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摘要

生物信息学管道，即miRDeep-P2（简称miRDP2），具有更新的植物miRNA标准和经过全面检查的算法，可以准确有效地分析植物中的微RNA转录，特别是对于具有复杂和大型基因组的物种。

摘要

微RNA （miRNA） 是 20- 24 核苷酸 （nt） 内源性小RNA （sRNA）， 广泛存在于植物和动物中，在转录后水平上调节基因表达起着有效作用。过去十年中，用新一代测序 （NGS） 方法测序 sRNA 库被广泛用于识别和分析 miRNA 转录体，从而迅速增加了 miRNA 发现。然而，由于测序sRNA库的深度增加以及植物基因组的大小和复杂性，植物miRNA注释中出现了两个主要挑战。首先，许多其他类型的sRNA，特别是来自sRNA库的短干扰RNA（siRNA），被许多计算工具错误地批号为miRNA。其次，在具有庞大和复杂基因组的植物物种中分析miRNA转录体，这成为一个极其耗时的过程。为了克服这些挑战，我们最近通过采用新的过滤策略、彻底检查评分算法和合并新更新的植物 miRNA，将 miRDeep-P（miRNA 转录组分析的常用工具）升级到 miRDeep-P2（简称 miRDP2）注释条件。我们在基因组复杂性增加的五种代表性植物（包括阿拉伯拟南芥、水稻、番茄、玉米和小麦）中针对测序sRNA种群测试了miRDP2。结果表明，miRDP2处理这些任务的效率非常高。此外，miRDP2 在灵敏度和准确性方面优于其他预测工具。综合起来，我们的研究结果证明miRDP2是分析植物miRNA转录酶的快速和准确的工具，因此是帮助社区更好地在植物中对miRNA进行分文的有用工具。

引言

过去二十年来生物学中最令人兴奋的发现之一是sRNA物种在调节基因组1的不同功能中的增殖作用。特别是，miRNA在真核生物中构成20-24ntsRNA的重要类别，主要在转录后水平上作为重要的基因调控器，在整个生命周期发育阶段以及刺激和应激反应2、3中发挥作用。在植物中，miRNA产生于称为pri-miRNA的主要转录本，通常由RNA聚合酶II转录为单个转录单元4、5。由进化保存的细胞机械（动物中的Drosha RNase III，植物中的DICER样）处理，pri-miRNA被切除到直接的miRNA前体，前miRNA，其中包含形成分子内茎环结构的序列6，7。然后，将预miRNA加工成双链中间体，即miRNA双工，由功能链、成熟miRNA和功能性较低的伙伴miRNA®2、8组成。在加载到RNA诱导沉默复合物（RISC）后，成熟的miRNA可以基于序列互补性识别其mRNA靶点，导致负调节功能2，8。miRNA要么破坏目标成绩单，要么阻止目标翻译，但前者在植物8，9中占主导地位。

自从偶然发现线虫10、11号线虫中第一个miRNA以来，许多研究都致力于miRNA鉴定及其功能分析，特别是在NGS方法的提供之后。NGS方法的广泛应用极大地促进了计算工具的利用，这些工具旨在捕捉miRNA的独特特性，如前体的干环结构及其在成熟miRNA和miRNA®上序列读取的优先积累。因此，研究人员在识别不同物种的miRNA方面取得了显著成功。基于先前描述的概率模型12，我们开发了miRDeep-P13，这是从NGS数据中发现植物miRNA的第一个计算工具。miRDeep-P是专门旨在征服解码植物miRNA的挑战，具有更多的可变前体长度和大型的副体家族13，14，15。发布后，这个程序已被下载数千次，并用于在40多个植物物种16中对miRNA转录子进行批过。在基于NGS的工具（如miRDeep-P）的推动下，公共miRNA存储库miRBase17中注册的miRNA数量急剧增加，目前托管的miRNA项目超过38，000个（版本22.1），而2008年仅为500个miRNA项目（版本2.0）。

然而，植物miRNA注释带来了两个新的挑战。首先，高误报率严重影响了植物miRNA注释16、19的质量，原因如下:1）由于缺乏严格的miRNA注释标准，NGS sRNA库中的内源性短干扰RNA（siRNA）被错误地注释为miRNA;2） 对于没有先验miRNA信息的物种，根据NGS数据预测的假阳性很难消除。以miRBase为例，Taylor等人20号在公共存储库21（第21版）中发现了三分之一的植物miRNA条目，缺乏令人信服的支持证据，甚至四分之三的植物miRNA家族也值得怀疑。其次，它成为一个极其耗时的过程，预测植物miRNA与大和复杂的基因组16。为了克服这些挑战，我们更新了 miRDeep-P，增加了新的过滤策略，彻底修改了评分算法，集成了植物 miRNA 注释的新标准，并发布了新版本 miRDP2。此外，我们使用 NGS sRNA 数据集测试了 miRDP2，其基因组大小逐渐增大:阿拉伯拉多普西、大米、番茄、玉米和小麦。与其他五种广泛使用的工具及其旧版本相比，miRDP2 分析了这些 sRNA 数据，并更快地分析 miRNA 转录，提高了准确性和灵敏度。

miRDP2 封装的内容
miRDP2 包由六个文档化的 Perl 脚本组成，这些脚本应由准备好的 bash 脚本按顺序运行。在六个脚本中，三个（convert_bowtie_to_blastpl、filter_alignments.pl和excise_candidate.pl）是从miRDeep-P继承的。 其他脚本是从原始版本修改的。六个脚本的函数如下所述:

preprocess_reads.pl筛选输入读取，包括太长或太短的读取（<19 nt 或 >25 nt），读取与 Rfam ncRNA 序列相关，以及读取的 RPM（读取百万）小于 5。然后，该脚本检索与已知 miRNA 成熟序列相关的读取。输入文件是 FASTA/FASTQ 格式的原始读取和 bowtie2 输出的读取映射到 miRNA 和 ncRNA 序列。

计算 RPM 的公式如下:

figure-introduction-2840

convert_bowtie_to_blast.pl将蝴蝶结格式更改为 BLAST 解析格式。BLAST 解析格式是从标准 NCBI BLAST 输出格式派生的自定义表格分隔格式。

filter_alignments.pl过滤深度测序读取到基因组的对齐方式。它过滤部分对齐以及多对线读取（用户指定的频率截止）。基本输入是 BLAST 解析格式的文件。

excise_candidate.pl使用对齐的读取作为指南，从参考序列中剪切出潜在的前体序列。基本输入是 BLAST 解析格式的文件和 FASTA 文件。输出是 FASTA 格式的所有潜在前体序列。

mod-miRDP.pl需要两个输入文件，签名文件和结构文件，通过改变评分系统与植物特定参数从核心miRDeep-P算法修改。输入文件是点括号前体结构文件和读取分发签名文件。

mod-rm_redundant_meet_plant.pl需要三个输入文件:mod-miRDP.pl生成的chromosome_length、前体和original_prediction。它生成两个输出文件，非冗余预测文件和预测文件筛选新更新的工厂 miRNA 标准。有关输出文件格式的详细信息，请见第 1.4 节。

研究方案

1. 安装和测试

  1. 下载所需的依赖项:鲍蒂222和RNAfold23。建议使用已编译的包。
    1. 下载Bowtie2，一个读取映射工具，从它的家庭网站（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）。
    2. 下载RNAfold，维也纳包的工具，用于预测RNA二次结构，从http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/。
    3. 在安装 miRDP2 之前，请确保正确安装这两个依赖项，并自定义 bash 环境文件（例如 .bashrc）以为这两个依赖项设置正确的 PATH。
      注:其他映射工具，如鲍蒂24也适合miRDP2;鲍蒂或鲍蒂2可在1.1.3版后使用。
  2. 要下载 miRDP2 包，请转到https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/latest_version/并获取 tarball 文件。
  3. 在安装 miRDP2 之前，请确保 Perl 位于 PATH 中。要安装 miRDP2，请将下载的 tarball 文件的所有内容提取到一个文件夹中（命令行，如 1.4.2 中），然后将文件夹路径设置为 PATH。
    注: 建议使用至少 8 GB RAM 和 100 GB 存储的计算机或计算节点运行 miRDP2。
  4. 测试 MiRDP2 管道。
    1. 要测试 miRDP2 是否已正确安装，请使用测试数据和https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/中找到的预期输出。测试数据包含一个格式化的GSM测序文件和一个阿拉伯拉多普西斯塔利亚纳基因组文件。
    2. 将所有下载的文件移动到当前工作目录:
      mv miRDP2-v_.tar.gz TestData.tar.gz ncRNA_rfam.tar.gz
      cd
    3. 提取压缩的焦油球文件:
      tar _xvzf miRDP2-v_.tar.gz
      tar @xvzf 测试数据.tar.gz
      塔尔·xvzf ncRNA_rfam.tar.gz
    4. 建立阿拉伯基因组参考索引:
      bowtie2-build -f ./测试数据/TAIR10_genome.fa ./测试数据/TAIR10_genome
    5. 构建 ncRNA 参考索引:
      bowtie2-build -f ./ncRNA_rfam.fa ./1.1.3/脚本/索引/rfam_index
    6. 运行 miRDP2 管道:
      bash ./1.1.3/miRDP2-v1.1.3_pipeline.bash @g /testData/TAIR10_genome.fa -i ./ 测试数据/TAIR 10_genome +f /测试数据/GSM2094927.fa _o .
      注: 使用的 Linux 命令采用粗体和斜体字体，命令行选项以斜体显示。*指示 miRDP2 的版本（当前版本为 1.1.3）。bowtie2-build 命令大约需要 10 分钟，miRDP2 管道应在几分钟内完成
  5. 检查测试输出。
    1. 请注意，名为"GSM2094927-15-0-10"的文件夹在中自动生成，其中包含所有中间文件和结果。
    2. 检查标签分隔输出文件 GSM2094927-15-0-10_filter_P_prediction，预测 miRNA 的最终输出，包含指示染色体 ID、链方向、代表性读取 ID、前体 ID、成熟 miRNA 位置、前体）的列位置、成熟序列和前体序列。请注意从此文件派生的附加床文件，以便进一步分析。
    3. 检查文件"progress_log"，其中提供有关已完成的步骤的信息，以及包含程序输出和警告的文件"script_log"和"script_err"。
      注意:目前，我们已经在两个Linux平台上测试了miRDP2，包括集群服务器上的CentOS版本6.5和PC Windows系统上的Cygwin 2.6.0，miRDP2应该在支持Perl的类似系统上工作。

2. 识别新颖的 miRNA

  1. 在运行管道之前，请确保将输入读取预处理为正确的格式。
    注: miRDP2 的新版本 1.1.3 可以接受原始 FASTQ 格式文件作为输入，尽管格式化读取的过程与以前的版本一样执行。
    1. 首先，从深度排序读取的 5' 和 3' 端卸下适配器（如果存在）。
    2. 其次，将深度排序读取解析为 FASTA 格式。
    3. 第三，删除冗余，以便使用单个且唯一的 FASTA 条目表示具有相同序列的读取。
    4. 最后，确保所有 FASTA 标识符都是唯一的。每个序列标识符必须以"_x"和整数结尾，指示在深度排序数据集中检索到的精确序列的副本数。确保唯一 FASTA 标识符的一种方法是在 ID 中包含一个正在运行的数字。有关参考，请参阅测试数据（https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/） 中的文件 GSM2094927.fa。
    5. 有关正确格式化的读取示例，请参阅以下内容:

      >read0_x29909
      TTGGGAAGGGGCTCTA
      >read1_x36974
      TTCCACCTCTCTTTG
      >read2_x32635
      TTCCACCTCTCTTTTT
  2. 生成参考索引。
    1. 对于基因组参考，为了节省时间，从iGenomes网站（https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html）下载Bowtie2索引文件，如果感兴趣的物种的基因组序列已经编制索引。否则，用户索引引用序列并保留索引文件一段时间，直到项目完成，因为基因组序列可能需要重新编制索引。有关如何索引基因组参考的详细信息包含在 bowtie2 手册 （http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml） 中。
    2. 还需要另一个非miRNA ncRNA索引来过滤其他非编码RNA片段中的噪声序列。该文件是来自Rfam的主要ncRNA序列的集合，包括rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA。要构建此索引，请参阅第 1.4 部分，因为索引应正确放置和命名，即 /脚本/索引/rfam_index。
  3. 运行 miRDP2。
    1. 要使用 miRDP2 从深度测序数据中检测新的 miRNA，请使用包中的 bash 脚本启动分析管道（可以在步骤 1.4 中找到示例）:
      //////////_pipeline-o >-f
      其中 * 指示管道 bash 脚本的版本。有三个参数可以修改:1） 读取可以映射到的不同位置的数量，2） 运行 bowtie2 的不匹配数，3） RPM 阈值（每百万读取）。分别使用 +L、-M 和 +R 选项修改这些选项。第 3.1 节对此作了详细说明。
  4. 检查 miRDP2 输出。
    1. 请注意，输出文件夹将在 下自动生成，并命名为"-15-0-10";最后 3 个数字分别指示参数 1、2 和 3 的值（本例中为默认值）。文件 _filter_P_prediction包含满足新更新的植物 miRNA 注释标准的最终预测 miRNA 的信息。有关输出文件格式的详细信息，请放在第 1.4 部分中。

3. 使用 miRDP2 进行修改和警告

  1. 可修改的参数
    1. 使用"-L"选项设置读取可映射到多少位置的限制（参数 1）。读取映射到太多站点可能与重复序列相关联，并且不太可能与 miRNA 相关联。默认设置为 15。对于特定物种，如果有具有许多成员的miRNA家族，第一个参数可以手动增加以适应基因组景观。
    2. 使用"-M"选项设置弓形（参数 2）允许的不匹配。默认设置为 0。
    3. 使用"-R"选项设置可能与成熟 miRNA 相对应的读取阈值（参数 3）。为了减少时间消耗和误报，请按 RPM 筛选读取。只有超过一定 RPM 阈值的读取才能表示 miRNA 的成熟序列，而不是背景噪声，并将保留以进行进一步分析。默认设置为 10 RPM。
    4. 请注意，更改这些参数可能会影响性能和时间消耗。通常，增加参数 1 和参数 2 以及减少参数 3 将生成不太严格的结果和更长的运行时间，反之亦然。
  2. 冗余和 miRNA*
    1. 请注意，miRDP2 的输出 miRNA 可能与已知的 miRNA 不同。我们发现，这主要是由于两个原因之一:成熟miRNA的异质性或miRNA和miRNA®的相对丰度。我们发现，这不会影响前体的最佳长度选择和已知miRNA基因的轮廓。

结果

本文描述的miRNA注释管道miRDP2适用于5个基因组长度逐渐增加的植物物种的10个公共sRNA-seq库，包括阿拉伯拟南芥、Oryza sativa（大米）、索兰姆碱化（番茄）、Zea Mays（玉米）和三联体（小麦）（图1A）。总体而言，对于每个物种，来自不同组织的2个代表性sRNA库（折叠成唯一的读取，协议部分的细节）及其索引基因组序列作为两个?...

讨论

随着NGS的出现，从越来越多的sRNA测序数据中发现了大量的miRNA位点，这些物种的数量不断增加，不同的物种29，30。在集中式社区数据库miRBase21中，沉积的miRNA项目在过去十年中增加了近100倍。然而，与动物中的miRNA相比，植物miRNA具有许多独特的特征，使得识别/注释更加复杂13，14。

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了北京农林科学院（KJCX201917、KJCX20180425和KJCX20180204）对XY和中国国家自然科学基金（31621001）的LL支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Computer/computing nodeN/AN/APerl is required; at least 8 GB RAM and 100 GB storage are recommended

参考文献

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