. 将含有混合物的幻灯片插入细胞计数器并获取读数。
      注:锥形蓝色染料排除方法基于以下原则:活细胞（由于其完整的膜）将排除锥形蓝色染料，因此将显示一个清晰的细胞质，与一个不可行的细胞相比，它很容易占据锥形蓝色，并在颜色¹⁵.
10. 稀释在两个单独管中，每个电镀介质含有30 mL，用于高密度的1.5 x 10⁵个细胞/mL和20，000个单元/mL的低密度取用的细胞数量。
11. 从每个孔中吸出先前添加的电镀介质，并将分散在每个孔的电镀介质中的500μL电池板。
12. 之后，在37°C和5%CO₂下将板返回到培养箱4小时。
13. 电镀后4小时在显微镜下检查细胞是否粘附。
14. 如果两个板中的细胞适当粘附，用500μL的新鲜维持介质替换每个孔中的培养基，并在37°C下孵育。
15. 通过每周2次改变维持培养基，培养这些神经元在低密度下生长30天。
16. 将高密度镀电神经元转移到超低附着板，使神经球在相同的维持介质中培养。
17. 通过用重要的标记物对神经元和神经球进行免疫染色，从而描述神经元和神经球。对于免疫细胞化学，首先在板上使用4%甲醛修复细胞/神经球30分钟，然后用0.1%非离子洗涤剂渗透细胞10分钟。
18. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的原抗体（抗Tuj1、GFAP、O4、tau）和神经球（抗Nestin、GFAP、Tuj1），并在4°C16孵育过夜。
    注:Tuj1（III类+-图布林）和tau是主要神经元的正标记，而GFAP（胶质纤维酸性蛋白）和O4（寡核苷酸标记物）是主要神经元^的负标记17，18。在神经球的情况下，Tuj1，GFAP和Nestin都作为积极标记19，20。
19. 第二天，用PBS清洗细胞一次或两次，并在PBS中加入适当的二级抗体，在RT浓度为1:600时，2小时。
    注:根据添加的主要抗体的宿主种类选择抗小鼠或抗兔子二级抗体。应记住，二级抗体必须与适合荧光显微镜用途的荧光衍生物结合使用。
20. 用PBS再次清洗细胞一次或两次。
    1. 使用 Hoechst 33258（1 mg/mL 在去离子水中的库存溶液）对细胞进行核染色。从库存溶液中制备 0.1% 的 Hoechst 溶液，并将其添加到细胞中。
    2. 用0.1%的Hoechst溶液孵育细胞30分钟，然后用PBS再次清洗。
21. 在幻灯片上添加 20 μL PBS（或安装介质），并缓慢地将包含染色细胞的盖玻片安装在包含 PBS 的幻灯片区域上。用二丁基苯甲酸聚苯乙烯二甲苯 （DPX） 密封盖玻片的边缘。
22. 以 10 倍和 40 倍的放大倍率在显微镜下对固定细胞进行成像。

结果

在该协议中，阐明了一种简单的策略，即从两个不同的神经筛选平台获得可变细胞电镀密度。图1A，B分别说明了高密度和低密度电镀细胞中神经元电镀4小时后细胞的依从性。在观察如图1所示的神经元的正确附着性时，电镀介质被每个井中的维护介质所取代，从而在37°C时返回到培养箱。在高密度镀层神经元中观察?...

讨论

该协议描述了如何通过改变主神经元的细胞电镀密度，获得两个可变神经元平台。虽然这是一个简单的方法，但必须仔细执行每个步骤才能达到预期的结果。其他以前的方法要么报告长期原发神经元培养或神经圈培养。大多数主要神经元培养协议都涉及海马神经元的培养3-5周，但大多数已经失败，因为神经元死亡和枯萎，由于失去连接。该协议的另一个优点是，神经元可以培养，而无需任何胶质?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti- Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-glucose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluorescence Microscope	Olympus	IX83 Model
Formaldehyde	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Supplement	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Horse Serum	HiMedia	RM10674
Hydrochloric Acid	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Microscope	Dewinter	Victory Model
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)	BD Falcon	353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Millipore	A.003.E
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic	Merck	MI6M562401
Sodium Chloride	Qualigem	15918
Sodium Phosphate Dibasic	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Model
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypan Blue Solution	Gibco	15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072